Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Рецептивность эндометрия в патогенезе женского бесплодия 16
1.2. Наследственные тромбофилии 30
1.3. Нарушения рецептивности эндометрия при наследственных тромбофилиях
1.4. Синдром недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ)
1.5. Нарушения рецептивности эндометрия при синдроме нДСТ
1.6. Сочетание нДСТ и НТ в патогенезе нарушений рецептивности эндометрия 43
Глава 2. Материал и методы исследования.
2.1. Материал исследования 45
2.2. Методы исследования 46
Глава 3. Результаты
3.1. Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы контроля 56
3.2. Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы нДСТ (группа №1) 62
3.3. Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы НТ (группа №2) 66
3.4. Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы НТ+нДСТ (группа №3)
3.5. Сравнение, статистическая обработка и оценка полученных данных 87
Глава 4. Обсуждение результатов и общее заключение 107
Выводы 116
Практические рекомендации 117
Список использованной литературы
- Нарушения рецептивности эндометрия при наследственных тромбофилиях
- Нарушения рецептивности эндометрия при синдроме нДСТ
- Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы нДСТ (группа №1)
- Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы НТ+нДСТ (группа №3)
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время первичное бесплодие является одним из важнейших факторов, негативно влияющих на рождаемость в России. По разным данным, частота бесплодного брака составляет от 10 до 20 % всех браков. Для женщин с первичным бесплодием характерен повторный срыв имплантации. Согласно Norwitz et al., лишь около 50-60% всех зачатий могут развиться в беременность и достигнуть срока 20 недель и позже. При этом 75% потерь беременностей обусловлены нарушениями имплантации, поэтому их клинически невозможно распознать как беременность (E. Norwitz, D. Schust et al. 2001). В целом, каждая девятая семейная пара в Европе и США имеет потери беременности, обусловленные нарушениями имплантации (M. Singh, P. Chaudhry et al. 2011).
Согласно определению ВОЗ, бесплодие – неспособность пары в детородном возрасте зачать ребёнка при регулярной половой жизни. Супружескую пару считают бесплодной, если беременность у женщины не наступает в течение года регулярной половой жизни (половые контакты не реже, чем 2 раза в неделю) без использования средств и методов контрацепции (Руководство ВОЗ по стандартизованному обследованию и диагностике бесплодных супружеских пар, 1997).
В литературе описан довольно большой объем случаев первичного бесплодия при отсутствии какой-либо явной генитальной или экстрагенитальной патологии у пациенток, при этом в эндометрии отстутствовали признаки патологического процесса – воспаления, гиперплазии и др., но имплантация бластоцисты по каким-то причинам была невозможна – так называемое, бесплодие неясного генеза. В связи с данным феноменом в течение длительного времени, начиная с 1990х гг, формировалось понятие рецептивности эндометрия в его современном понимании.
Рецептивность эндометрия – это комплекс структурно-функциональных
характеристик эндометрия с конкретными пространственными и временными
константами, определяющими способность эндометрия к имплантации. С
морфологической точки зрения рецептивный эндометрий имеет ряд конкретных проявлений: эндометрий находится в средней стадии фазы секреции (т.н. «окне имплантации», 6-10 день менструального цикла по данным УЗИ), наличие на поверхностном эпителии эндометрия зрелых пиноподий в достаточном количестве, экспрессия поверхностным эпителием ряда иммуногистохимических маркеров, готовность стромы к децидуализации.
Женщины, страдающие наследственными тромбофилиями (НТ) и синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ), имеют высокий риск
первичного и вторичного бесплодия, а также высокий риск неудачных попыток ЭКО, что было подтверждено в ряде работ и связано с нарушениями рецептивности эндометрия. Например, в работе F. Azem с соавт. показано, что у женщин с генетически верифицированными наследственными тромбофилиями примерно в 2,5 раза чаще встречалось бесплодие неясного генеза.
нДСТ и НТ нередко являются сочетанной патологией, что обусловлено общностью
молекулярно-генетических механизмов развития: во-первых, многие гены,
обуславливающие развитие нДСТ и НТ находятся в соседних локусах: гены PAI-1 2-цепей коллагена 1 типа расположены в одном локусе 7q22.1; ген -цепи коллагена 4 типа и гены факторов свертывания 7 и 10 расположены в одном локусе – 13q34; а гены 3-субъединицы ламинина и фактора свертывания 5 находятся в соседних локусах – 1q31 и 1q22 . Также белок PAI-1 играет важную роль в развитии этих синдромов: с одной стороны, ингибирует фибринолиз, с другой стороны, стимулирует процессы фиброза (A. Ghosh and D. Vaughan, 2012).
Однако до сих пор остаются неясными морфологические и молекулярно-генетические особенности эндометрия, в первую очередь, его стромы, ведущие к бесплодию у пациенток с НТ и нДСТ при наличии «морфологически неизмененного» эндометрия. На основе анализа данных литературы можно предположить, что причиной бесплодия у пациенток с НТ и нДСТ может быть нарушение рецептивности эндометрия.
Cтепень разработанности темы
Среди отечественных авторов общими вопросами проблемы рецептивности
эндометрия, а также рецептивности эндометрия при хроническом эндометрите и синдроме
нДСТ занимались Е.А.Коган, Т.А.Демура (ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова
(Сеченовский Университет) Минздрава России, г. Москва). Вопросы роли
воспалительного и гормонального фактора в патогенезе неразвивающейся беременности изучались А.П.Миловановым (ФБГНУ НИИ МЧ ФАНО России, г. Москва). Общие вопросы патогенеза синдрома нДСТ исследовала Т.И.Кадурина (ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России, г. Санкт-Петербург). Вопросы роли наследственных тромбофилий в патогенезе женского бесплодия изучались А.П.Момотом (ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул).
В ходе изучения имеющихся исследований выяснилось, что проблема рецептивности эндометрия в современной отечественной литературе слабо освещена, поскольку само понятие рецептивности эндометрия появилось в отечественной литературе в 2011 г. Вопросы морфологической и иммуногистохимической характеристик рецептивности эндометрия при наследственных тромбофилиях, а также при сочетании синдрома нДСТ и
наследственных тромбофилий, которые имеют ряд общих важных звеньев патогенеза, не рассматривались как в отечественной, так и в мировой литературе. Исходя из вышеуказанного, выбранная тема диссертационного исследования представляет интерес как с точки зрения фундаментального изучения влияния сочетания наследственных тромбофилий и синдрома нДСТ на рецептивность эндометрия, так и с точки зрения практического применения полученных данных в диагностике и лечении бесплодия неясного генеза у пациенток с НТ и нДСТ, что и обусловило цели и задачи данной работы. Целью исследования является определение морфологического и молекулярного субстрата нарушений рецептивности эндометрия при бесплодии женщин с наследственными тромбофилиями и синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани.
Задачи исследования:
а) Оценить клинические особенности пациенток, страдающих бесплодием,
наследственными тромбофилиями, синдромом недифференцированной дисплазии
соединительной ткани и сочетанием этих двух патологий.
б) Сравнить морфологические характеристики эндометрия в период «окна
имплантации» у женщин с наследственными тромбофилиями, синдромом
недифференцированной дисплазии соединительной ткани, сочетанием этих двух
патологий.
в) Сравнить иммуногистохимические характеристики эндометрия в период «окна
имплантации» у женщин с наследственными тромбофилиями, синдромом
недифференцированной дисплазии соединительной ткани, сочетанием этих двух
патологий.
г) Разработать патогенетическую модель нарушений рецептивности эндометрия при
сочетании наследственных тромбофилий и синдрома недифференцированной дисплазии
соединительной ткани
д) Разработать панель маркеров диагностики нарушений рецептивности эндометрия у
пациенток с наследственными тромбофилиями, синдромом дисплазии соединительной
ткани, а также сочетанием этих двух патологий.
Основные Положения, выносимые на защиту
1. Морфологическим субстратом первичного бесплодия женщин при НТ являются нарушения рецептивности эндометрия, проявляющиеся в запаздывании созревания эндометрия в результате снижения трофики эндометрия за счет дисциркуляторных расстройств (сладж, тромбоз) в микрососудах, формирования микроинфарктов из-за
полигенных мутаций факторов гемостаза и очагов склероза, а также усиления процессов склероза вследствие повышения экспрессии PAI-1.
-
Морфологическим субстратом первичного бесплодия женщин при нДСТ являются нарушения рецептивности эндометрия, в основе которых лежат процессы дезорганизации соединительнотканного компонента стромы эндометрия с развитием мукоидного набухания и фибриноидного некроза, замедление процессов ремоделирования стромы эндометрия с относительным преобладанием коллагена 3 типа над коллагеном 1 типа в строме эндометрия, снижением ангиогенеза, а также уменьшением уровня экспрессии ламинина и ММР-2, препятствующих имплантации бластоцисты.
-
Морфологическим субстратом первичного бесплодия у женщин при сочетании нДСТ и НТ является выраженное снижение рецептивности эндометрия, что обусловлено сочетанным действием таких факторов как запаздывание созревания эндометрия с дисциркуляторными и трофическими нарушениями, дезорганизация соединительнотканного компонента и нарушение ремоделирования стромы эндометрия, снижение ангиогенеза, что проявляется в снижении числа зрелых пиноподий на поверхности эпителия эндометрия, нарушении стромального прогестерон-эстрогенового индекса и перераспределении экспрессии LIF из эпителия в строму.
Научная новизна
Впервые оценен спектр мутаций и полиморфизмов генов, влияющих на свертываемость крови, у женщин, страдающих бесплодием, и выявлена частая множественность мутаций и полиморфизмов вышеозначенных генов.
Впервые был проведен подробный клинико-морфологический анализ,
охарактеризован морфологический и молекулярно-генетический субстрат нарушений рецептивности эндометрия у пациенток, страдающих наследственными тромбофилиями и синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани, проявлявшийся в снижении количества зрелых пиноподий, появлению в период «окна имплантации» эндометрия стадии поздней пролиферации или ранней секреции, а также нарушению стромального прогестерон-эстрогенового индекса.
Впервые изучены морфологические и молекулярно-генетические особенности стромы эндометрия у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани и наследственными тромбофилиями: проведена сравнительная оценка экспрессии коллагенов 1 и 3 типов в коллагеновой сетке эндометриальной стромы, морфометрически показано соотношение экспрессии коллагенов 1 и 3 типа в очагах фиброза.
Впервые разработана гипотеза патогенеза нарушений рецептивности эндометрия при
наследственных тромбофилиях и синдроме недифференцированной дисплазии
соединительной ткани.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработана модель патогенеза первичного женского бесплодия у пациенток с сочетанием НТ и синдрома нДСТ.
Разработана панель маркеров, необходимых для выявления причины женского бесплодия при наследственных тромбофилиях, синдроме недифференцированной дисплазии соединительной ткани, а также их сочетании.
Разработанная панель маркеров способствует оценке прогноза беременности у пациенток с НТ и нДСТ.
Выявленные патогенетические связи между НТ, нДСТ и рецептивностью эндометрия должны помочь при подборе терапии первичного бесплодия у пациенток с этими заболеваниями, например, применение антикоагулянтов у пациенток с НТ, а также при оценке возможности успешного проведения протокола ВРТ у пациентки.
Методология и методы исследования
Методы исследования включали: клинико-морфологическое и генетическое исследование 81 пациентки с первичным бесплодием: изучение данных физикального исследования, анамнестических данных, результаты исследования системы гемостаза (уровни PAI-1 и гомоцистеина в сыворотке крови, результаты метионинового теста, результаты генетического исследования – полиморфизм следующих генов: FVII, FXII, FXIII, GpIa, GpIb (-5), GpIb (T145M), GpIIIa, PAI-1, FBGb, MTHFR, MTRR, MTR, SLC19A1; мутации следующих генов: FII, FV (Leiden), ангиотензиногена (M235T и Т145М), ангиотензин-превращающего фермента, их гомо- или гетерозиготность). Бальную оценку выраженности симптомов нДСТ проводили в соответствии с руководством Т.И.Кадуриной. Проводилось морфологическое исследование пайпель-биоптатов эндометрия, взятых у каждой из пациенток в период «окна имплантации» (6-8 день после овуляции по данным УЗИ). Гистологические препараты пайпель-биоптатов окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим, пикрофуксином по Ван Гизону. Морфометрическое исследование проводили с помощью микроскопа Zeiss Axioplan imaging2, оборудованного фотокамерой Zeiss AxioCam Hrc, и программного обеспечения AxioVision v.4.6.2. Иммуногистохимические реакции проводили по стандартной методике с термической демаскировкой антигенов. В качестве первичных антител использовали антитела к рецепторам эстрогена (clone 1D5, Dako, Denmark, ready-to-use), к рецепторам прогестерона (clone 636, Dako, Denmark, ready-to-use), к белку PAI-1
(clone H-135, разведение 1:100, SantaCruz, USA), к белку VEGF-A (разведение 1:100, Abbiotec, USA), к белку LIF (разведение 1:100, Sigma, Sweden), к коллагену I типа (polyclonal rabbit antibody, 1:500, GeneTex, USA), к коллагену III типа (polyclonal rabbit antibody, 1:1000, GeneTex, USA), к белку MMP-2 (polyclonal rabbit antibody, 1:200, Abbiotec, USA), к белку MMP-9 (polyclonal rabbit antibody, 1:200, Abbiotec, USA), к белку fibronectin (rabbit antibody, 1:100, Dako, Denmark), к белку lamininВ2 gamma1 (mouse monoclonal antibody, 1:200, GeneTex, USA). Оценку результатов иммуногистохимических реакций проводили количественными и полуколичественными методами.
Степень достоверности и апробация результатов
Научные положения, описанные данные, выводы и рекомендации, сформулированные
в работе, базируются на клинико-морфологическом исследовании 81 больной с
первичным бесплодием неясного генеза. Дизайн исследования включал клиническую
оценку исследуемых, а также морфологическое исследование с применением
современных методов. Исследование проводилось с использованием современных
методик морфологического исследования, а именно иммуногистохимического
исследования и морфометрического исследования с использованием специального
программного обеспечения. В работе использовано 11 специфических
иммуногистохимических маркеров; иммуногистохимические реакции проводились на базе ФГБУ НЦАГиП им. В.И.Кулакова МЗ РФ с 2012 по 2014 гг, где автор был соисполнителем. Также проанализированы результаты ранее проведенных в ООО «Бюро патологии гемостаза» (2010-12 гг.) генетических исследований – исследованы мутации и полиморфизмы 17 генов свертывающей системы крови. Полученные данные были статистически обработаны в лицензионной программе IBM SPSS Statistics 22 (IBM, США) с использованием непараметрических методов оценки результатов.
Апробация диссертации состоялась на конференции кафедры патологической анатомии им. акад. А.И. Струкова ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова (Сеченовский Университет) Минздрава России 18 января 2017 г.
Результаты исследования докладывались и обсуждались на 25 международном конгрессе Европейского общества патологов (Лиссабон, Португалия, август-сентябрь 2013 г.) и на IV съезде Российского общества патологоанатомов (Белгород, июнь 2013 г.).
Внедрение результатов в практику
По результатам исследования разработана и внедрена в использование в ФГБУ НЦАГиП им. В.И.Кулакова МЗ РФ диагностическая панель маркеров, необходимых для
оценки рецептивности эндометрия у женщин с нДСТ и НТ: ER, PgR, LIF, PAI-1, VEGF, MMP-2, laminin, collagen 1, 3.
Личный вклад автора
Клинико-морфологический анализ, морфологическая, иммуногистохимическая часть работы, а также статистическая обработка и обобщение полученных результатов выполнены лично автором. Автор принимал непосредственное участие в анализе результатов клинического обследования, а также в анализе результатов молекулярно-генетического исследования.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 5 научных трудов, из них 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК и индексируемых в базе данных SCOPUS, 1 работа опубликована в зарубежном журнале
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Основные научные положения соответствуют паспорту специальности 14.03.02 –
патологическая анатомия, а именно области исследований: «Исследование
патогенетических механизмов развития заболеваний в целом и отдельных их проявлений (симптомы, синдромы), создание основ патогенетической терапии».
Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 126 страниц машинописного текста, в том числе 9 страниц списка литературы. В работе использовано 9 таблиц, 57 рисунков. Проанализировано 147 источников литературы, в том числе 24 отечественных и 123 зарубежных.
Нарушения рецептивности эндометрия при наследственных тромбофилиях
Рецепторы к эстрогену (ER) и прогестерону (PR) являются ядерными белками, регулирующими транскрипцию определенных генов. Существует два типа ER: ER экспрессируется в основном в матке, яичниках, гипофизе, почках, надпочечниках, яичках и их придатках, а ER — в предстательной железе, мочевом пузыре, костях, головном мозге, яичниках (клетки гранулезы) и яичках (развивающиеся спермадиты). Существует также две изоформы PR — PR и PR.
Количество эстрогеновых и прогестероновых рецепторов изменяется на протяжении менструального цикла. В ранней пролиферативной фазе ER и PR отсутствуют в железистом эпителии, но оба рецептора экспрессируются в стромальных клетках. Образование PR обеспечивается предовуляторным подъемом Е2. Существует значительная разница между количеством рецепторов в периовуляторный и периимплантационный периоды [68].
На мышиной модели показано, что для ранних стадий развития эмбриона обязательно необходимо наличие эстрогеновых рецепторов альфа (ER) и PR. У мышей с нокаутным геном ER не происходит адгезия бластоцисты [69], а у мышей, нокаутных по PR, наблюдалась рефрактерность по отношению к искусственным стимулам, которые должны приводить к децидуализации эндометрия (deciduogenic stimulus) [70].
Деление клеток эндометрия в ответ на повышение уровня эстрогенов обусловлено связыванием эстрогенов с ER. При этом связывание ER с эстрадиолом приводит к формированию комплекса ER-C/EBP, который активирует промотор 17--гидроксистероиддегидрогеназы, важного фермента метаболизма стероидных гормонов [71]. CCAAT/enhancer-binding protein – C/EBP – является транскрипционным фактором, принадлежащих семейству основных ДНК-связывающих белков с наличием последовательности аминокислот по типу «лейциновой молнии», который регулирует транскрипцию консервативных последовательностей ДНК, известных как CCAAT box, в области промотора. Многочисленные исследования показали, что C/EBP является ключевым регулятором пролиферации и/или дифференцировки во многих тканях, включая яичник, яички, печень, жировую ткань, иммунную систему, клетки кожи и молочной железы.
Показано, что у мышей, нокаутных по гену транскрипционного фактора C/EBP (CCAAT/enhancer-binding protein), пролиферация эндометрия в ответ на экзогенное введение эстрогенов значительно снижена, однако полностью не подавлена. Экспрессия эстроген- и прогестерон-регулируемого гена лактотрансферрина остается на обычном уровне. Таким образом, снижение пролиферации эндометрия у C/EBP-нокаутных мышей связана именно с отсутствием экспрессии и функционирования C/EBP и стоящих за ним таргетных генов при сохранении чувствительности к эстрогенам. Точные механизмы, за счет которых C/EBP опосредует пролиферативный сигнал эстрогенов, остаются неизвестными. Показано, что при регенерации печени C/EBP необходим для нормальной пролиферации гепатоцитов. В гепатоцитах животных, нокаутных по C/EBP, была значительно снижена экспрессия циклинов B и E, что указывает на связь этого транскрипционного фактора с белками клеточного цикла.
Эстроген-индуцированная экспрессия C/EBP носит транзиторный характер и снижается через 3 часа после введения препарата эстрогенов. Неизвестно, какое влияние этот пик экспрессии оказывает на имплантацию. Однако, возможно, что сигнальный путь, запускаемый транскрипционным фактором C/EBP, участвует в процессе дифференцировки эпителиальных клеток, что позволяет им взаимодействовать с поверхностью бластоцисты или посылать сигналы в строму. В отличие от клеток эндометрия, экспрессия C/EBP в стромальных клетках продолжает расти на протяжении всей фазы децидуализации при беременности. Исключительная роль C/EBP в процессе децидуализации подтверждается тем, что у мышей, нокаутных по гену C/EBP, матка абсолютно рефрактерна к стимулам, вызывающим децидуализацию у нормальных животных, а таже толерантна даже к действию экзогенных стероидов.
Показано, что экспрессия C/EBP опосредована комплексным влиянием эстрогенов и прогестерона. Так, введение прогестерона овариэктомированным мышам индуцировало синтез C/EBP в матке, а RU486, антагонист PR, подавлял экспрессию C/EBP. Путем компьютерного моделирования показано, что в 5 -регуляторном участке C/EBP обнаруживаются многочисленные ER-(EREs) и PR-элементы (PREs).
C/EBP известен как регулятор различных генов, включая гены воспалительного ответа, кодирующие цитокины и их рецепторы, а также белки острой фазы воспаления. Поскольку для успешной имплантации необходим целый каскад противовоспалительных реакций, возможно, экспрессия этого транскрипционного фактора в децидуальной ткани регулирует функцию клеток иммунной системы во время беременности [72].
Анализ маток мышей, нокаутных по гену C/EBP, показал, что потеря этого транскрипционного фактора приводит к остановке клеточного цикла на границе G2-M. Было показано, что C/EBP в матке контролирует экспрессию многих молекул, регулирующих клеточный цикл, включая циклины B1 и B2, 25 гомолог С фосфатазного цикла клеточного деления, ингибиторы клеточного цикла p21, p27 и p53, каждый из которых контролирует переход G2-M.
Нарушения рецептивности эндометрия при синдроме нДСТ
Исследовались выписки из медицинских карт пациенток, включавшие в себя следующие данные: паспортные данные, жалобы, анамнестические данные. Анамнестические данные включали в себя наследственность (до 3 колена), информацию о менструальной функции (время менархе, длина цикла. длительность и регулярность менструаций), репродуктивной функции (количество беременностей в целом, замерших беременностей, родов, медицинских абортов, выкидышей во 2 триместре, внематочных беременностей в анамнезе), проведенных ранее циклах IVF – ЭКО и ИКСИ (общее число протоколов, число неудачных протоколов, исход каждого удачного протокола), данные физикального исследования, результаты исследования системы гемостаза (уровни PAI-1 и гомоцистеина в сыворотке крови, результаты метионинового теста, результаты генетического исследования – полиморфизм или мутации следующих генов: FII, FV (Leiden), FVII, FXII, FXIII, GpIa, GpIb (-5), GpIb (T145M), GpIIIa, PAI-1, FBGb, MTHFR, MTRR, MTR, SLC19A1, ангиотензиногена (M235T и Т145М), ангиотензин-превращающего фермента, их гомо- или гетерозиготность).
Результаты генетического исследования каждой из пациенток предоставлены ООО "Гематологический кабинет доктора Димитрия Колосовского" и лично руководителем организации Колосовским Д.Ю. Диагноз НТ ставился при выявлении мутаций в исследуемых генах в соответствии с клиническими рекомендациями Американской коллегии торакальных врачей по антитромботической и тромболитической терапии [27; 28].
Бальную оценку выраженности симптомов нДСТ проводили в соответствии с руководством Т.И.Кадуриной [126] ввиду более подробной разбалловки признаков по сравнению с работой Т.Ю.Смольновой [127]. Кроме того, в работе Т.Ю.Смольновой не указано, сколько минимально баллов необходимо для постановки диагноза нДСТ, а также не учтены изменения сердца и крупных сосудов. Поскольку в руководстве Т.И.Кадуриной приведен широкий спектр инструментальных и лабораторных показателей, многие из которых невозможно выявить в рамках обычного физикального исследования, то сумма баллов, необходимая для постановки диагноза нДСТ, была снижена до 7 баллов.
Данные о каждой пациентке заносились в таблицу, сделанную в редакторе Microsoft Excel, для дальнейшей обработки.
От каждой пациентки, отобранной в исследование, использовались пайпель-биоптаты эндометрия, взятые в период «окна имплантации» (6-8 день после овуляции по данным УЗИ). Материал, полученный от пациенток, фиксировался в 10% нейтральном формалине с фосфатным буфером, обрабатывался в аппарате гистологической проводки тканей фирмы «Pool Scientific Instruments» (Швейцария) и заливался в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала, как правило, не превышало 48 часов. Затем с каждого блока готовилось 25 ступенчатых парафиновых срезов толщиной 4–5 мкм, которые фиксировали на предметные полилизиновые стекла (Mаinzel Glаser, Polylisine, Германия) и инкубировали в термостате при температуре 37С в течение 12 часов. Далее срезы депарафинировали и регидратировали последовательно в ряде растворов, состоящем из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 2-х 95% спиртов, 80% и 70% спирта и дистилированной воды. По препарату от каждого случая окрашивали гематоксилином и эозином. Также препараты окрашивали толуидиновым синим, пикрофуксином по Ван Гизону по общепринятой методике.
Морфометрическое исследование проводили с помощью микроскопа Zeiss Axioplan imaging2, оборудованного фотокамерой Zeiss AxioCam Hrc и программного обеспечения AxioVision v.4.6.2. Морфометрическое исследование проводили в несколько этапов. 1. Каждый биоптат представляет собой срез некоторого количества кусочков эндометрия, которые расположены в определенном порядке друг относительно друга, и их расположение в серийных срезах меняется незначительно. Поэтому для каждого случая (серии срезов) на отдельном листе бумаги была нарисована схема расположения кусочков в препарате, каждый кусочек был пронумерован (рис. 2.2, в). 2. Проводилась фотосъемка каждого из кусочков на наиболее удобном для этого увеличении (самые крупные кусочки – на увеличении х25, самые мелкие – на х400), с помощью ПО AxioVision v.4.6.2 оценивалась площадь этого кусочка: кусочек обводился в программе, а программа автоматически (для каждого увеличения был стандартизованный масштаб) подсчитывала его площадь в квадратных микронах. При этом кусочком, который должен был подвергнуться оценке площади, считался фрагмент эндометрия, содержащий как строму, так и железистый эпителий;
Протокол морфометрического исследования. I - лицевая сторона, II - оборотная сторона. а - фамилия пациентки, б - группа пациентки, в - схема расположения кусочков в препарате, каждому кусочку присвоен номер, г - площадь очагов склероза, выявленных в соответствующих кусочках; записано по схеме номер кусочка - увеличение, на котором производилось измерение - площадь очага склероза в мкм2 , д - выявленные площади экспрессии коллагенов 1 и 3 типов в очагах склероза, их сумма, е - расчеты, ж - площадь кусочков эндометрия, записано по схеме, аналогичной в п. г, з - условные линии, необходимые для измерения площади больших кусочков скопления исключительно желез, без стромы, не учитывались, равно как и фрагменты стромы, лишенные желез. Если кусочек был настолько большим, что не попадал целиком в поле зрения даже на увеличении х25, то он условно делился на 2 или 3 части воображаемыми прямыми линиями (рис. 2.2, з), которые фотографировались отдельно, и вычислялась площадь каждой части отдельно, потом они суммировались. После чего площадь каждого кусочка эндометрия, вошедшего в срез, записывалась в протокол; после подсчета площади всех фрагментов они суммировались и выявлялась площадь препарата (рис. 2.2, ж). 3. При окраске пикрофуксином по Ван Гизону выявлялись очаги склероза в эндометриальной строме. Их площадь тоже подсчитывалась.
Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы нДСТ (группа №1)
Для оценки рецептивности эндометрия морфологическому исследованию подвергали эндометрий в период «окна имплантации». В группе контроля в 22% случаев обнаружили признаки ранней стадии фазы секреции – в железистом эпителии эндометрия определяется множество базально расположенных вакуолей, при этом апикальный край клеток все еще ровный, строма компактная, ядра фибробластоподобных клеток – округлой формы, относительно крупные, фибробластоподобные клетки располагаются в густой сети ретикулиновых волокон. В 78% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для средней стадии фазы секреции – железы извитые с широким просветом, ядра везикулярные, располагались базально, апикальный край клеток неровный с признаками апокринной секреции в просвет желез, с образованием пиноподий – микропротрузий диаметром около Рис.3.1. Пиноподии в поверхностном эпителии эндометрия в группе контроля. Окраска гематоксилином и эозином, х630.
Эндометрий в группе контроля. Окраска толуидиновым синим, х630. 6 мкм в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия, экспрессирующих на своей поверхности ряд белков, необходимых для адгезии бластоцисты к поверхности эндометрия, а также признаки васкуляризации и отека стромы (рис. 3.1). При этом зрелые пиноподии отсутствовали на поверхности эпителиоцитов эндометрия лишь в 22% случаев. Средний процент поверхностного эпителия эндометрия, покрытого зрелыми пиноподиями, составил 13%. В строме эндометрия ни в одном из случаев не было выявлено патологических изменений.
При окраске толуидиновым синим во всех исследованных случаях эндометрий полностью окрасился в синий цвет, феноменов метахромазии выявлено не было (рис. 3.2). При окраске пикрофуксином по Ван Гизону очагов склероза также не было выявлено ни в одном случае.
При иммуногистохимическом исследовании маркеров рецептивности эндометрия получены следующие результаты. При исследовании маркера рецептивности LIF выявляли его экспрессию в цитоплазме поверхностного и железистого эпителия эндометрия, в пиноподиях и в цитоплазме клеток стромы эндометрия, при этом наиболее важной считалась экспрессия LIF в пиноподиях поверхностного эпителия эндометрия. Обнаружена высокая экспрессия маркера рецептивности LIF в поверхностном эпителии эндометрия (средний балл экспрессии – 4,67) при незначительной его стромальной экспрессии (рис. 3.3). Эстрогеновые и прогестероновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия. Во всех случаях стромальный прогестерон-эстрогеновый индекс (СПЭИ) был в пределах между 2 и 4.
При исследовании VEGF отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы эндотелия сосудов эндометрия. Экспрессия сосудисто-эндотелиального фактора роста в эпителии, фибробластах и макрофагах стромы, эндотелии была умеренной либо незначительной (средний балл экспрессии 1,17, 0,5 и 2,67 для эпителия, клеток стромы и эндотелия соответственно). При исследовании маркера PAI Рис.3.3. Экспрессия LIF в эндометрии в группе контроля, х400.
Экспрессия ММП-2 в эндометрии в группе контроля, х400. 1, играющего важную роль в механизмах гемостаза и фиброгенеза, отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы и эндотелия сосудов эндометрия. В контрольной группе отмечали очень слабую экспрессию PAI-1 в эпителии, строме и эндотелии сосудов эндометрия (средний балл экспрессии – 1,05, 0,5 и 0,1 для эпителия, стромы и эндотелия соответственно, рис. 3.4).
При исследовании коллагенов 1 и 3 типа в группе контроля отмечали их экспрессию в волокнистом компоненте стромы эндометрия. Экспрессия коллагена 1 типа либо отсутствовала, либо была слабо выраженной во всех случаях. При этом отмечалась выраженная либо умеренная экспрессия коллагена 3 типа в волокнистом компоненте эндометриальной стромы (рис. 3.5).
При исследовании ММР-2 и ММР-9 отмечали их экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы, эндотелия сосудов эндометрия. Экспрессия ММР-2 была умеренной в эпителии, строме и эндотелии эндометрия (средний балл экспрессии 3,0, 3,6 и 1,6 для эпителия, стромы и эндотелия соответственно, рис. 3.6). Экспрессия ММР-9 также была умеренной во всех компонентах эндометрия (средний балл экспрессии 3,8, 2,8 и 2,0 для эпителия, стромы и эндотелия соответственно). Экспрессия фибронектина отмечалась в волокнистом компоненте стромы и в компонентах сосудистой стенки. В строме и эндотелии сосудов была одинаково высокой (средний балл экспрессии 5,0 и 5,2 для стромы и эндотелия соответственно). Экспрессия ламинина отмечалась в цитоплазме клеток, преимущественно, около цитоплазматической мембраны. В эпителии она была умеренной, в строме и эндотелии была назначительной (средний балл экспрессии 3,8, 1,2 и 1,4 для эпителия, стромы и эндотелия соответственно)
Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы нДСТ (группа №1) На основании выписок из медицинских карт пациенток группы контроля были получены следующие данные: пациентки имели жалобы на невозможность забеременеть, в течение не менее года половой жизни (жалобы на бесплодие – как первичное, так и вторичное), в 46% случаев имели отягощенный анамнез по синдрому нДСТ, менструальная функция у всех пациенток была нормальной. У 13 пациенток, включенных в группу, суммарно в анамнезе была 31 беременность, из них родами завершились 19 беременностей (61,3%), 9 беременностей было замерших (29,0%), остальные завершились либо выкидышем на более поздних сроках, либо медицинским абортом на малых сроках, протоколы IVF у пациенток в этой группе не проводились. При физикальном исследовании у всех пациенток, включенных в группу, были выявлены признаки синдрома нДСТ. Наиболее распространенными были следующие признаки: 8 человек (61,3%) имели варикозное расширение вен различных степеней тяжести (С1-С3 по классификации СЕАР), 7 человек (53,8%) имели миопию, чаще всего – легкой и средней степени тяжести, по 6 человек (46,2%) имели плоскостопие и гипермобильность суставов, 5 человек (38,5%) имели пролапс митрального клапана (рис. 3.7). Показатели системы гемостаза каждой из пациенток были в пределах референсных значений. Генетическое исследование показало отсутствие большинства мутаций и полиморфизмов исследуемых генов факторов свертывающей системы крови. В некоторых случаях выявлялись полиморфизмы гена белка PAI-1, который, помимо своих антифибринолитических свойств, отвечает и за фиброгенез. Исследовали структуру полиморфизов гена PAI-1, среди 13 пациенток выявлено 2 с гомозиготным полиморфизмом 4G/4G, 4 – с гетерозиготным полиморфизмом 4G/5G и 7 – без полиморфизма, 5G/5G.
Клиническая, морфологическая и иммуногистохимическая характеристика группы НТ+нДСТ (группа №3)
В результате нашего исследования установлен морфологический субстрат нарушений рецептивности эндометрия при НТ и нДСТ. При НТ и нДСТ+НТ выявлены признаки отставания процессов созревания эндометрия: в этих группах фаза менструального цикла не соответствовала морфологическим изменениям в эндометрии. При этом существенно чаще встречались очаговый склероз стромы эндометрия и расстройства микроциркуляции: очаговые кровоизлияния в строме, сладж и тромбоз в микрососудах, которые и являются непосредственной причиной снижения трофики эндометрия и, как следствие, снижения его рецептивности. Кроме того, при нДСТ и НТ средний процент зрелых пиноподий на поверхности эндометрия был существенно ниже. При нДСТ основная роль в патогенезе нарушений рецептивности эндометрия отводится процессам дезорганизации соединительной ткани (мукоидное набухание, фибриноидный некроз) и нарушению процессов ремоделирования стромы (замедление процессов замещения коллагена 3 типа коллагеном 1 типа в очагах склероза) и ангиогенеза, что приводит к повышению частоты развития очагового склероза стромы эндометрия.
Нарушенная рецептивность эндометрия в группах с нДСТ, НТ и их сочетанием проявлялась частым отклонением СПЭИ от нормальных значений. Также в группах пациенток с НТ и нДСТ+НТ отмечено перераспределение экспрессии LIF из эпителия в строму, а также более выраженная экспрессия PAI-1 и VEGF в эпителии и строме.
Очаги склероза, по нашему мнению, являются результатом рубцевания мелких очагов некроза. Эти очаги некроза имеют двоякую природу: при нДСТ они являются проявлением процессов дезорганизации соединительной ткани (фибриноидный некроз), в то время как при НТ они являются следствием микроинфарктов.
При пайпель-биопсии в биоптат попадает лишь функциональный слой эндометрия, который отторгается каждый месяц, при этом на формирование полноценного рубца также уходит около месяца, поэтому возникает вопрос: почему при наследственных тромбофилиях, для которых характерно формирование очагов склероза как исход микроинфарктов стромы эндометрия, в функциональном слое можно найти очаги фиброза? Предложена следующая версия: во-первых, при наследственных тромбофилиях при множественных мутациях и полиморфизмах генов, отвечающих за различные аспекты процессов гемостаза, микроинфаркты стромы формируются как в функциональном, так и в базальном слоях, во-вторых, во время стадии пролиферации формирование функционального слоя происходит в результате пролиферации эпителия и стромы базального слоя, что, в свою очередь приводит к перемещению заживающих очагов некроза в функциональный слой, при этом перемещение в функциональный слой будет не обязательно на следующий цикл. Таким образом, в очагах склероза должна быть незрелая соединительная ткань, содержащая большое количество коллагена 3 типа, что было подтверждено нашим исследованием.
В патогенезе нарушений рецептивности эндометрия одну из основных ролей играют наследственные тромбофилии. Многочисленные тромбозы микроциркуляторного русла эндометрия, несмотря на усиленный ангиогенез, проявляющийся увеличением количества новообразованных сосудов, а также повышенной экспрессией VEGF, приводят к развитию множественных микроинфарктов и, как следствие, очаговому склерозу стромы и нарушению трофики эндометрия, что проявляется замедлением процессов созревания эндометрия: к периоду «окна имплантации» эндометрий приходит в состоянии ранней секреции или даже пролиферации, с очень незначительным количеством зрелых пиноподий, на которых в недостаточном объеме экспрессируются молекулы, необходимые для адгезии и инвазии бластоцисты (например, LIF), что, в конечном счете, приводит к невозможности инвазии бластоцисты и развитию бесплодия.
При сочетании нДСТ+НТ и нДСТ выявлено большее содержание коллагена 3 типа в очагах склероза по сравнению с НТ, что говорит о замедлении процессов ремоделирования стромы в целом, в том числе и при ишемическом поражении, обусловленном НТ. Замедление ремоделирования стромы, помимо всего прочего, проявляется и замедлением ангиогенеза, что подтверждается снижением экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста. Замедление ангиогенеза способствует снижению трофики эндометрия и, тем самым, способствует росту очагов склероза стромы эндометрия, также поддерживаемому высоким уровнем экспрессии профиброгенного фактора, что приводит к затруднению восстановления микроциркуляции после гипоксических повреждений, что в свою очередь, еще сильнее усиливает ишемическое повреждение стромы эндометрия при дисциркуляторных расстройствах. Наличие такого порочного круга ведет к относительной ишемии, которая снижает кровоснабжение и трофику, а, следовательно, и функциональную активность, эпителия эндометрия, тем самым существенно снижает рецептивность эндометрия и вероятность имплантации яйцеклетки.