Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Ультраструктура миокарда в норме и патологии 13
1.1. Ультраструктурная организация кардиомиоцитов 13
1.2. Ультраструктурная организация эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда 21
1.3. Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда при патологии 27
1.4. Экспериментальное моделирование механического повреждения сердца 38
1.5. Резюме 45
Собственные исследования
Глава 2. Материал и методы исследования 46
2.1. Объект исследования 46
2.2. Подготовка объектов исследования для трансмиссионной электронной микроскопии 48
2.3. Исследование миокарда при помощи метода ультраструктурного стереологического анализа 49
2.4. Последовательность выполнения работы 51
Глава 3. Электрокардиографические нарушения при экспериментальном моделировании механического повреждения сердца 52
Глава 4. Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов при моделировании механического повреждения сердца
Глава 5. Ультраструктурные изменения эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда при моделировании механического повреждения сердца 72
Глава 6. Ультраструктурные особенности кардиомиоцитов и эндотелиоцитов миокарда человека при механическомповреждении сердца 84
Заключение 93
Выводы 100
Практические рекомендации 102
Список литературы
- Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда при патологии
- Экспериментальное моделирование механического повреждения сердца
- Подготовка объектов исследования для трансмиссионной электронной микроскопии
- Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов при моделировании механического повреждения сердца
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время наиболее изученным является патоморфоге-нез ишемических повреждений миокарда в результате развития коронарного атеросклероза, чему посвящено большое количество исследований (Непомнящих Л.М., 1981, 1991, 1998; Пауков В.С. и др., 1982; Кактурский Л.В., 2000; Мазур Н.А., 2004; Зайратьянц О.В. и др., 2014; Anversa P. et al., 1998; Becker C.R., 2002; Rubart M. et al., 2005; Schoenenberger A.W. et al., 2009; Fu L.W. et al., 2010; Thygen K. et al., 2012; Kumar V. et al., 2013). Большое внимание уделяется также токсическому повреждению мышцы сердца вследствие хронической алкогольной и наркотической интоксикации, применения кардиотоксических лекарственных препаратов (Кактурский Л.В., 2002, 2009; Пауков В.С., 2004; Лушникова Е.Л. и др., 2004, 2009; Бородин С.А., 2006; Резник А.Г., 2009; Кузнецов Е.В., 2013; Ruttenber A.J. et al., 1990; Broers B., 2002).
В то же время научно-технический прогресс привел к возникновению «травматической пандемии». По данным ВОЗ, смертность от механических повреждений занимает третье место среди всех летальных исходов и выходит на первое место у лиц, погибших в возрасте моложе 40 лет, достигая 80% (Гуманенко Е.К. и др., 2000). Высока распространенность травм жизненно важных областей тела, при этом механические повреждения груди преобладают над травмами головы (16,5 – 21,0%) и живота (6,5 – 31,3%), составляя 18,0 – 50,4% (Багненко С.Ф. и др., 2000).
Травмы органов грудной полости относятся к одним из самых тяжелых видов механических повреждений и сопровождаются высокой смертностью. Чрезвычайно опасными при тупой травме груди являются механические повреждения сердца (Борисенко А.П., 1990; Юрасов В.В. и др., 2012; Fegheli N.T. et al., 1995; Bansal M.K. et al., 2005). Они образуются в результате дорожно-транспортных происшествий (удар наружными или внутренними частями автомобиля), падений с высоты, криминальных обстоятельств (удар тупым предметом с ограниченной поверхностью соударения), а также при спортивных состязаниях (кикбоксинг, карате, регби, восточные единоборства) (Орджоникидзе З.Г. и др., 2008; Paone R.F. et al., 1993; Kaye P. et al., 2002). Закрытая травма груди с ушибом сердца характеризуется тяжелым течением за счет раннего развития нарушений ритма сердца с последующей острой сердечной недостаточностью (Ступницкий А.А. и др., 1994; Жиго П.Г. и др., 2004).
Большое количество работ по травме сердца посвящено клиническим аспектам диагностики повреждений этого органа (Скородумова Е.А. и др., 2000; Кудряшова Л.Т., 2004; Стажадзе Л.Л. и др., 2004; Лачаева М.А., 2006; Хижняк А.А. и др., 2007). Морфологические исследования механического повреждения сердца продолжают оставаться немногочисленными, большинство таких работ выполнено на макроскопическом и светооптиче-ском уровнях (Соседко Ю.И., 1996; Капустин А.В., 2000; Савченко С.В., 2002; Ковалева М.А., 2006; Кошляк Д.А., 2008; Elie M.-C., 2006). Вопросы оценки ультраструктурных изменений кардиомиоцитов при механическом повреждении сердца остаются недостаточно изученными (Новоселов В.П. и др., 2010). Морфологическим изменениям эндотелиоцитов при механическом повреждении миокарда посвящены единичные работы, тогда как эндотелий микроциркуляторного русла является структурным компонентом миокарда, тонко реагирующим на различные патологические воздействия (Волков А.М., 2003; Шахламов В.А., 2007; Cines D.B. et al., 1998; Bonetti P. et al., 2003).
В связи с вышеизложенным актуальным является изучение ультраструктурных изменений кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда, играющих важную роль в механизмах развития острой сократительной недостаточности миокарда, при механическом повреждении сердца.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время нарушения ультраструктуры кардиомиоцитов и эндотелиоцитов капилляров миокарда при механическом
повреждении сердца остаются недостаточно изученными. По-прежнему не определена роль ультраструктурных изменений кардиомиоцитов и эндотелиоцитов в механизмах развития острой сердечной недостаточности при этом виде повреждения сердца. Идентификация патогенетического значения этих нарушений позволит улучшить диагностику механического поражения сердца.
Цель исследования – изучить характер и выраженность ультраструктурных изменений кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда при его механическом повреждении различной степени тяжести на экспериментальном и аутопсийном материале.
Задачи исследования:
-
Установить характер электрокардиографических нарушений сердечной деятельности у лабораторных животных (крыс Вистар) при моделировании механического повреждения сердца.
-
Изучить характер и выраженность ультраструктурных изменений кардиомиоцитов желудочков сердца при его механическом повреждении различной степени тяжести у экспериментальных животных.
-
Изучить характер и выраженность ультраструктурных изменений эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда желудочков при механическом повреждении сердца различной степени тяжести у экспериментальных животных.
-
Изучить характер и выраженность ультраструктурных изменений кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных капилляров желудочков сердца при тяжелом механическом повреждении сердца у смертельно травмированных людей.
Научная новизна. Впервые, по данным ультраструктурного исследования миокарда, выявлены значительные внутриклеточные изменения кардиомиоцитов после нанесения механической травмы сердца экспериментальным животным и у смертельно травмированных людей. Показано, что к основным ультраструктурным изменениям кардиомиоци-тов при механической травме сердца относятся очаговые деструктивные изменения митохондрий, очаговые литические изменения миофибриллярных пучков, выраженные расширения везикул агранулярной саркоплазматическй сети.
Впервые на основании ультраструктурного стереологического анализа установлено, что для внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов при механической травме сердца характерно значительное увеличение объемной плотности митохондрий. Выраженность качественных и количественных ультраструктурных изменений кардиомиоцитов определяется тяжестью механической травмы сердца. В кардиомиоцитах левого желудочка сердца выраженность ультраструктурных изменений и внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов больше, чем в кардиомиоцитах правого желудочка.
Впервые при моделировании механического повреждения сердца средней тяжести выявлены характерные для данного состояния электрокардиографические изменения (синусовая брадикардия, экстрасистолия, синоатриальная блокада и остановка синусового узла с возникновением атриовентрикулярного ритма, блокада ножек пучка Гиса и полная атри-овентрикулярная блокада). Показано, что при механическом повреждении сердца тяжелой степени развиваются синусовая брадикардия, синусовая тахикардия, блокада ножек пучка Гиса, блокада синусового узла с развитием атриовентрикулярного ритма и идиовентрику-лярного ритма, переходящих в асистолию.
Впервые при экспериментальном механическом повреждении сердца показано, что в эндотелиоцитах кровеносных капилляров миокарда правого и левого желудочков возрастает объемная плотность митохондрий и микропиноцитозных везикул, что является отражением изменений функциональной активности эндотелиоцитов и обусловливает изменения транскапиллярного обмена. Показана однотипность ультраструктурных изменений митохондрий в эндотелиальных клетках и кардиомиоцитах, что свидетельствует об общности механизмов их повреждения.
Впервые при тяжелом механическом повреждении сердца у смертельно травмированных людей описан характер внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов правого и левого желудочков (увеличение объемных плотностей митохондрий, саркоплазматиче-ской сети и лизосом). Установлено, что для внутриклеточной реорганизации эндотелио-цитов кровеносных капилляров в миокарде желудочков характерно увеличение объемных плотностей митохондрий и микропиноцитозных везикул. Показано, что ультраструктурные изменения кардиомиоцитов и эндотелиоцитов в миокарде людей, пострадавших от механического повреждения сердца, и у лабораторных животных при моделировании механической травмы сердца носят сходный характер.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые знания о характере и выраженности ультраструктурных изменений кардиомиоцитов и эндотелиоци-тов кровеносных капилляров правого и левого желудочков сердца при его механической травме. Выполненное ультраструктурное исследование миокарда позволило выявить комплекс структурных изменений кардиомиоцитов, играющих важную роль в развитии острой сократительной недостаточности мышцы сердца при механическом повреждении этого органа.
Разработана модель механического повреждения сердца различной степени тяжести, которая может быть использована при разработке средств защиты и коррекции повреждений миокарда после механической травмы сердца. Результаты проведенных исследований могут быть также использованы для разработки критериев диагностики механического повреждения сердца.
Методология и методы исследования. В ходе выполнения диссертационного исследования использованы общенаучные, специальные (частнонаучные) и общелогические методы научного познания. Общенаучные методы включали эксперимент, наблюдение, описание, измерение, сравнение. Специальные методы основаны на применении современных принципов морфологической оценки патологических процессов и обработке полученных данных. Из общелогических приемов научного мышления применялись: анализ и синтез, индукция и дедукция, аналогия. Объекты исследования – кардиомиоциты и эн-дотелиоциты миокарда лабораторных животных и человека. Предмет исследования – ультраструктурные изменения клеток миокарда после механического воздействия на сердце.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в учебную и научно-исследовательскую работу кафедр патологической анатомии и судебной медицины ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Механическое повреждение сердца у экспериментальных животных сопровождается характерными аритмическими изменениями в виде синусовой брадикардии, желудочковой экстрасистолии, различных вариантов нарушений сердечной проводимости с переходом в асистолию.
-
При механическом повреждении сердца у экспериментальных животных для внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов характерно увеличение объемной плотности митохондрий и саркоплазматической сети при уменьшении объемной плотности миофиб-рилл. Выраженность внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов определяется тяжестью механической травмы.
-
Механическое повреждение сердца сопровождается изменениями ультраструктурной организации митохондрий и микропиноцитозных везикул эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда, свидетельствующими о нарушениях транспортной функции эндотелиальных клеток.
-
Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда при механическом повреждении сердца у лабораторных животных и у человека носят однотипный характер, что подтверждает целесообразность использования
экспериментальной модели для проведения исследований по механическому повреждению сердца в виде его ушиба.
Степень достоверности и обоснованности результатов. Достоверность полученных результатов обеспечена достаточным объемом материала, использованием современных методов морфологического анализа (электронная микроскопия, стереология) и статистической обработки. Сформулированные научные положения и выводы основаны на результатах собственных исследований и не носят характера умозрительных заключений.
Апробация результатов работы. Основные положения диссертации доложены на заседании сотрудников кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ (Новосибирск, 2015); заседании сотрудников патологоанатомического отдела ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина» МЗ РФ (Новосибирск, 2015); итоговой конференции Межрегиональной ассоциации «Судебные медики Сибири» (2016); итоговой научно-практической конференции молодых ученых «Авиценна» ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ (Новосибирск, 2011, 2013, 2014, 2015, 2016); совместном заседании сотрудников кафедры судебной медицины ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ и работников Новосибирского областного клинического бюро судебно-медицинской экспертизы (Новосибирск, 2016).
Личное участие автора. Обзор литературы, проведение экспериментов, забор материала и его обработка, анализ и интерпретация результатов, статистическая обработка полученных данных выполнены лично автором.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ, из них 5 – в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных результатов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материала и методов исследования, четырех глав с результатами собственных исследований, заключения (обсуждения полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 363 источника, в том числе 231 отечественный и 132 зарубежных. Диссертация содержит 16 таблиц, 26 рисунков (электроно-граммы).
Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных капилляров миокарда при патологии
Сердечная мышца состоит из компактно соединенных друг с другом ана-стомозирующих поперечнополосатых миоцитов, которые соединены по типу конец в конец, формируя мышечные волокна (Хэм А., Кормак Д., 1982; Быков В.Л., 2002; Farrell M.J. et al., 2001). Сердечные миоциты в зависимости от анатомического положения, подразделяют на предсердные и желудочковые, которые, в свою очередь, учитывая особенности физиологической деятельности, делятся на сократительные и проводящие. В предсердиях находятся секреторные кардиомиоциты (Шмидт Р. и др., 1996; Knaapen M.W. et al., 1997).
Кардиомиоциты в сердце человека чаще имеют одно ядро, реже – два ядра, которые располагаются вдоль центральной оси сердечного волокна (Джандиери К.Н., 1987; Павлович Е.Р., 1998; Афанасьев Ю.И. и др., 1999; Katz A.M., 2000). Сердечные миоциты покрыты базальной мембраной, между мышечными волокнами имеются прослойки рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, а также нервы и сосуды – артерии, вены, капилляры (Швалев В.Н., 1992; Завалеева С.М., 1996; Габченко А.К., 2008; Noble D., 2002; Spotnitz H., 2000; Franco D. et al., 2006).
Кардиомиоциты являются структурно-функциональной единицей миокарда, они имеют цилиндрическую форму, диаметр клеток около 15 – 20 мкм (Шперлинг И.Д. и др., 1984; Катинас Г.С. и др., 1985; Соколов В.В., 1994; Collinge M. et al., 1992).
Таким образом, кардиомиоциты представляют собой группу высоко-дифференцированных клеток, специализированных для выполнения физиологической функций сокращения, образования и проведения сократительных импульсов. Кроме того, сердечные миоциты участвуют в синтезе и секреции биологически активных веществ.
Сарколемма представляет плазматическую мембрану миоцитов, толщиной 10 нм, а также поверхностное покрытие, толщиной 70 нм. Плазматическая мембрана имеет встроенные в ее структуру каналы для транспорта катионов и анионов, она содержит рецепторы, активно реагирующие на различные биологически активные вещества такие, как гормоны, а также фармакологические веществ (Ескунов П.Н., 1993; Репин В.С. и др., 1998; Hunter P.J. et al., 1998). Гликокаликс (поверхностное покрытие) кардиомиоцита имеет сложную биохимическую структуру и состоит из гликопротеинов, гликоли-пидов и полисахаридов (Быков В.Л., 1997; Хышикутев Б.С., 2003; Ferrari M.B. et al., 1998).
Сарколемма кардиомиоцитов состоит из периферической – поверхностно расположенной части и внутренней, образующей систему поперечно (Т-система) и продольно (L-система) ориентированных канальцев (Архипен-ко В.И. и др., 1982; Смирнов В.П. и др., 1990; Сперелакис Н., 1990; Мархасин B.C. и др., 1994; Кольман Я. и др., 2000; Шубич М.Г. и др., 2005; Geeves M.A. et al., 1999; Gordon A.M. et al., 2000; Hein S. et al., 2000).
Основной структурной составляющей кардиомиоцитов являются мио-фибриллы. Это крупные внутриклеточные структуры, диаметром около 1 мкм. Их характерная поперечная исчерченность возникает в результате многократного повторения структурной единицы миофибриллы – саркомера. Границами саркомеров служат темные полосы – линии Z. Эта линия расположена в центре светлого диска I. Между дисками I имеются темные диски A. В центре диска A располагается более светлая полоса – линия H (или L). Посередине светлой линии H имеется темная линия M. Длина диска A в расслабленной миофибрилле равна примерно 1,5 мкм, длина диска I – около 0,8 мкм. Миофибриллы состоят из двух типов протофибрилл (или миофиламен-тов) – толстые (диаметром 10 – 25 нм), содержащие белок миозин, и тонкие (диаметром 5-7 нм), содержащие белок актин. Вокруг каждой толстой прото-фибриллы располагается шесть тонких, а вокруг каждой тонкой – три толстые. Степень перекрывания протофибрилл зависит от степени сокращения саркомера. От толстых протофибрилл через каждые 6-7 нанометров к тонким отходят поперечные мостики, которым принадлежит большая роль в мышечном сокращении (Изаков В.Я. и др., 1981).
В кардиомиоцитах имеется большое количество митохондрий, что свидетельствует о повышенной потребности клеток в энергии для обеспечения многочисленных клеточных функций, поэтому они занимают значительную часть цитоплазмы клеток и при этом сосредоточены в местах повышенного потребления АТФ. В количественном отношении среди внутриклеточных компонентов кардиомиоцитов желудочков митохондрии занимают второе место. Они обычно располагаются, образуя продольные столбики, между миофибриллами, в перинуклеарной зоне и в субсарколеммальном пространстве (Ленинджер А., 1966, 1985; Виноградов А.Д., 1999; Duchen M.R., 2004).
Митохондрии имеют овальную форму, их диаметр 0,2 – 1 мкм, длина до 7 мкм (в среднем около 2 мкм). У этих органелл имеется две мембраны – наружная и внутренняя, последняя образует кристы. Между наружной и внутренней мембранами находится межмембранное пространство. В пространстве, ограниченном внутренней мембраной, расположен матрикс. Наружная мембрана проницаема для многих молекул. В межмембранном пространстве накапливаются ионы Н+, «выкачиваемые» из матрикса, что со-здат протонный градиент концентрации по обе стороны внутренней мембраны (Авцын А.П. и др., 1979; Фролов В.А. и др., 1989; Ichas F. et al., 1997).
Внутренняя мембрана избирательно проницаема, она содержит транспортные системы для переноса в обоих направлениях таких веществ, как аденозинтрифосфат (АТФ), аденозиндифосфат (АДФ), пируват, сукцинат и многих других. Внутренняя мембрана митохондрий также содержит транспортные цепи для переноса электронов, которые связанны с ферментами окислительного фосфорилирования, а также сукцинатдегидрогеназу (СДГ). В матриксе присутствуют все ферменты цикла Кребса, кроме СДГ, ферменты окисления жирных кислот и некоторые ферменты других систем, здесь находятся гранулы с ионами Мg2+ и Са2+ (Кондрашова М.Н. и др., 1974; Улумбе-ков Э.Г. и др., 2002; Brustovetsky N. et al., 2000).
Митохондрии выполняют в клетке множество функций – окисление в цикле Кребса, транспорт электронов, хемиосмотическое сопряжение, фосфо-рилирование АДФ, сопряжение окисления и фосфорилирования, функцию контроля внутриклеточной концентрации кальция, синтез белков, образование тепла. Велика роль митохондрий в программированной (регулируемой) гибели клеток (апоптозе) (Ибрагимова И.Ф. и др., 1997; Суханова Г.А. и др., 2000; Desagher S. et al., 2000).
Экспериментальное моделирование механического повреждения сердца
Для оценки ультраструктурных изменений образцы миокарда размерами 1х1х1 мм фиксировали погружением в охлажденный до 4С 4% раствор пара-формальдегида на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,6 в течение 3 – 4 часов. Затем образцы ткани переносили в свежую порцию вышеуказанного фиксатора с рН 8,0, в котором их хранили при комнатной температуре необходимое время. По данным Winborn W.B. et Seelig L.L. (1970), экспериментальная проверка различных фиксаторов показала, что наиболее пригодным для фиксации биопсийного, операционного, аутопсийного и экспериментального материала является параформальдегид. По сравнению с широко применяемым другим альдегидным фиксатором – глутаральдегидом, параформальдегид обладает рядом несомненных преимуществ. Главное из них – большая скорость проникновения в ткани, что очень важно для предотвращения аутолитических изменений в образцах. При глутаральдегидной фиксации удовлетворительное состояние ультраструктурных компонентов клеток прослеживается на глубине не более 1 мм, в то время как параформальдегид сохраняет для электронно-микроскопического исследования ткань образца объемом 3,5 см3.
По данным Л.А.Семеновой и соавт. (1985), стабильность ультраструктуры тканей резко возрастает при увеличении рН параформальдегидного фиксатора. Наилучшие результаты получены при фиксации материала в парафор-мальдегиде на фосфатном буфере с конечным значением рН 8,0. Испытания на длительность хранения тканей в этой фиксирующей жидкости показали, что структура клеточных органелл сохраняется полностью в течение 3 – 4 мес.
После этого проводили дополнительную фиксацию образцов миокарда в 1% растворе оксида осмия (VIII) на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,2 – 7,6 в течение 1 – 2 ч. Затем осуществляли последовательное обезвоживание образцов миокарда, при котором вода замещалась спиртами восходящей концентрации: 30, 50, 70 и 100 %. После этого спирт замещали ацетоном в смеси по 50% ацетона и спирта, затем в 100%-ном ацетоне. Высушивание достигали замещением ацетона газообразной углекислотой в специальной установке. После чего подготовленные образцы заливали в эпоксидный клей (эпон) (Уикли Б., 1975; Семенова Л.А. и др., 1978; Миронов А.А. и др., 1994).
Для ориентировки в изучаемом объекте, были изготовлены полутонкие срезы толщиной 2 – 3 мкм, которые окрашивали толуидиновым синим. На срезах выделяли области, которые должны были быть изучены на ультрамикроскопическом уровне (для приготовления ультратонких срезов). Миокард первоначально исследовали на малом увеличении – 100 (10х10), а затем при увеличении 400 (10х40).
Ультратонкие срезы толщиной 35 – 45 нм получали на ультратоме LKB 8800 (Швеция), контрастировали насыщенным водным раствором уранила-цетата. Трансмиссионную электронную микроскопию осуществляли на электронном микроскопе JEM 1010 (Япония).
Для осуществления морфометрического анализа в качестве основного стереологического параметра выбран относительный объем (Vv). Этот параметр достаточно полно характеризует внутриклеточные перестройки и дает представление о пропорциональности увеличения или уменьшения тех или иных структур и, следовательно, о механизмах изучаемого процесса. Относительные параметры удобны при проведении сравнительных исследований и при сравнении полученных результатов с данными других авторов (Непомнящих Л.М. и др., 1984; Автандилов Г.Г., 1990).
На электронограммах методом подсчета точек была охарактеризована объемная плотность (Vv) митохондрий, участков саркоплазмы с рибосомами, саркоплазматической сети, лизосом и участков саркоплазмы с гликогеном в кардиомиоцитах, а также митохондрий, рибосом, люминальных, свободных (цитоплазматических) и базальных микропиноцитозных везикул в эндоте-лиоцитах кровеносных капилляров миокарда желудочков.
Ультраструктурный стереологический анализ образцов миокарда проводили на электронограммах срезов кардиомиоцитов и эндотелиоцитов при увеличении в 8 000 раз. При этом площадь среза по микрофотографии составляла 33,28 мкм2 (6,4 мкм х 5,2 мкм). На электронно-микроскопические изображения компьютерным способом накладывалась тестовая система в виде решетки, состоящей из пересекающихся параллельных вертикальных и горизонтальных линий, образующих множество квадратов. Тестовые точки (узлы) соответствовали местам пересечений этих линий. Расстояние между точками составляло 0,1 мкм, на одной микрофотографии размещалось 3328 точек (64 точки х 52 точки).
Использованный метод основан на подсчете числа узлов тестовой системы, приходящихся на исследуемую внутриклеточную структуру. По числу тестовых точек на каждой внутриклеточной структуре делалось заключение об их относительном объеме. Объемная плотность структур рассчитывалась по формуле: Vv = Pi/Pt, где Рi – количество точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры; Рt – общее число точек тестовой системы, попавших на профиль среза исследуемого объекта.
Для статистической оценки результатов применялась общая линейная модель, реализованная в процедуре однофакторного дисперсионного анализа с фиксированными эффектами – метод ANOVA (Analysis of Variance). Статистическая обработка результатов включала нахождение средних значений изучаемых параметров (M±m), которые сравнивали по t-критерию Стьюден-та. При сравнении средних значимыми считали различия, если вероятность ошибки (p) была меньше 0,05. Операции выполняли с использованием ЭВМ (Гланц С., 1998; Автандилов Г.Г., 2002).
Таким образом, при изучении миокарда использованы различные методические подходы: световая и электронная микроскопия, морфометрия и сте-реология. Каждый метод в комплексном морфологическом анализе решает свои задачи. В большинстве работ прошлых лет дается преимущественно качественное морфологическое описание. В данном исследовании использован метод ультраструктурной стереометрии, что позволило получить качественно новую информацию о структурных изменениях миокарда при механическом повреждении сердца и существенно дополнить те сведения, которые получены с помощью описательной световой и электронной микроскопии.
Подготовка объектов исследования для трансмиссионной электронной микроскопии
Дальнейшее нанесение ударов по передней поверхности грудной клетки приводило к нарушениям сердечной проводимости – была зафиксирована синоатриальная блокада и остановка (арест) синусового узла (sinus arrest). Синоатриальная блокада проявлялась постепенным удлинением интервалов RR с последующим выпадением сердечного комплекса. Затем происходило замещение синусового ритма ритмом автоматического центра II порядка – атриовентрикулярного узла, с частотой сердечных сокращений от 80 до 230 уд./мин. Атриовентрикулярный ритм имел несинусовый характер (водитель ритма – в атриовентрикулярном узле), поэтому зубец P и интервал PQ отсутствовали, комплекс QRST был в норме.
Остановка синусового узла проявлялась периодической потерей способности синусового узла вырабатывать электрические импульсы, что приводило к возникновению пауз в сердечных сокращениях. При таком нарушении ритма частота сердечных сокращений колебалась в широких пределах и составляла 60 – 110 уд./мин, восстановление синусового ритма наступало через 10 – 120 секунд, восстановление частоты сердечных сокращений 250 – 300 уд./мин происходило на 30 – 130-й секунде.
При продолжении нанесения ударных травматических воздействий в проекции расположения сердца без выжидания паузы для восстановления сердечного ритма регистрировалась полная блокада ножек пучка Гиса и полная атриовентрикулярная блокада с водителем ритма – АВ-узлом и частотой сердечных сокращений 80 – 100 уд./мин. При прекращении ударных воздействий подобная картина сохранялась на протяжении последующих 6 – 40 секунд, после чего восстанавливался синусовый ритм с частотой сердечных сокращений 250 – 280 уд./мин.
При неоднократных травмирующих воздействиях в проекции расположения сердца с моделированием механического повреждения сердца тяжелой степени в большинстве случаев регистрировалось значительное урежение ритма сердечных сокращений с синусовой брадикардией до 120-60 уд./мин. Намного реже развивалась синусовая тахикардия с синусовым правильным ритмом и частотой сердечных сокращений 400 – 450 уд./мин, которая в течение 1 – 2 мин переходила в синусовую брадикардию. Через 1 – 3 мин от начала травматического воздействия отмечались такие аритмические нарушения, как полная блокада ножек пучка Гиса и остановка синусового узла с замещающим эктопическим ритмом атриовентрикулярного узла, при этом частота сердечных сокращений уменьшалась до 60 – 40 уд./мин (рис. 4).
В дальнейшем (через 2 – 7 мин) от начала нанесения ударов, наступала асистолия с единичными идиовентрикулярными комплексами с частотой сердечных сокращений 10 – 15 уд./мин (рис. 5). Рис. 5. Асистолия в результате неоднократных травмирующих воздействий.
Во всех случаях полному прекращению сердечной деятельности предшествовал идиовентрикулярный ритм с частотой сердечных сокращений 40 – 60 уд./мин. При этом на ЭКГ регистрировался несинусовый ритм (водитель ритма – в пучке Гиса, его ножках или волокнах Пуркинье), поэтому зубец P и интервал PQ отсутствовали, комплекс QRST был расширен и деформирован, зубец Т был дискордантным. Идиовентрикулярный ритм возникает при подавлении функции выше расположенных центров автоматизма (синоатриаль-ного и атриовентрикулярного узлов), является следствием тяжелых поражений проводящей системы сердца и в клинической практике наблюдается при терминальных состояниях у пациентов с некротическими, дистрофическими и воспалительными изменениями в сердце.
Аритмические нарушения при механическом повреждении сердца связаны с повреждением Na+-K+-каналов сарколеммы кардиомиоцитов, что приводит к нарушению ионного баланса в клетках с уменьшением концентрации внутриклеточного калия, ведущим к снижению мембранного потенциала кардиомиоцитов и более легкому возникновению в них деполяризации и возбуждения. Кроме того, к фибрилляции мышечных волокон сердца предрасполагает повышенное содержание в крови симпатических медиаторов – ка-техоламинов.
Таким образом, полученные экспериментальным путем данные свидетельствуют о развитии при закрытой тупой травме грудной клетки, сопровождавшейся механическим повреждением сердца, различных вариантов аритмий, связанных с нарушением образования и проведения электрических импульсов. При однократных травмирующих воздействиях выявленные аритмические нарушения были представлены синусовой тахикардией, синусовой брадикардией, одиночными и групповыми желудочковыми экстраси-столиями, полной синоатриальной блокадой, арестом синусового узла, полной атриовентрикулярной блокадой и полной блокадой ножек пучка Гиса.
При неоднократных частых ударных воздействиях в проекции расположения сердца быстро наступала синусовая брадикардия, полная блокада ножек пучка Гиса, арест синусового узла с эктопическим ритмом атриовен-трикулярного узла и последующим развитием идиовентрикулярного ритма и асистолии. Реже при неоднократных частых ударных воздействиях в область сердца наблюдалась синусовая тахикардия с последующими желудочковыми экстрасистолиями, а затем трепетание и фибрилляция желудочков.
Полученные данные коррелируют с ранее проведенными исследованиями (Новоселов В.П. и др., 2002; Савченко С.В., 2002; Ковалева М.А., 2006). Выявленные аритмические изменения обусловливают острое снижение насосной функции миокарда при ушибе сердца. Нарушения деятельности проводящей системы сердца, возникающие при его механическом повреждении, можно зафиксировать с помощью электрокардиографии. Выявленные электрокардиографические изменения могут быть использованы для диагностики механического повреждения сердца в нелетальных случаях травмы этого органа. Кроме того, полученные сведения о наступающих нарушениях в работе проводящей системы сердца, которые возникают при ударном травматическом воздействии по передней грудной стенке в проекции расположения сердца, следует учитывать в клинической практике при оказании медицинской помощи травмированным пациентам.
Ультраструктурные изменения кардиомиоцитов при моделировании механического повреждения сердца
Результаты исследований свидетельствуют о том, что наблюдалась однонаправленная тенденция изменения объемных плотностей органелл и включений кардиомиоцитов левого желудочка в зависимости от степени тяжести механического повреждения сердца.
Объемная плотность митохондрий в кардиомиоцитах левого желудочка при механическом повреждении сердца тяжелой степени была в 1,22 раза больше по сравнению с объемной плотностью митохондрий в кардиомиоци-тах левого желудочка при механическом повреждении сердца средней степени тяжести, рибосом – в 1,17 раза меньше, саркоплазматической сети – в 1,76 раза больше, лизосом – в 1,33 раза больше, гранул гликогена – в 1,46 раза меньше. Следует отметить драматическое снижение объемной плотности миофибрилл в кардиомиоцитах левого желудочка при травме сердца тяжелой степени, этот показатель уменьшился в 2,81 раза по сравнению с таковым при механической травме средней степени тяжести.
Анализ данных, изложенных в табл. 2 и 4 свидетельствует о том, что при механическом повреждении сердца средней степени тяжести более высокая объемная плотность органелл и гликогена наблюдалась в кардиомиоцитах левого желудочка сердца по сравнению с кардиомиоцитами правого желудочка. Объемная плотность митохондрий в кардиомиоцитах левого желудочка при механическом повреждении сердца средней степени тяжести была в 1,42 раза больше по сравнению с объемной плотностью митохондрий в кардио-миоцитах правого желудочка при механическом повреждении сердца средней степени тяжести, рибосом – в 1,14 раза больше, саркоплазматической сети – в 1,25 раза больше, гранул гликогена – в 1,27 раза больше.
Оценивая полученные данные (см. табл. 3 и 5), можно заключить, что при механическом повреждении сердца тяжелой степени более высокая объемная плотность органелл и гликогена наблюдалась в кардиомиоцитах левого желудочка сердца по сравнению с кардиомиоцитами правого желудочка.
Объемная плотность митохондрий в кардиомиоцитах левого желудочка при механическом повреждении сердца тяжелой степени была в 1,47 раза больше по сравнению с объемной плотностью митохондрий в кардиомиоци-тах правого желудочка при механическом повреждении сердца тяжелой степени, рибосом – в 1,06 раза больше, саркоплазматической сети – в 1,34 раза больше, гранул гликогена – в 1,2 раза больше. Все величины достоверно отличались от величин аналогичных параметров в предыдущей группе опытных животных.
В условиях эксперимента с механическим повреждением сердца основным проявлением альтерации митохондрий было их набухание. Оно обусловило зернистость цитоплазмы на светооптическом уровне и явилось морфологическим проявлением зернистой дистрофии. С набуханием было связано увеличение объемной плотности митохондрий. Набухание сопровождалось увеличением размеров органелл, просветлением митохондриального матрикса, увеличением расстояний между кристами, их деформацией и деструкцией (рис. 7, 8, 9).
При механическом повреждении сердца средней тяжести в митохондриях отмечалось разрежение крист, часто они были деформированными, теряли параллельность расположения, иногда были видны их единичные разрывы. При механическом повреждении сердца тяжелой степени очаги просветления могли занимать всю площадь митохондрий, деструкция крист была намного выраженнее, встречалась их частичная и полная гомогенизация. Рис. 7. Вариабельность размеров митохондрий кардиомиоцита при механическом повреждении сердца тяжелой степени в эксперименте. Ув. 8000.
Разрежение, деформация и деструкция крист митохондрий кардио-миоцита при механическом повреждении сердца средней степени в эксперименте. Ув. 8000. Рис. 9. Группы мелких митохондрий в кардиомиоците между пересокращенными миофибриллами при механическом повреждении сердца средней степени в эксперименте. Ув. 8000.
Значительное уменьшение количества рибосом в кардиомиоците при механическом повреждении сердца тяжелой степени в эксперименте. Ув. 8000. Кроме того, при механическом повреждении сердца средней степени тяжести только в части митохондрий имелись отдельные изменения, при механическом повреждении сердца тяжелой степени все митохондрии были в состоянии набухания.
При механическом повреждении сердца визуально отмечалось снижение количества рибосом. При морфометрии наблюдалось уменьшение их объемной плотности (рис. 10).
При механическом повреждении везикулы агранулярной саркоплазма-тической сети были расширены (рис. 11). Гранулярная саркоплазматическая сеть при повреждении утрачивала рибосомы (происходила ее дегрануляция), цистерны были расширены. В результате чего также образовывались мелкие везикулы и крупные вакуоли. Местами каналы саркоплазматической сети были сдавлены набухшими митохондриями. При механическом повреждении клетки диктиосомы пластинчатого комплекса Гольджи распадались на мелкие везикулы.
При механическом повреждении сердца отмечалось увеличение объемной плотности лизосом (рис. 12).
По сравнению с рибосомами «розетки» альфа-гликогена выглядели более рыхлыми и более электронно-прозрачными структурами, располагавшимися преимущественно вокруг митохондрий. При механическом повреждении сердца визуально отмечалось снижение количества гранул гликогена, при этом при механическом повреждении тяжелой степени они были единичными и располагались лишь в непосредственной близости от митохондрий. При морфометрии наблюдалось уменьшение объемной плотности гликогена (рис. 13).
Ядра кардиомиоцитов при механическом повреждении сердца приобрели «изрезанные» контуры, количество гетерохроматина в них визуально возрастало, ядерные поры были расширены.
Наблюдалось расширение межклеточных пространств, в которых располагались бесформенные мембранные образования, отмечался отек саркоплазмы, особенно в субсарколеммальной зоне. Со стороны контрактильного аппарата сердечных миоцитов при механическом повреждении сердца были выявлены следующие морфологические изменения.