Репаративные и предраковые процессы при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки Ли Цзяцзин

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1. Эпидемиология РШМ 12

1.2. Этиология РШМ 13

1.3. Патогенез РШМ 16

1.3.1 Роль ВПЧ в канцерогенезе РШМ 16

1.3.2 Роль раковых стволовых клеток в канцерогенез РШМ 20

1.4. Морфологическая характеристика предрака и рака шейки матки 24

1.4.1. Зона трансформации шейки матки – ниша стволовых клеток шейки матки 24

1.4.2. Классификация предрака шейки матки 26

1.4.3. Сфероидные структуры 27

1.5. Методы морфологической диагностики, ВПЧ-тестирование, кольпоскопия и скрининг РШМ 29

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 46

2.1.Материал исследования 46

2.2. Методы исследования 49

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 55

3.1. Ранняя диагностика ВПЧ-ассоциированных рака и предрака шейки матки у женщин до 30 лет и старше 55

3.2. Определение эффективности комплексной диагностики предрака и рака шейки матки с использованием: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания p16/Ki67 и ПЦР-НВ 66

3.3. Изучение репаративных, неопластических и раковых сфероидных структур при ВПЧ-ассоциированном предраке и раке шейки матки: морфологические и иммунофенотипические особенности 80

Заключение 114

Выводы 122

Список литературы 124

• Патогенез РШМ
• Методы морфологической диагностики, ВПЧ-тестирование, кольпоскопия и скрининг РШМ
• Определение эффективности комплексной диагностики предрака и рака шейки матки с использованием: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания p16/Ki67 и ПЦР-НВ
• Изучение репаративных, неопластических и раковых сфероидных структур при ВПЧ-ассоциированном предраке и раке шейки матки: морфологические и иммунофенотипические особенности

Патогенез РШМ

Гистологическое исследование шейки матки - это высокоинформативный способ диагностики самых различных патологий шейки матки. Несмотря на то, что он может потребовать временных затрат (процесс проведения биопсии и лабораторные исследования тканей в течение 10-14 дней), данная диагностическая методика отличается рядом существенных преимуществ, позволяющих выявлять патологии уже на ранних стадиях и с высокой точностью определять вид новообразований.

По результатам гистологического исследования врач может сделать выводы о состоянии эпителиальной ткани шейки матки: имеются ли изменения клеток и какой характер они носят.

Исторически сложилось, что выраженность патологических изменений в интраэпителиальных плоскоклеточных поражениях характеризуется уровнем дезорганизации эпителия и цитологическими изменениями. Многие из этих изменений возникают в результате инфицирования ВПЧ, следствием которого является гиперхромия и увеличение размера ядер, изменение ядерной мембраны и койлоцитоз. Выраженность патологических изменений определяется глубиной поражения эпителия, дискариотическими клетками базального и парабазального типа.

В настоящее время исследования направлены на изучение рака и предрака шейки матки на ультраструктурном и генетическом уровнях. В литературе описано достаточно большое количество регулирующих генов, участвующих в инициации и развитии рака шейки матки. В связи с тем, что данная патология может рассматриваться как результат поломки реализации нормальной генетической информации, многие ученые исследуют рак шейки матки с помощью молекулярных методов.

В работах, посвященных раку шейки матки, многие исследователи подробно изучают регулирование механизмов пролиферации и апоптоза при ВПЧ-инфекции. Нарушения в данных программах при РШМ описывается многими авторами. Апоптоз является запрограммированной гибелью клеток, которая предполагает наличие специфической программы, осуществляющей контроль за клеточной смертью, при нарушении которого нарушается и гомеостаз [41]. Целью апоптоза является регуляция численности и функционирования клеток, большую роль в которых играют межклеточные взаимодействия, благодаря которым клетки вступают на разные стадии жизненного цикла (деление, рост, дифференцировка) и путь гибели клетки [6]. Наиболее изученными регуляторами апоптоза и пролиферации в шейки матки являются p53, p16, с-mус (регулятор клеточного цикла) и др.

Ген р53 расположен в хромосоме 17р13.1 и является наиболее распространенным участком генетических повреждений в процессе канцерогенеза. Ген р53 принимает участие в процессах репликации ДНК, пролиферации и гибели клеток. В то время, когда клетка подвергается действию мутагенных агентов, р53 стабилизируется и накапливается в ядре, в результате чего создает препятствие распространению в ткани генетически поврежденных клеток. Кроме того, в мутантных клетках р53 включает апоптоз, в то время как накопленный дикий тип р53 способен связываться с ДНК и вызывать задержку клеточного цикла в фазе G1, что способствует репарации ДНК в зонах генетических повреждений.

Онкобелок р53 локализуется в цитоплазме, митохондриях и ядре, может связываться с генами, активность которых регулируется с помощью процессов фосфорилирования, ацетилирования, метилирования и убиквитирования.

Ген р16 (CDKN2A, MTS1, INK4A) влияет на процесс пролиферации и дифференцировки клеток и является одним из основных регуляторов активности белка RB1, он препятствует переходу клетки в S-фазу клеточного цикла. Отсутствие экспрессии белка р16 или его инактивация приводят к потере клеткой контроля над клеточным циклом. Ген р16 является маркером, необходимым для обнаружения повышенного риска перехода. В настоящее время высокая экспрессия онкобелка р16 используется в качестве одного из самых ранних показателей в диагностике рака шейки матки.

Процессы регуляции роста и клеточного метаболизма тесно взаимосвязаны. Онкоген с-Мус является «главным регулятором», который контролирует многие аспекты обоих этих процессов. Изменения обмена веществ, происходящие в трансформированных клетках, многие из которых приводятся в движение с-Мус избыточной экспрессией, необходимы для поддержания метаболических процессов на фоне повышенной потребности в нуклеиновых кислотах, белках и липидах, необходимых для быстрой клеточной пролиферации. В то же время, суперэкспрессия c-Myc приводит к соответствующим изменениям на уровне экспрессии семейств генов, благодаря которым увеличивается интенсивность пролиферации клеток. Эта интересная двойственность эффектов с-Myc делает его ведущим фактором трансформационных изменений и придает ему очень важную роль в регулировании по принципу «трансформированный фенотип». Эффекты, вызываемые с-Мус, могут выступать либо в качестве «первичного онкогена», которые активируются путем амплификации или транслокации, либо быть результатом активации с-Мус другими онкогенами. В том и в другом случае полагают, что именно с-Мус играет центральную роль в поддержании изменений, которые происходят при трансформации клеток. Несмотря на попытки использовать с-Мус в качестве терапевтической мишени, положительных результатов получено не было, однако есть шанс, что это изменится в ближайшие несколько лет [80].

Гены (ALDH) семейства альдегиддегидрогеназы являются регуляторами процесса биосинтеза ферментов, которые участвуют в различных метаболических процессах в клетке. Некоторые ферменты альдегиддегидрогеназы вовлечены в процессы детоксикации веществ, таких как алкоголь, различные токсины, образующиеся в клетке. Конкретная роль ферментов альдегиддегидрогеназы заключается в изменении атомов оксидной, углеродной и водородной групп (совместно именуемые альдегидной группой), которые прикреплены к другим молекулам. Альдегидные группы могут оказывать положительное или отрицательное влияние на клетки и ткани в зависимости от молекулы, к которой они присоединены. Благодаря процессам, приводящим к изменению альдегидных групп, ферменты альдегиддегидрогеназы синтезируют молекулы, называемые никотинамидадениндинуклеотидфосфат и никотинамиддинуклеотид, которые необходимы для многих процессов, протекающих в клетке. Ген ALDH расположен в хромосоме 9q21, содержит 13 экзонов и состоит из 53103 азотистых оснований. ALDH является изоферментом, способным к окислению из ацетальдегида уксусной кислоты, присутствующей в тканевых и опухолевых стволовых клетках, которая необходима для их роста и дифференцировки.

Альдегиддегидрогеназа (ALDH 1) - это детоксифицирующий фермент, отвечающий за окисление ретинола в ретиноевою кислоту, которая играет роль в ранней дифференцировке стволовых клеток. Также является маркером раковых стволовых клеток. Когда Яо и др. оценили экспрессию ALDH1 в клетках цервикальной карциномы с помощью иммуногистохимического метода, то обнаружили, что в 23 из 89 образцов, в которых был представлен инвазивный плоскоклеточный рак, и 4 из 20 случаев аденокарциномы выявляется иммунореактивность к ALDH1. Они обнаружили более низкие уровни CD133 в HeLa, SIHA и CaSki цервикальных клеточных линиях, подобные результаты были получены Лопесом и др. [74, 75], что позволило определить ALDH1 в качестве маркера-идентификатора CSC и предположить, что в РШМ есть небольшая субпопуляция клеток, которая имеет фенотип раковых стволовых клеток [136].

Методы морфологической диагностики, ВПЧ-тестирование, кольпоскопия и скрининг РШМ

Цитологический и биопсийный материал использовали для генотипирования ДНК и выявления ВПЧ методом полимеразной цепной реакции в настоящем времени (ПЦР-НВ), которые проводили на приборе Cobas 4800, представляющем собой полностью автоматизированную систему, выдающую результат по трем отдельным каналам: индивидуально ДНК ВПЧ16, ДНК ВПЧ18 и общий пул ДНК других 12 высокоонкогенных генотипов ВПЧ (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) [32]. Главными преимуществами данного типа ВПЧ-тестирования являются обнаружение высокой вирусной нагрузки, имеющей клиническое значение и генотипирование, позволяющие выявлять группы женщин с высоким онкогенным риском, имеющих ДНК ВПЧ 16 и 18 типов.

Статистическая обработка накопленных данных, их группировка, построение графиков и диаграмм проводилось при помощи программ SPSS, Excel. Для сравнения экспрессии антител был использован метод непараметрической статистики для малых выборок - метод Манна-Уитни. Обработку результатов проводили с помощью ROC (receiver operating characteristic)-анализа [48]. ROC-кривая представляет собой график, позволяющий оценить качество выбранного метода, отображающий соотношение между долей верных положительных значений от общего числа положительных значений (истинно положительное значение, называемое чувствительностью метода), с долей ошибочных положительных значений от общего числа отрицательных значений (ложно положительный результат (ЛПР), величина (1-ЛПР) называется специфичностью метода). Количественную интерпретацию ROC дат показатель AUC (area under ROC curve, площадь под ROC-кривой) — площадь, ограниченная ROC-кривой и осью доли ложных положительных значений. Чем выше показатель AUC, тем качественнее метод, при этом значение 0,5 демонстрирует непригодность выбранного метода.

Так же проводили морфометрию с помощью программы cellSens Standard. Измеряли глубину инвазии (Рис.1) при микроинвазивной карциноме и площади СЭМС. Программа cellSens Standard включает в себя комплексный подход, позволяющий плавно и быстро перейти от исходного изображения к анализу и заключению всего за несколько простых шагов. Даже такие продвинутые функции, как деконволюция несмешиваемость и представление данных являются быстрыми и интуитивными. На первом этапе исследования, после проведения цитологического исследования мазков из цервикального канала пациентам поставили диагнозы: 21 H-SIL (5 женщин до 30 лет и 16 после 30 лет), 23 L-SIL (10 и 13 соответственно), 15 ASC-US (7 и 8 соответственно) и 32 NILM, (13 и 19 соответственно).

При цитологическом анализе мазков с диагнозом H-SIL обнаружили крупные комплексы разрозненно лежащих атипичных клеток плоского эпителия полиморфного вида с резко выраженным дискариозом, а также фигурами митозов (рис.2). В L-SIL выявили клетки плоского эпителия с легким дискариозом в сочетании с наличием сохранных зрелых клеток парабазального и поверхностных слоев (рис.3). У женщин с ASC-US-R наблюдали отдельные небольшие группы клеток плоского эпителия с укрупненными и гиперхромными ядрами на фоне явлений воспаления (рис.4). В ASC-US-H определили комплексы и отдельно лежащие атипичные клетки плоского эпителия с укрупненными и гиперхромными ядрами, подозрительными в отношении H-SIL. Мазки NILM содержали единичные койлоциты, лейкоциты, пласты плоского и цилиндрического эпителия с реактивными изменениями и явлениями лейкопедеза, атипичные клетки отсутствовали (рис.5). Рисунок 2. H-SIL, жидкостной цитологический мазок, окраска по Папаниколау, х400

Выявление ДНК ВПЧ с помощью Сobas 4800 теста и сравнение полученных результатов с гистологическим заключением.

Далее проводилось выявление ДНК ВПЧ в цитологическом материале с помощью Сobas 4800 теста и сравнение полученных результатов с гистологическим заключением. Результаты ВПЧ тестирования приведены в таблице 1. В результате проведенных исследований ДНК ВПЧ обнаружили у 63 женщин из 91 (69,2%), из которых 35 женщин моложе 30 лет (71,4%) и 38 старше 30 лет (67,9 %). При этом, наличие ВПЧ при отсутствии атипичных клеток в 2 раза чаще у женщин 30 лет (69.2%) по сравнению с женщинами 30 лет (32.1%). Полученные результаты подтверждают данные других исследователей [63] о том, что ВПЧ чаще встречается у молодых женщин, что свидетельствует косвенно о наличии у молодых женщин транзиторной инфекции. В материале с диагнозом NILM выявили ДНК ВПЧ в 15 образцах из 32 (46,9%). При этом в 9 образцах из 13 в группе пациенток 30 лет и в 6 из 19 (31,6%) в группе пациенток 30 лет.

В образцах с ASC-US положительный результат получили в 10 из 15 случаев: в 4 образцах из 7 в группе пациенток 30 лет и в 6 из 8 в группе пациенток 30 лет. По сравнению с NILM (46,9%) в мазках с ASC-US ДНК ВПЧ выявляется чаще (66,7%), что согласуется с вкладом данного инфекционного агента в развитие ЦИН. В образцах с диагнозом L-SIL ВПЧ тест был положительным в 19 случаях из 23 (82,6 %): в 8 образцах из 10 (80,0%) в группе пациенток 30 лет и в 11 из 13 ( 84,6%) в группе пациенток 30 лет. В мазках с H-SIL ДНК ВПЧ обнаружили в 19 образцах из 21 (90,5%): в 4 образцах из 5 (80,0%) в группе пациенток 30 лет и в 15 из 16 (93,8%) в группе пациенток 30 лет. Полученные результаты делают очевидным тот факт, что после 30 лет частота выявления ДНК ВПЧ коррелирует с увеличением степени развития ЦИН и цитологическим диагнозом (Диа.1).

Из диаграммы 1 видно, что при отсутствии атипичных клеток в исследуемых образцах шейки матки (NILM) в группе женщин до 30 лет ДНК ВПЧ выявляется чаще, чем у более взрослых женщин, что можно объяснить временным присутствием вируса в организме, то есть его транзиторным характером, это требует от врача только наблюдения и противовирусной терапии. Диаграмма 1 Частота выявления ДНК высокоонкогенных типов ВПЧ в различных возрастных группах.

Частота развития ЦИН зависит и от типа вируса, что подтверждают данные литературы [79]. Результаты нашего исследования вклада различных высокоонкогенных типов ВПЧ в развитие ЦИН представлены на рисунках 2,3. В развитие патологии шейки матки высокой степени выраженности (H-SIL) весомый вклад вносит ВПЧ 16 типа (Диа.2). Этот тип ВПЧ обнаружили у 9 из 15 (60,0%) пациенток старше 30 лет. У женщин моложе 30 лет с H-SIL одинаково часто 2 из 4 (50,%) выявляли суммарный пул двенадцати высоко онкогенных типов ВПЧ и ВПЧ 16 типа. У женщин с L-SIL моложе 30 лет чаще 5 из 8 (62,5%) выявляли двенадцать других высокоонкогенных типов ВПЧ. У пациенток старше 30 лет одинаково часто 5 из 11 (45,5%) выявляли суммарный пул двенадцати высокоонкогенных типов ВПЧ и ВПЧ 16 типа

Определение эффективности комплексной диагностики предрака и рака шейки матки с использованием: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания p16/Ki67 и ПЦР-НВ

РШМ является в настоящее время одним из самых распространенных злокачественных новообразований у женщин, занимая 7-е место среди всех злокачественных опухолей и 3-е место среди рака у женщин (после рака молочной железы и рака толстой кишки). РШМ составляет 9,8% от всех злокачественных опухолей у женщин [16]. Многолетними исследованиями установлено, что в этиологии предрака и рака шейки матки большое значение имеет ВПЧ, принадлежащий к семейству papova viridae и имеющий тропность к многослойному плоскому эпителию. [25]. Большинство ученых считают, что при ВПЧ-инфекции, в результате мутаций и эпигенетических модификаций, онкобелки Е6 и Е7 приводят к генетической нестабильности, вследствие чего запускается процесс канцерогенеза и развитие РШМ. [126]. ВПЧ был обнаружен практически в 99.8% случаев инвазивной карциномы шейки матки и более чем в 60% случаев (ЦИН). [127]. От момента первичной вирусной инфекции до появления рака шейки матки проходит достаточно длительный срок: 5–10 лет. Поэтому профилактику РШМ можно проводить с посредством ранней диагностики, правильного скрининга и вакцинации. В тех странах, где качество и распространенность скрининга высока, отмечается снижение частоты заболеваемости инвазивным раком шейки матки на 90% [5]. На сегодняшний день, маркры и методы для эффективной диагностики и скрининга РШМ, особенно для транзиторной инфекции, остаются спорными. Программы для скрининга рака шейки матки на основе цитологии показали снижение заболеваемости и смертности, вызванной этим новообразованием. [21]. Однако цитология обнаруживает большое количество пациентов с клеточными аномалиями, такими как ASC-US и L-SIL, с относительно низким риском, с поражениями высокой степени, в результате чего требуется дальнейшее обследование [60]. Хотя ВПЧ-тестирование показало свою эффективность в скрининге женщин с ASC-US и L-SIL. Было обнаружено, что большинство ВПЧ-инфекций носит транзиторный характер [83, 131]. Для эффективности скринингового теста и ранней диагностики РШМ необходимо найти методы с достаточной специфичностью, чувствительностью. Канцергенз РШМ в настоящем времени рассматривается с патологических ниш стволовой клетки и образованием раковых стволовых клеток, а также с образованием сфероидных структур in vitro и in vivo. Сфероидные структуры впервые были описаны в культурах стволовых клеток и активно используются в тканевых принтерах для воссоздания тканей. В 1992г., клетки выделенные из полосатого тела мышей, пролиферировали in vitro под воздействием фактора роста, путм образования сфероидных структур [98]. Похожие сфероидные эпителиально-мезенхимальные структуры, включающие раковые стволовые клетки обнаруживаются in vivо при предраке и раке у человека. Также было обнаружено формирование СЭМС в плоском эпителии при ВПЧ-ассоциированном хроническом цервиците и ЦИН, клетки которых экспрессируют маркер эмбриональных стволовых клеток Oct-4 [12].

Целью исследования явилось изучение патологических, морфологических и молекулярно-генетических особенностей процессов репарации и злокачественной трансформации шейки матки на фоне ВПЧ-инфекции. Для решения данного вопроса, были сформированы следующие задачи: 1) Сравнить чувствительность и специфичность цитологического метода и ВПЧ-тестирования методом полимеразной цепной реакции в настоящем времени (ПЦР-НВ) при ранней диагностике предрака и рака шейки матки у женщин до и после 30 лет. 2) Оценить чувствительность и специфичность комплекса методов ранней диагностики предрака и рака шейки матки у женщин: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания p16/Ki67 и ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ. 3) Оценить морфологические и иммуногистохимические характеристики СЭМС разных видов, обнаруженых при репаративных и предраковых ВПЧ-ассоциированных патологических процессов в шейке матки. 4) Определить наиболее значимые дифференциренциально-диагностические морфологические признаки и молекулярные маркеры репаративных и предраковых процессов на фоне ВПЧ-инфекции.

Научная новизна предлагаемой темы заключается в комплексном морфологическом и молекулярно-генетическом исследовании процессов репарации и предраковых изменениях эпителия при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки, включающей хронический цервицит, плоскую кондилому, ЦИН разной степени и микроинвазивный рак. Проведенное исследование показало, что канцерогенез и морфогенез ВПЧ-ассоциированного плоскоклеточного рака шейки матки - это многостадийный процесс, который связан с последовательным развитием структурных изменений, характеризующихся образованием Оct4-позитивных репаративных, неопластических и раковых СЭМС. Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и ЦИН II, характеризуются отсутствием клеточного атипизма и экспрессии р53, выявляется низкая экспрессия маркеров стволовости (ALDH, CD34, Vim) и онкомаркеров (P16, C-MYC), а также маркера гипоксии HIF-1. Неопластические СЭМС встречаются при ЦИН II и ЦИНII, их клетки характеризуются признаками клеточного атипизма и высокой экспрессией маркеров стволовости ALDH, CD34, Vim, онкомаркеров P16, C-MYC и маркера гипоксии HIF-1. Раковые СЭМС обнаруживаются в MSCC, нередко сливаются в крупные конгломераты, формируются вне зависимости от расположения сосудов. Они построены из раковых клеток и характеризуются высокой экспрессией маркеров стволовости (ALDH, CD34, Vim), онкомаркеров (P16, C-MYC, P53) и маркера гипоксии (HIF-1). Также в неопластических и раковых СЭМС определяются атипичные клетки, экспресирующие одновременно онкомаркеры и маркеры стволовости.

Наше исследование позволило найти эффективные методы для ранней диагностики, скрининга РШМ и выяснить связи СЭМС между канцерогенезом и раковыми стволовыми клетками.

С целью создания групп было проведено клинико-морфологическое исследование материала от 4672 женщин в возрасте от 17 до 56 лет (средний возраст 36,5±4.5 лет), проходивших обследование и лечение в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова» Минздрава РФ в 2013, 2014 и 2015 годах. Обследование всех 4672 женщин проводили по общепринятому протоколу - клинический осмотр, взятие мазков в SurePath виалы (BD, США), приготовление цитологических препаратов, окрашенных по Папаниколау, с помощью TriPath процессора (BD, США), оценка мазков по системе Bethesda [Solomon D., Davey D., Kurman R., 2002].

Изучение репаративных, неопластических и раковых сфероидных структур при ВПЧ-ассоциированном предраке и раке шейки матки: морфологические и иммунофенотипические особенности

Наше исследование позволило найти эффективные методы для ранней диагностики, скрининга РШМ и выяснить связи СЭМС между канцерогенезом и раковыми стволовыми клетками.

С целью создания групп было проведено клинико-морфологическое исследование материала от 4672 женщин в возрасте от 17 до 56 лет (средний возраст 36,5±4.5 лет), проходивших обследование и лечение в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова» Минздрава РФ в 2013, 2014 и 2015 годах. Обследование всех 4672 женщин проводили по общепринятому протоколу - клинический осмотр, взятие мазков в SurePath виалы (BD, США), приготовление цитологических препаратов, окрашенных по Папаниколау, с помощью TriPath процессора (BD, США), оценка мазков по системе Bethesda [Solomon D., Davey D., Kurman R., 2002]. В результаты были отобраны 3 группы женщин: 1) 91 женщина для оценки эффективности ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ и жидкостной цитологии при выявлении ВПЧ-ассоциированной цервикальной патологии у женщин до 30 лет и старше. 2) 148 женщин для оценки чувствительности и специфичности иммуноцитохимии с двойной окраской р16/Ki-67 при ВПЧ-ассоциированной цервикальной патологии. 3) 61 женщина для изучения морфологоческих и иммуногистологических особенностей СЭМС разных видов. Ткань фиксировали в 10% нейтральном формалине, готовили серийные парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином и использовали для иммуногистохимических реакций по общепринятым методикам (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004), В качестве первичных антител применялись моноклональные антитела к онкомаркерам -- P53 (RTU, клон DO-7 RTU, N158187-2, DAKO), C-Myc (clone Y69, Abcam), антитела для двойной окраски p16/Ki67 (CINtec PLUS cytology kit, Рош); антитела к маркерам гипоксии и ангиогенеза -- HIF1-alpha (клон 241812, R&D Systems), VEGF (clone EP1176Y, ab52917, Abcam), к маркерам стволовости - Oct-4 (MRQ-10, 309M-15,CELL MARQUE CORPORATION), Aldh1A1 (clone EP1933Y, cat. GTX61645, GeneTex), CD34 (Class II, clone QBEnd 10, DAKO), Vimentin (clone V9 RTU, DAKO), а также NF-kB (clone E379, Abcam). Ядра докрашивали гематоксилином. Ставились положительные и отрицательные контрольные реакции. Результаты оценивали по количеству окрашенных эпителиальных клеток СЭМС и прилежащего плоского эпителия в процентном соотношении из расчета на 300 клеток. Для статистического анализа, размерили глубину инвазии при MSCC и площади разных видов СЭМС с помощью программы cellSens Standard. Обработку результатов проводили с помощью ROC-анализа, также применяли непараметрический метод для малых выборок по Манну-Уитни. На первом этапе, оценивали диагностическую значимость ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ, жидкостной цитологии c РАР при ВПЧ-ассоциированной цервикальной патологии у женщин до 30 лет и старше. Обследовали цитологический, биопсийный, операционный материал от 91 пациентки, из которых 35 женщин были в возрасте до 30 лет и 56 пациенток старше 30 лет. Использовали методы ПЦР-НВ, жидкостной цитологии, гистологии и ИГХ р16(INK4A)/Ki67. Эффективность выявления ЦИН2+ у пациенток до 30 лет и старше 30 лет с использованием ДНК ВПЧ-тестирования составила: чувствительность - 81,8% и 90,5% , специфичность - 30,4% и 47,2 %; с использованием жидкостной цитологии: чувствительность - 45,5% и 71,4%, специфичность - 100,0% и 97,2 %.

Не втором этапе, оценивали эффективности двойного окрашивания p16/Ki67 в сочетании с жидкостной цитологией и ВПЧ тестированием при выявлении цервикальной интраэпителиальной неоплазии шейки матки. Обследовали цитологический и биопсийный материал 148 женщин с патологией шейки матки методами жидкостной цитологии, ИЦХ с двойной окраской р16/Ki67 и ВПЧ-тестирования. Максимальная эффективность цитологического метода была выявлена в случаях CIN 2 (чувствительность 96,97% и специфичность 100%), ВПЧ-тестирования —CIN 2 ( 97,14%, 50,0%), ИЦХ – CIN 2 ( 98,48%, 100,0%).

На третьем этапе, изучили морфологические и иммунофенотипические особенности СЭМС при ВПЧ-ассоциированном плоскоклеточном предраке и раке шейки матки. Проводили гистологическое исследование материала от 61 пациентки с цитологической и ПЦР диагностикой ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки: хронический цервицитом (15 женщин), ЦИН II (12 женщин), ЦИНII (25 женщин), и микро-инвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки (9 женщин). На серийных парафиновых срезах проводили иммуногистохимические реакции с моноклональными антителами к p53, C-Myc, HIF1-alpha, VEGF, NF-kB, Oct-4, Aldh1A1, CD34, Vimentin и антител для двойной окраски p16/Ki67. Обнаружены три вида Oct4 позитивных СЭМС: репаративные, неопластические и раковые, участвующие в репаративных процессах и опухолевом росте, соответственно. Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и L-SIL, формируются вблизи и на территории акантотических тяжей вокруг сосудов, в них отсутствует клеточный атипизм и экспрессия р53, наблюдается низкая экспрессия P16, C-MYC, ALDH, CD34, Vimentin. Неопластические СЭМС встречаются при L-SIL и H-SIL, формируются вне связи с сосудами, клетки обладают признаками клеточного атипизма и высокой экспрессии ALDH, CD34, Vimentin и онкомаркеров P16, C-MYC. Раковые СЭМС обнаруживаются в MSCC, нередко сливаются в крупные конгломераты, формируются вне зависимости от расположения сосудов, построены из раковых клеток и обладают высокой экспрессией P16, C-MYC, P53, ALDH, CD34 и Vimentin,.