Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Классификации амелобластомы 12
1.2 Диагностика амелобластом 18
1.3 Методы лечения амелобластом 20
1.4 Эмбриогенез и гистогенез амелобластомы 22
1.5 Стволовые клетки зуба 25
1.6 Иммуногистохимическое исследование амелобластом 28
1.1.1 Маркер пролиферативной активности ki-67 30
1.1.2 Иммуногистохимические маркеры опухолей 32
1.1.3 Маркер плюрипотентных стволовых эпителиальных клеток SOX2 35
Глава 2. Материалы и методы 39
1.7 Выборка биопсийного материала 39
1.8 Характеристика операционного и архивного биопсийного материала 40
1.9 Метод тканевых матриц 42
1.10 Иммуногистохимическое исследование 44
2.1.1. Этапы иммуногистохимического исследования: 44
1.11 Микроскопия: основные методики подсчета результатов 47
1.12 Статистический анализ полученных результатов 48
Глава 3. Результаты 49
1.13 Результаты анализа архивных и биопсийных данных 49
1.14 Гистологическая характеристика амелобластом 54
3.1.1 Амелобластома: плексиформный вариант 54
3.1.2 Амелобластома: фолликулярный вариант 57
3.1.3 Амелобластома: зернистоклеточный вариант 60
3.1.4 Амелобластома: акантоматозный вариант 63
3.1.5 Амелобластома: базальноклеточный вариант 66
3.1.6 Амелобластома: монокистозный вариант 69
3.1.7 Амелобластома: десмопластический вариант 72
3.1.8 Периферическая амелобластома 74
1.15 Оценка распределения белков и прогностического значения различных гистологических типов амелобластомы 76
3.1.9 Белок пролиферативной активности Ki-67 76
3.1.10 Размеры амелобластомы 78
3.1.11Плюрипотентные стволовые клетки - SOX2 80
3.1.12 Корреляционная взаимосвязь по Спирмену в амелобластомах 83
Обсуждение полученных результатов 87
Заключение 92
Практические рекомендации 93
Перспективы дальнейшей разработки темы 94
Список сокращений 95
Список литературы 98
- Эмбриогенез и гистогенез амелобластомы
- Результаты анализа архивных и биопсийных данных
- Амелобластома: монокистозный вариант
- Корреляционная взаимосвязь по Спирмену в амелобластомах
Введение к работе
Актуальность темы исследования: Доброкачественные
одонтогенные опухоли эпителиального происхождения являются группой
заболеваний, которые вследствие разнообразия клинического поведения,
патоморфологических особенностей и различных вариантов терапии
вызывают большой интерес клиницистов и патологоанатомов.
Амелобластома представляет собой доброкачественную одонтогенную эпителиальную опухоль, которая составляет от 1% до 11% всех опухолей головы и шеи и от 11% до 30% всех новообразований челюстных костей. Наиболее часто встречается у лиц трудоспособного возраста, что обусловливает социальную значимость этого заболевания (Faras F., 2017; Sekersi A-E.et al., 2015;)
Несмотря на тот факт, что амелобластома является доброкачественным
образованием, нередки случаи ее рецидивирования и высокой инвазивности,
что придает особую важность правильному выбору метода лечения. В связи с
этим, серьезной задачей является определение прогностических факторов
агрессивного роста амелобластомы. Данные последних исследований
свидетельствуют о том, что характеристики гистологического варианта опухоли, могут являться необходимыми прогностическими критериями амелобластомы (Nagi R. et al., 2016; Milman T. et al., 2016).
В свою очередь современные гистологические классификации
амелобластомы могут помочь выявить клинически агрессивные виды течения амелобластомы. (Shaikhi Kh. et al., 2012).
Степень разработанности темы: Ранее было показано, что маркер
пролиферации Ki-67 позволяет оценить агрессивность кератокистозных
одонтогенных опухолей (Yu Y.H. et al., 2015; Safadi R.A. et al., 2016).
Исследование амелобластомы с маркером Ki-67 позволило сделать вывод о
том, что максимальная пролиферативная активность в амелобластомах
отмечается в периферическом клеточном слое, в то время как клетки
звездчатого ретикулума обладают слабой пролиферативной активностью
(Бабиченко И.И. и др., 2013; Усачев Е.С., 2014; Lei Y. et al., 2014), однако эти
показатели не связаны с агрессивностью клинического течения
амелобластомы. Было описано исследование, направленное на определение
белка SOX2 мультипотентных стволовых клеток, как маркера
амелобластической карциномы, но не проводилось изучение
корреляционных взаимоотношений между агрессивностью клинического
течения амелобластомы, гистологическим вариантом, пролиферативной
активностью клеток и наличием в опухоли плюрипотентных стволовых клеток (SOX2).
Цель исследования: Дать клинико-морфологическую характеристику
различным гистологическим вариантам амелобластомы по возрастным
группам, частоте рецидивирования, обширности поражений,
пролиферативной активности (Ki-67) и наличию плюрипотентных стволовых клеток (с использованием белка SOX2) для прогнозирования тактики лечения пациентов.
Задачи исследования:
1. Провести анализ операционного и архивного биопсийного материала
отделения хирургической стоматологии и лаборатории патологической
анатомии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава РФ за 20 лет для выявления
частоты встречаемости, особенностей клинического течения и
рецидивирования различных морфологических вариантов амелобластом.
2. Изучить роль пролиферативных процессов в амелобластомах различных
гистологических вариантов с помощью маркера клеточной пролиферации
Ki-67.
3. Изучить клиническое значение наличия плюрипотентных стволовых
клеток, содержащих белок SOX2, в различных гистологических вариантах
амелобластом.
4. Проследить корреляционные связи между пролиферативной активностью
клеток (по белку Ki-67), распределением плюрипотентных SOX2-позитивных
стволовых клеток и клиническими проявлениями заболевания у пациентов с
амелобластомами.
5. Выявить морфологические критерии, определяющие агрессивное
клиническое течение амелобластомы для прогнозирования тактики лечения
пациентов.
Научная новизна: Впервые показано, что повышенная способность к
рецидивированию и обширность поражений костной ткани при
базальноклеточном и плексиформном гистологических вариантах
амелобластомы связаны с высокими показателями пролиферативной
активности клеток по белку Ki-67.
Впервые установлено, что агрессивный характер клинического течения
базальноклеточного и плексиформного вариантов амелобластомы
характеризуется высокой концентрацией в них плюрипотентных стволовых клеток по белку SOX2.
Впервые выявлена умеренная положительная и достоверная
корреляционная взаимосвязь между гистологическим вариантом
амелобластомы, размером опухоли, пролиферативной активностью клеток и наличием плюрипотентных стволовых клеток.
Теоретическая и практическая значимость: На основе изучения
пролиферативной активности (Ki-67) и наличия плюрипотентных стволовых
клеток (SOX2) удалось выделить базальноклеточный и плексиформный
варианты амелобластомы, как наиболее агрессивные, требующие проведения
более радикальных методов лечения. Агрессивный характер клинического
течения фолликулярного, зернистоклеточного и акантоматозного вариантов
амелобластомы зависит от выраженности пролиферативной активности
клеток и наличия плюрипотентных стволовых клеток. Монокистозный и
периферический гистологические варианты амелобластомы,
характеризуются редкими рецидивами, слабой пролиферативной
активностью и низким содержанием плюрипотентных стволовых клеток, для подобных морфологических вариантов целесообразно использовать кюретаж или краевую резекцию челюсти.
Методология и методы исследования: Исследование проведено на
основании изучения историй болезни 76 пациентов с амелобластомой, с
оценкой данных по возрасту, полу, наличию рецидива заболевания и
обширности поражения. Проведены морфологические исследования
различных гистологических вариантов амелобластомы.
Проведены иммуногистохимические исследования пролиферативной
активности клеток по белку Ki-67 и распределения плюрипотентных стволовых клеток по белку SOX2 в различных гистологических вариантах амелобластомы.
Проведен статистический анализ корреляционных взаимоотношений между клиническими и иммуногистохимическими характеристиками амелобластом. Для сравнения межгрупповых различий использовались непараметрические тесты Манна-Уитни и Краскала-Уоллеса. Корреляционные взаимоотношения критериев выявляли с помощью коэффициента корреляции Спирмена.
Положения, выносимые на защиту:
1. Показатели пролиферативной активности клеток амелобластомы
позволяют выявить базальноклеточный и плексиформный варианты
амелобластомы в качестве наиболее агрессивных гистологических вариантов.
-
Агрессивность базальноклеточного и плексиформного гистологических вариантов амелобластомы характеризуется высокой плотностью распределения SOX2-позитивных плюрипотентных стволовых клеток.
-
Между наличием в амелобластомах плюрипотентных стволовых клеток и пролиферативной активностью эпителиальных клеток, а также размерами опухоли, существует умеренная и достоверная корреляционная связь.
-
Высокая пролиферативная активность клеток и обширность поражения костной ткани достоверно коррелируют с частотой рецидивирования опухоли.
Степень достоверности: Данное исследование произведено на основе
изучения морфологического материала 76 случаев заболевания
амелобластомой. Результаты исследований удалось систематизировать по
основным заданным критериям работы, таким как гистологический вариант,
возраст, пол, обширность поражения и наличие рецидива. В работе применен
комплекс методов исследования, включающий методы световой
микроскопии, иммуногистохимии и морфометрии. Иммуногистохимическое и светооптическое исследование проводили на сертифицированном оборудовании. В ходе последующего анализа данных, в котором были использованы адекватные методы статистики, были получены статистически значимые различия, что также позволяет сделать вывод о том, что объем выборки являлся достаточным.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной
конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии»
(Москва, 1617 апреля 2014 г), на XVII Ежегодном научном форуме
«Стоматология-2015» в рамках Российской недели здравоохранения (7-11 декабря 2015 года, Москва, Россия), VII международной научной конференция SCIENCE HEALTH-2016 (12 - 15 апреля 2016 года, Москва, Россия); Научно-практической конференции «Медицина и фармакология: научные приоритеты ученых», г. Пермь, ноябрь 2016; XIV международной научно-практической конференции «Достижения и проблемы современной науки» г. Санкт-Петербург (4 декабря 2016 г.); Международной научной
конференции «Эволюция научного знания», Москва, Россия (28-29 ноября 2016 г.); на XVIII Ежегодном научном форуме «Стоматология-2016»(5-9 декабря 2016 года), Москва, Россия.
Работа апробирована на совместном заседании кафедры
патологической анатомии и кафедры общей патологии и патологической физиологии им. В.А. Фролова ФГАОУ ВО РУДН 1 марта 2018 года.
Публикации результатов исследования: По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Внедрение результатов исследования: Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работу лаборатории патологической анатомии ФБГУ «ЦНИИС и ЧЛХ» МЗ РФ, а также в учебный процесс на кафедре патологической анатомии медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки РФ в качестве лекционного материала и семинарских занятий для студентов групп по специальности «Стоматология».
Объем и структура диссертации: Диссертация представлена на 110 страницах текста, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, списка литературы, который содержит 126 источников, из них 43 российских и 83 зарубежных. Содержит 10 таблиц и 33 рисунка.
Эмбриогенез и гистогенез амелобластомы
Развитие зубов у человека начинается на 5—6-й неделе пренатального развития. Пласт эпителия погружается в мезенхиму, образуя так называемую зубную пластинку, от которой отходят небольшие выпячивания - зубные зачатки, каждый из которых развивается в эмалевый орган, напоминающий по форме перевернутую чашу. Мезенхима, располагающаяся в полости чаши, получила название зубного сосочка. Эмалевый орган утрачивает связь с эпителием ротовой полости к 5 месяцу пренатального развития, но остатки зубной пластинки иногда сохраняются и впоследствии могут образовывать одонтогенные кисты. Внутренние клетки эмалевого органа активно пролиферируют и, развиваясь, служат источником амелобластов, вырабатывающих зубную эмаль. В центре эмалевого органа свободно располагаются отростчатые клетки, которые формируют пульпу эмалевого органа, называемую также звездчатым ретикулумом. Мезенхимальные клетки эмалевого органа являются предшественниками одонтобластов, которые синтезируют дентин, после чего происходит индукция образования эмали (Jussila М., 2012).
Регуляция первоначального развития зубов осуществляется через внеклеточный матрикс. В частности, это компоненты базальной мембраны, к которым относятся ламинин, коллаген и фибронектин (Fukumoto S., 2004; Yuasa K., 2004). Эти элементы матрикса контролируют пролиферацию, полярность и прикрепление элементов, а также определяют размер и морфологию зачатка зуба. На более поздних этапах развития зубов элементы базальной мембраны исчезают, и одонтогенные клетки начинают секретировать различные специфические компоненты внеклеточного матрикса, которые дают начало слоям эмали и дентина - производные от амелобластов из эпителиальных клеток и одонтобластов из мезенхимальных клеток.
Наружные клетки в нижней части эмалевого органа образуют трубчатую структуру — эпителиальное корневое влагалище (или влагалища Гертвига), индуцирующее развитие корня зуба. Мезенхимальные клетки дифференцируются в одонтобласты, которые синтезируют дентин корня. Отдел эпителиального корневого влагалища, расположенный ближе к коронке, дегенерирует, но клетки остаются на поверхности цемента и сохраняют контакты между собой и клетками мезенхимы (Huang X. et al., 2009). Прочие эпителиальные клетки образуют так называемые островки Малассе, разбросанные в периодонтальной связке. Впоследствии начинается синтез цемента периодонтальной связки.
Амелобластин – один из матриксных белков эмали, продуцируемый дифференцированными амелобластами, он участвует в дифференцировке эпителиальных клеток зуба в амелобласты и формировании эмали (Nakamura T. et al., 2016). Сиалофосфопротеин дентина является компонентом SIBLING (SmallIntegrin-BindingLigand N-linkedGlycoprotein) семейства внеклеточных матриксных гликофосфопротеинов и продуцируется дифференцированными амелобластами (Fisher С., 2011). Эти внеклеточные матрицы важны для формирования как эмали зуба, так и дентина (Fukumoto S., 2004).
Как можно заключить, зубы развиваются из клеток двух зародышевых листков, что обусловливает разнообразие гистогенеза одонтогенных опухолей (Самусев Р.П., 2002; Phillipsen H.P., Reichart R.A., 2004; Wang X-P., 2011).
Амелобластомы состоят из эпителиальной ткани, схожей с эмалевым органом зубных зачатков в стадии образования эмали, но без тенденции последующего развития в твердую ткань. Строма амелобластомы не имеет характеристик зубной мезенхимы. Удлиненные периферические базальные клетки, окружающие опухолевые, похожи на пре-амелобласты (Чумаков А.А., 2004; Семкин В.А. с соавт., 2017). Клетки внутренней зоны схожи со звездчатыми ретикулярными клетками зубного зачатка. На сегодняшний день этиология данной опухоли неясна, но считается, что потенциальными источниками развития амелобластом могут быть следующие структуры: остатки дентальной пластинки, плюрипотентные клетки эпителия базального слоя слизистой оболочки, плюрипотентные клетки малых слюнных желез, а также редуцированный эпителий эмалевого органа зубного зачатка, эпителий зубной пластинки и эпителиальная выстилка одонтогенных кист, чаще фолликулярных. Существуют предположения, что в развитии одонтогенных опухолей участвуют островки Малассе (Gultekin S.E. et al., 2017). Также амелобластома может возникнуть, по мнению некоторых исследователей, из базальных клеток слизистой оболочки ротовой полости (Усачев Е.С., 2014; Luan X. et al., 2006; Juuri E., 2012; 2013 b; Nam H. et al., 2014). Есть мнение, что солидная/поликистозная амелобластома возникает из эмалевых эпителиальных остатков, монокистозная - из эпителия одонтогенных кист, периферическая - из остатков зубной пластинки и эпителия слизистой оболочки рта (Gardner D.G. et al., 2005).
На сегодняшний день среди исследователей не существует единой точки зрения по этому вопросу, поэтому механизм развития и происхождение одонтогенных эпителиальных опухолей является интересной проблемой для исследователей.
Результаты анализа архивных и биопсийных данных
Амелобластома – местнодеструирующая опухоль, и до определенного момента может не вызывать у пациентов беспокойства, так как в начале заболевание протекает бессимптомно и бывает находкой по случаю обращения к стоматологу при стандартных исследованиях, например обнаруживается на рентгеновских снимках или ортопантомографии (Рисунок 1). Наиболее часто опухолевый процесс поражает нижнюю челюсть, с распространением до угла челюсти (Рисунок 2).
Анализ архивного биопсийного материала лаборатории патологической анатомии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» МЗ РФ за 20 лет позволил выявить 76 случаев заболевания амелобластомой, из которых 36 мужчин и 40 женщин (отношение 1:1,1). Этот дисбаланс оказался статистически не значимым, так как анализ данных с помощью критерия Манн-Уитни показал однородность выборки (p= 0,5602), а гендерное соотношение в данной выборке значимо не отличалось от пропорции 1:1. Оценка частоты заболеваемости различными типами амелобластом позволила выявить, что доля плексиформного и фолликулярного варианта амелобластомы наиболее велика 31,6% и 23,7% соответственно (Рисунок 3).
Это позволило объединить данные по пациентам мужского и женского пола для дальнейшего анализа (Таблица 1, Рисунок 4).
Средний возраст пациентов мужского пола составил 49,3±15,2 года, женского - 44,4±16,5 года.
Средний возраст пациентов был подсчитан для каждого гистологического варианта, результаты подсчета занесены в таблицу (Таблица 2).
Результаты подсчета показали, что самые высокие показатели отмечались у пациентов с базальноклеточным гистологическим вариантом амелобластомы, а самые низкие - у пациентов с фолликулярным вариантом строения опухоли. По критерию Краскала-Уолесса достоверных данных получено не было (p=0,2341), что указывает на однородность настоящей выборки.
На гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, амелобластома представлена тяжами или островками одонтогенного эпителия, окруженными соединительнотканной стромой. Пролиферирующий эпителий может образовывать кисты. Цитоплазма эпителиоцитов вакуолизирована, для ядер характерна гиперхромазия и обратная поляризация: они располагаются рядами ближе к апикальному краю клеток, чем к базальной мембране. В данном исследовании мы пользовались классификацией амелобластом, предложенной Kh.Shaikhi et al. (2012), в которой выделяются следующие гистологические варианты: плексиформный, фолликулярный, зернистоклеточный, акантоматозный, базальноклеточный, монокистозный, десмопластический, периферический, описание которых приведено ниже.
Амелобластома: монокистозный вариант
Выявлено 6 случаев, из них в 2-х выявлены рецидивы (33%). Размер 3 (1;4) усл. ед. Монокистозный (уникистозный) тип амелобластомы содержит кистозные полости различной величины и формы, выстланные типичным амелобластическим эпителием. Строма сравнительно мало развита (Рисунок 20а). Монокистозный вариант можно подразделить на три разновидности.
Первая - выглядит как протоковая монокистозная амелобластома, состоящая из кисты, окруженной простым одонтогенным, в виде ряда, эпителием, с обратной поляризацией ядер и с вакуолями в цитоплазме базальных клеток. Ее перекрывает похожая на звездчатый ретикулум область. В соединительной ткани выявляется тонкая полоска гиалинизации. Вторая разновидность опухоли – это монокистозная амелобластома, которая состоит из кисты, демонстрирующей плексиформную (ветвящуюся) пролиферацию эпителия. Третья – это пристеночная монокистозная амелобластома, в которой в островки типичной плексиформной или фолликулярной амелобластомы располагаются в фиброзной соединительной ткани кистозной стенки (Рисунок 20б).
Интенсивность ИГХ-реакции варьировала для Ki-67 Мо=2%(1;4) (Рисунок 21), а для SOX2 – 6% (0;50) (Рисунок 22)
Выявлено 3 случая, без рецидивов. Размер – 3 (1;3) усл.ед. Морфологически десмопластический вариант амелобластомы резко отличается от других типов амелобластом сильно выраженной коллагенизацией стромы (десмоплазией) (Рисунок 23), в которой содержатся островки одонтогенного эпителия неправильной или звездчатой формы, окруженные узкой зоной рыхлой соединительной ткани. Границы опухоли плохо различимы (вследствие ее агрессивности и высокой способности к инфильтрации). Типичные ряды базальных клеток с обратной поляризацией ядер и вакуолизацией цитоплазмы почти полностью отсутствуют. В центре многочисленные веретенообразные или чешуйчатые клетки. Иногда отмечается кальцификация или образование кости.
Пролиферативная активность белка Ki-67 - 5%(2;10) (Рисунок 24). Для SOX2 – интенсивность реакции - 90% (30;95) (Рисунок 25).
Корреляционная взаимосвязь по Спирмену в амелобластомах
Для оценки взаимосвязи между показателями в амелобластомах был проведен корреляционный анализ по Спирмену, полученные результаты представлены в Таблице 9, с описанием силы связи между показателями (SIZE – обозначение размера опухоли, REC- обозначение рецидива).
В результате были получены следующие данные:
1) Между пролиферативной активностью (Ki-67) и размерами амелобластомы (SIZE) выявлена умеренная достоверная корреляция;
2) Между размерами амелобластомы (SIZE) и наличием белка SOX2 выявлена умеренная достоверная корреляция;
3) Между белком SOX2 и пролиферативной активностью (Ki-67) амелобластомы выявлена умеренная достоверная корреляция;
4) Между наличием рецидивов (REC) и белком SOX2 не выявлено достоверной корреляционой связи;
5) Между наличием рецидивов (REC) и белком Ki-67 слабая достоверная корреляционная связь;
На рисунке 31 представлена диаграмма рассеяния, отображающая взаимосвязь между пролиферативной активностью и размерами амелобластомы.
На рисунке 32 представлена диаграмма рассеяния, отображающая взаимосвязь между размерами опухоли и количеством клеток, положительных по SOX2.
На рисунке 33 представлена диаграмма рассеяния, отображающая взаимосвязь между пролиферативной активностью клеток опухоли (индексом Ki67) и количеством клеток, положительных по SOX2.
При сравнении амелобластом в случае с рецидивом и без рецидива с помощью U- критерия Манна-Уитни были исследованы различия по показателям пролиферативной активности (Ki-67), SOX2 и размерам опухоли (SIZE). Данные занесены в таблицу (Таблица 10).
Выявлены достоверные различия при сравнении группы с рецидивом амелобластомы и уровнем Ki-67, а также при сравнении группы с рецидивом и размером опухоли. Однако различия между рецидивом заболевания и уровнем SOX2 в амелобластоме не оказались статистически значимыми.