Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. патогенез и патологическая анатомия лимфогенного метастазирования при раке желудка 12
1.1. Эпидемиология и классификации рака желудка .12
1.2. Лимфатическая система желудка. Особенности лимфогенного метастазирования рака желудка .17
1.3. Объем лимфодиссекции при раке желудка 23
1.4. Концепция сигнального лимфатического узла 25
1.5. Молекулярный патогенез рака желудка. Противоопухолевый иммунитет .28
1.6. Роль адгезивных молекул в развитии лимфогенных метастазов при раке желудка
1.6.1. Е-кадгерин 34
1.6.2. Галектин -3 35
1.6.3. Синдекан-1 .36
1.6.4. Ламинин .39
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования .42
Глава 3. Результаты собственных исследований. Морфологическая характеристика основной опухоли и лимфатических узлов .. 48
3.1 Морфологическая характеристика основной опухоли и сигнальных лимфатических узлов с метастазами 48
3.2 Морфологическая характеристика основной опухоли и сигнальных лимфатических узлов без метастазов .66
3.3 Морфологическая характеристика лимфатических узлов без опухолевой патологии 79
3.4 Сравнительная характеристика групп исследования. Статистический анализ полученных данных .85
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 100
Выводы 115
Практические рекомендации 117
Список литературы 118
- Лимфатическая система желудка. Особенности лимфогенного метастазирования рака желудка
- Галектин
- Морфологическая характеристика основной опухоли и сигнальных лимфатических узлов без метастазов
- Сравнительная характеристика групп исследования. Статистический анализ полученных данных
Введение к работе
Актуальность темы
Одним из самых распространенных онкологических заболеваний в мире является рак желудка (РЖ) (Ferlay J., Soerjomataram I., Ervik M. et al., 2012). Несмотря на снижение заболеваемости в последние десятилетия, показатель летальности на первом году после установления диагноза вырос, что связано с увеличением доли больных с IV стадией опухоли. В свою очередь, ранняя диагностика РЖ позволяет значительно улучшить выживаемость пациентов (Gotoda T., Sasako M., Ono H. et al., 2001).
Противоопухолевые иммунные реакции, по сути, аналогичны
трансплантационным. Появление в организме опухолевой клетки с трансформированными антигенами на поверхности закономерно вызывает ответную иммунную реакцию, основными клетками-эффекторами которой являются лимфоциты; состояние регионарных лимфоузлов и уровень лимфоидной инфильтрации опухоли традиционно рассматриваются как косвенное отражение показателей местного иммунитета при РЖ (Syrjnen K.J., Hjelt L.H., 1977; Фрейдлин И.С., 1998; Takeuchi H., Kitajima M., Kitagawa Y., 2008).
Известно, что взаимодействие клеток с окружающими структурами – клетками и межклеточным матриксом – является основой существования живой системы и необходимым условием поддержания тканевого гомеостаза. Прикрепление клеток друг к другу и к компонентам внеклеточного матрикса осуществляется с помощью адгезионных контактов. Способность к адгезии, как правило, снижается у клеток злокачественной опухоли, что увеличивает их способность к метастазированию (Tsanou E., Ioachim E., Briasoulis E. et al., 2004; Xi Y.X., Song X., Chen J. et al., 2007).
При выявлении злокачественной опухоли большое значение имеет возможность прогнозировать метастатический процесс, как по времени возникновения, так и по распространенности, что, в свою очередь, требует
выработки соответствующих критериев. Сложность выбора объема
оперативного вмешательства во многом определяется тем, что вероятность и очередность поражения различных групп перигастральных лимфатических узлов неодинакова у различных пациентов и при различной локализации опухоли (Maruyamа K., Sasakо M., Kinoshitа T. et al., 1999).
В этой связи R.M. Cabanas (1977) впервые выдвинул концепцию
«сигнальных», лимфатических узлов (”sentinel lymph node”) (Cabanas R.M.,
1977), согласно которой предполагается, что отсутствие метастатического
поражения сигнального лимфатического узла (СЛУ) свидетельствует об
отсутствии метастатического поражения соответствующего бассейна
регионарного лимфооттока (Morton D.L., Thompson J.F., Essner R. et al., 1999;
Thompson J.F., Uren R.F., 2000), в свою очередь объем лимфодиссекции и
прогноз заболевания напрямую зависит от распространенности
метастатического процесса.
Таким образом, актуальность исследования обусловлена необходимостью комплексного изучения биологических свойств опухоли и реакции иммунной системы при РЖ, что в свою очередь способствует накоплению и уточнению данных о патогенезе опухолевого процесса на этапе метастазирования в СЛУ.
Степень разработанности темы исследования
Патогенез РЖ сложен, а факторы способствующие метастазированию во многом не изучены. Акцентируется внимание на размере новообразования и глубине инвазии, что коррелирует с частотой лимфогенного метастазирования (Давыдов М.И., Тер-Ованесов М.Д., 2000; Черноусов А.Ф., Поликарпов С.А., Годжелло Э.А., 2002). Из дополнительных прогностических параметров широко исследуются показатели апоптоза, пролиферативной активности, межклеточной адгезии, однако полученные к настоящему моменту данные во многом противоречивы (Lee D.S., Kang S.B., Baek J.T. et al., 2005; Juvan R., Hudler P., Gazvoda B. et al., 2007 Li G.C., Zhang Z., Ma X.J. et al., 2012; Sanaat Z., Halimi M., Ghojezadeh M. et al., 2013).
Активно ведется поиск дополнительных морфологических критериев прогноза при РЖ, что отражает сохраняющуюся высокую потребность в изучении данной патологии и обобщении накопленных результатов. Морфологические и биологические характеристики первичной опухоли при диффузном (ДРЖ) и кишечном раке желудка (КРЖ), состав и выраженность воспалительно-реактивного инфильтрата в первичной опухоли и соотношение популяций иммунных клеток в СЛУ, как косвенного отражения состояния противоопухолевого иммунитета, изучены недостаточно.
Цель исследования. Изучить сопряженность морфологических изменений в опухолевой ткани при раке желудка и сигнальных лимфатических узлах на этапах метастазирования.
Основные задачи исследования
1. Охарактеризовать уровень инвазии, состояние стромы и экспрессию молекул,
участвующих в адгезии и миграции клеток, при раке желудка диффузного и
кишечного типов.
-
Выявить связи между наличием метастазов в сигнальном лимфатическом узле и такими показателями как гистологическое строение и глубина прорастания опухоли, состояние микрососудов в опухолевой ткани, уровень экспрессии молекул клеточной адгезии.
-
Определить уровень пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках рака желудка и метастазах в сигнальном лимфатическом узле.
4. Оценить реакцию иммунной системы при раке желудка: интенсивность
клеточной инфильтрации и популяционный состав инфильтратов в опухоли,
реактивные изменения и соотношение иммунокомпетентных клеток в
сигнальном лимфатическом узле.
5. Изучить взаимную зависимость клеточного состава реактивных
инфильтратов, плотности сосудистого русла, а также пролиферативной
активности опухоли, экспрессии белков, участвующих в регуляции апоптоза,
адгезии и миграции опухолевых клеток при разных типах рака желудка в группах с метастазами и без метастазов в сигнальном лимфатическом узле.
Научная новизна исследования
Впервые проведена комплексная оценка гистологического типа, глубины инвазии опухоли, экспрессии молекул адгезии на опухолевых клетках, интенсивности пролиферации и апоптоза, а также характеристику плотности сосудов и клеточного состава реактивного инфильтрата в первичной опухоли. В лимфатическом узле проанализирована частота обнаружения метастазов, состояние лимфоидной ткани, а также, при наличии метастаза, характеристики опухолевой ткани, аналогичные изученным на материале первичной опухоли. Получены данные, характеризующие биологические основы метастазирования и реакцию иммунной системы на опухолевый рост. Впервые на операционном материале показано изменение профиля экспрессии молекул адгезии при метастазировании рака желудка.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Теоретическое значение работы заключается в том, что получены новые
данные, уточняющие представления о патогенезе метастатического
процесса. Показано, что лимфогенное метастазирование определяется свойствами основной опухоли и зависит от типа РЖ, плотности микрососудов в ткани опухоли, уровня пролиферативной активности и апоптоза в опухолевой ткани, а также уровня экспрессии молекул адгезии. Указанные признаки, в т.ч. различия профиля экспрессии молекул адгезии в опухоли при наличии и отсутствии метастазов, можно использовать для разработки критериев вероятности метастазирования на диагностическом материале первичной опухоли, что имеет большое практическое значение. Для РЖ установлена значимость морфологического исследования СЛУ, которое целесообразно проводить с использованием иммуногистохимических методов, что повышает вероятность обнаружения метастазов, уточняет стадию и прогноз заболевания.
Методология и методы исследования
Диссертационная работа базируется на использовании общенаучных и специальных методов познания. При формировании цели и задач исследования, подходов и средств к его ведению послужил анализ опубликованных данных отечественных и зарубежных авторов. Работа основана на использовании широкого спектра морфологических методов исследования (гистологического, гистохимического, иммуногистохимического) и обработки полученных данных с применением статистического анализа.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационной работы внедрены в практику лечебно-диагностического и учебного процессов кафедры патологической анатомии с патологоанатомическим отделением ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Положения выносимые на защиту
1. Диффузный и кишечный типы рака желудка различаются как по
морфологическим, так и по молекулярным характеристикам, и
характеризуются существенными различиями стромально-паренхиматозных
отношений. Прогрессия опухоли сопровождается снижением уровня
экспрессии молекул, обеспечивающих межклеточные контакты и контакты
клеток с компонентами экстрацеллюлярного матрикса; экспрессия адгезивных
молекул, обеспечивающих инвазию и миграцию, остается стабильной или
повышается.
-
Риск лимфогенного метастазирования зависит от пролиферативной активности, адгезивных свойств опухолевых клеток, экспрессии молекул, регулирующих апоптоз, а также от глубины инвазии и степени васкуляризации стромы.
-
При прогрессии опухоли и развитии лимфогенных метастазов происходит подавление клеточного и активация гуморального звена иммунитета. На этапах прогрессии число и характер корреляционных связей изученных показателей в
паренхиме опухоли и системе паренхима-строма меняется, что может отражать изменение генетических и молекулярных характеристик опухоли.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Достоверность полученных результатов основана на обобщающем теоретическом анализе проблемы, сообразном выборе методов (общенаучных и специальных), корректном статистическом анализе данных. Материалы диссертации доложены на заседании Санкт-Петербургской Ассоциации патологоанатомов (Санкт-Петербург, 2012) и на Всероссийской конференции, посвященной 155-летию кафедры ВМедА им. С.М. Кирова «Актуальные вопросы патологической анатомии в мирное и военное время» (Санкт-Петербург, 2014), Европейском конгрессе патологов (Лондон, 2014).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, 2 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
Личный вклад автора в проведенное исследование
Автор принимал непосредственное участие в обобщении данных
литературы, систематизации материала, анализе и описании результатов
морфологического исследования. Лично автором выполнены
иммуногистохимические реакции, статистическая обработка и обобщение полученных результатов.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений.
Работа содержит 9 таблиц, 7 схем и 63 рисунка (5 из которых вынесены в приложение). Список литературы включает 191 источник, в том числе 38 отечественных и 153 иностранных публикаций.
Лимфатическая система желудка. Особенности лимфогенного метастазирования рака желудка
В настоящее время хирургическое вмешательство является единственным радикальным методом лечения РЖ. Химио- и радиотерапия дополняют хирургическое лечение, но не играют первостепенную роль в продлении безрецидивного периода и продолжительности жизни пациентов [22, 32, 42]. Вопрос о выборе объема операции при РЖ связан с большим количеством противоречий. Это объясняется тем, что хорошие показатели результатов лечения РЖ не во всех случаях базируются на расширении объема радикальной операции. Предметом дискуссии являются показания, отдаленные результаты и объем лимфодиссекции [20, 55].
В разных странах подходы к выполнению лимфодиссекции существенно различаются. В частности, по-прежнему дискутируется вопрос о целесообразности выполнения расширенной лимфодиссекции – D2 (лимфодиссекция D1 предполагает удаление только перигастральных лимфатических узлов, D2 – дополнительно лимфатических узлов вдоль чревного ствола, общей печеночной и селезеночной артерий, ворот селезенки). В Японии, достигшей значительных успехов в диагностике и лечении РЖ, объем лимфодиссекции D2 является стандартным. По данным японских авторов, 5 летняя выживаемость при I стадии рака и выполненной D2 лимфодиссекции составляет более 92%. При выполнении стандартной гастрэктомии D1 отмечено снижение 5-летней выживаемости до 74%. Во II стадии лучшие результаты пятилетней выживаемости сопряжены с выполнением расширенной лимфодиссекции (более 75%), чем при выполнении стандартной гастрэктомии (около 60%). В III стадии достоверное двукратное улучшение пятилетней выживаемости наблюдается после расширенных радикальных операций (47,7%), по сравнению со стандартными вмешательствами (24,6%).
Основные доводы в пользу расширенной лимфодиссекции сводятся к тому, что при выполнении радикальной операции увеличивается 5-летняя выживаемость, появляется возможность точного стадирования заболевания на основе исследования удаленных лимфатических узлов. Наконец, некоторые авторы указывают на возможность «скачущих метастазов», определяемых в лимфатических узлах второго и третьего коллекторов, при прорастании опухоли в подслизистый слой. Противники расширенной лимфодиссекции ссылаются на значительную частоту осложнений и летальных исходов в раннем послеоперационном периоде.
В литературе встречаются данные об эффективности объема лимфодиссекции – D2, на основании оценки количества лимфатических узлов в препарате. Так, J.R. Siewert с соавторами (1993) утверждает, что только при диссекции более 26 лимфатических узлов операция отвечает стандартам D2 (меньшее количество лимфатических узлов – D1) [148]. По данным P.K. Wagner с соавторами (1991), минимальное число узлов, адекватное объему D2, составляет 27 [129]. В то же время для полноценного стадирования опухолевого процесса недостаточно обычного подсчета пораженных метастазами лимфатических узлов, по-видимому, требуется их распределение по лимфатическим коллекторам. Данные о прогностической значимости уровня пораженного лимфоколлектора N1 – N3 опубликованы Y. Noguchi с соавторами (1989) и K. Maruyama с соавторами (1993) [79, 156]. Согласно полученным данным утверждается, что поражение коллекторов N0 – 1 – 2 – 3 прогрессивно понижает частоту пятилетней выживаемости до 85%, 60%, 25% и 11% соответственно. Эти данные сопоставимы с результатами H. Isozaki с соавторами (1993): уровень лимфатических узлов пораженных метастазами имеет преобладающее прогностическое значение, чем их количество [154]. При этом деление по топографическому принципу, лежащее в основе японской классификации, достоверно и в большей степени отражает распространенность процесса, позволяет стадировать заболевание и уточнить прогноз [95]. Так, например, большинство перигастральных лимфоколлекторов классифицируются как N1. Исключение составляют лишь супрапилорические (№5) и субпилорические (№6) лимфатические коллекторы для опухоли проксимального отдела желудка, левые паракардиальные (№2) для рака тела желудка, правые (№1) и левые (№2) паракардиальные, по ходу коротких артерий (№4sa) и левой желудочно сальниковой артерии (№4sb) для рака антрального отдела желудка. Следует отметить, что при нахождении опухоли в антральном отделе желудка и метастатическом поражении левых паракардиальных лимфатических узлов пятилетняя выживаемость составляет 0%, а данные метастазы классифицируются как отдаленные [95]. Эти наблюдения дают возможность утверждать, что в данной классификации значительная роль принадлежит так называемым скачущим метастазам, когда наблюдается поражение более отдаленных лимфоколлекторов при отсутствии метастазов в проксимальных к опухоли лимфатических узлах. Причем, по данным ряда авторов [43, 65, 70], даже единственный скачущий метастаз радикальным образом может повлиять на прогноз и стадию заболевания. Эти данные подтверждают зависимость пятилетней выживаемости от поражения различных коллекторов лимфооттока. В то же время, согласно данным M. Makino с соавторами (1991), отмечается достоверная разница в прогнозе у пациентов со стадией N1, имеющих разное количество метастатически пораженных лимфатических узлов [152].
Одним из важных вопросов диагностики РЖ является раннее выявление метастазов в регионарных лимфатических узлах, что в свою очередь обусловливает выбор тактики и метода лечения, объем оперативного вмешательства и, безусловно, прогноз выживаемости. Большое внимание уделяется оценке возможного риска развития метастазов, что влияет на тактику ведения больных и прогноз 5-летней выживаемости. Единственным достоверным методом определения метастазов в лимфатических узлах является морфологическое исследование удаленного препарата. В 1977 году R.M. Cabanas впервые выдвинул концепцию «сторожевых» или «сигнальных» лимфатических узлов (sentinel lymph node) – СЛУ [57]. СЛУ напрямую и в первую очередь дренирует первичную опухоль [182]. В соответствии с этой концепцией предполагается, что отсутствие метастазов в СЛУ свидетельствует об отсутствии метастазов в лимфатических узлах соответствующего бассейна лимфооттока [182, 176]. Таким образом, исследование СЛУ дает возможность с высокой вероятностью предсказывать наличие или отсутствие метастазов во всех регионарных лимфатических узлах. Первые успехи выявления СЛУ были достигнуты при меланоме. В дальнейшем появилось множество работ по выявлению СЛУ для опухолей различных локализаций: молочной железы, пищевода, толстой кишки, щитовидной железы, шейки матки, а также РЖ [137, 138, 179, 180, 181, 186]. Введение в хирургическую практику понятия о СЛУ (в большей мере для меланомы и рака молочной железы) дало возможность проведения «щадящей» лимфодиссекции, а, следовательно, и снижения риска возможных осложнений. Учитывая то, что лимфатическая система желудка характеризуется значительными индивидуальными особенностями, определение СЛУ проводится интраоперационно. Для этой цели используются различные методы визуализации лимфатических сосудов и лимфатических узлов, такие как инфракрасная флюоресценция [161], различные лимфотропные красители (в частности 1% раствор «Patent-blue V»), которые вводятся субмукозно или субсерозно вокруг опухоли [80], методы с использованием радиофармпрепаратов.
Галектин
При иммуногистохимическом исследовании СЛУ, предполагалось оценить как опухолевые структуры метастазов, так и состояние лимфоидной ткани. На основании этого в дальнейшее исследование были включены СЛУ с площадью метастатического поражения менее 30%, что составило 10 случаев.
Для иммуногистохимического исследования лимфатических узлов, не пораженных метастазами, отбирались узлы достаточного размера для приготовления серии срезов (10 случаев). Каждому СЛУ соответствовала основная опухоль. Для приготовления срезов подбирались парафиновые блоки с наименьшим проявлением вторичных изменений в опухолевой ткани. В контрольную группу (10 случаев) вошли лимфатические узлы, удаленные при неопухолевой патологии, во время операций на органах брюшной полости. Материал отбирался среди архивных парафиновых блоков, на базе патологоанатомического отделения ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Как уже указывалось, целью первого этапа иммуногистохимического исследования (MNF 116, EMA, виментин и CD68) было выявление метастазов в лимфатических узлах. На втором этапе исследовали экспрессию молекул адгезии – с помощью антител к Е-кадгерину (клон 36B5; Novocastra, Великобритания), галектину-3 (клон 9C4; Novocastra, Великобритания), ламинину (клон LAM-89; Novocastra, Великобритания), маркировали клетки лимфоидной ткани и реактивно-воспалительного инфильтрата в РЖ (В лимфоциты и субпопуляции Т-клеток, NK-клетки, макрофаги: СD20 (клон L26; DAKO, Дания), СD4 (4B12; DAKO, Дания), СD8 (клон C8/144B; DAKO, Дания), СD56 (клон 123C3; DAKO, Дания), СD68 (клон PG-M1; DAKO, Дания). Экспрессию синдекана-1/CD138 (клон MI15; DAKO, Дания) изучали на клетках эпителия, в т.ч. ракового (адгезивная молекула), а также рассматривали как критерий плазматической дифференцировки клеток (в инфильтрате). В реакции с антителами к Ki-67 (клон MIB-1;DAKO, Дания ) оценивалась пролиферативная активность, в реакции с антителами к CD34 (клон QBEnd/10; DAKO, Дания) маркировали эндотелий сосудов. Кроме того, исследовали экспрессию молекул, участвующих в регуляции апоптоза – bсl-2 (клон 124; DAKO, Дания) и «дикий» тип р53 (клон IMX25; Novocastra, Великобритания).
Иммуногистохимические реакции для выявления выше указанных антигенов выполнялись по стандартному протоколу. Депарафинизация срезов проводилась путем последовательной проводки по ксилолам (2 емкости по 3 минуты) и спиртам (по 3 минуты в каждой из 4 емкостей, содержащих 96 спирт) с последующей промывкой в дистиллированной воде (3 минуты). Были использованы компоненты системы визуализации NovoLink Polymer Detection System (500 test) фирмы Novocastra (Великобритания).
На этапе ингибирования эндогенной пероксидазы на срезы наносился пероксидазный блок (100 мкл) с инкубацией 5 минут. С целью уменьшения фонового окрашивания использовали протеиновый блок (по 100 мкл), экспозиция составила 5 минут. Следом за этим протеиновый блок удаляли с препарата, и срезы целиком покрывали раствором первичного антитела (100 мкл) с экспозицией 10 минут. Далее срезы инкубировали с Post Primary Block в течение 30 минут. Следующим этапом, на срезы наносили NovoLink Polymer, с инкубацией 30 минут. После каждого этапа стекла промывали в растворе официнального трис-буфера. На заключительном этапе срезы покрывали приготовленным непосредственно перед применением раствором диаминобензидина (на 1,0 мл официального субстрата 50 мкл диаминобензидина), места экспрессии антигенов визуализировались за счет осаждения коричневого пигмента. Спустя 10-15 минут ход реакции останавливался при помощи промывки препаратов в дистиллированной воде (3 минуты). Далее препараты окрашивали гематоксилином, обезвоживали в спиртах (в 3 емкостях с 96 спиртом по 3 минуты) и проводили по ксилолам (3 емкости по 3 минуты) с заключением под покровные стекла при помощи полистирола.
Результаты иммуноокрашивания оценивались морфометрически. Подсчет исследуемых объектов в препаратах осуществлялся при помощи светового микроскопа с увеличением х600 (объектив 40, бинокулярная насадка 1,5 и окуляры 10). При помощи цифровой камеры оптическое изображение переводилось в цифровое и далее морфометрия выполнялась с использованием программы Videotest (версия 5.0).
Морфометрия каждого объекта исследования производилась в 10 полях зрения. При оценке числа клеток, экспрессирующих СD20, СD4, СD8, СD56, СD68, СD138, вели подсчет объектов с положительной реакцией и всех гематогенных клеток в поле зрения не вступивших в реакцию, таким образом, было получено процентное отношение (доля) клеток с положительной иммуногистохимической реакцией.
При оценке иммуногистохимических препаратов с реакциями к антителам Е-кадгерину, галектину-3, синдекану-1, Кi-67, bсl-2 и р53, за единицу счета принималась величина, являющаяся процентным отношением количества клеток опухоли с положительной реакцией к количеству всех опухолевых клеток.
Оценка экспрессии ламинина и определение площади занятой сосудистым руслом производилась в абсолютных величинах. При помощи программы Videotest (версия 5.0), в режиме автоматических измерений выполнялся подсчет площади объектов с положительной реакцией к антигену ламинина, данные выражались в микрометрах квадратных (мкм2) в каждом поле зрения. Подсчет площади занятой сосудистым руслом, осуществлялся в режиме ручных измерений и также выражался в микрометрах квадратных (мкм2) в каждом поле зрения. Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием компьютерной программы STATISTICA (версия 10). Статистический анализ количественных параметров в исследуемых группах осуществлялся с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при значении p 0,05.
Морфологическая характеристика основной опухоли и сигнальных лимфатических узлов без метастазов
Группу основной опухоли и СЛУ без метастазов составили 35 наблюдений (53,8% всех случаев), из них 17 женщин и 18 мужчин. СЛУ без метастазов были включены в группу после изготовления серийных срезов, гистологического и иммуногистохимического исследования. Во всех наблюдениях структура лимфатических узлов была сохранна. Определялись корковое вещество с фолликулами, паракортикальная зона, мозговое вещество, синусы.
В 16 случаях (46%) наблюдалась фолликулярная гиперплазия. При гистологическом исследовании выделялось расширенное корковое вещество, преобладающее над паракортикальной зоной и мозговым веществом. В корковом веществе располагались множественные фолликулы разных размеров, частью увеличенные, округлой формы. Большинство фолликулов содержали светлые центры, в которых располагались центроциты, центробласты, иммунобласты, единичные лимфоциты и плазматические клетки, дендритические клетки, макрофаги.
Мантийная и паракортикальная зона была представлена преимущественно малыми лимфоцитами. Мозговое вещество занимало меньшую площадь по сравнению с корковым веществом. Синусы лимфатических узлов представлялись сохранными, обычной гистологической структуры.
В 11 случаях (31%) наблюдался синусный гистиоцитоз. При гистологическом исследовании хорошо различались краевой, промежуточные и мозговые синусы. При подобном типе гиперплазии синусы были резко расширены, с большим содержанием клеточных элементов. В просвете синусов обнаруживались ретикулярные клетки и волокна, макрофаги, а также лимфоциты и плазматические клетки. В 8 случаях (23%) наблюдался смешанный вариант гиперплазии СЛУ, включавший как фолликулярную гиперплазию, так и синусный гистиоцитоз. Паракортикальная (Т-клеточная) гиперплазия не наблюдалась. В группе все злокачественные опухоли относились к аденокарциномам различного уровня дифференцировки. Высокодифференцированная аденокарцинома была диагностирована в 7 случаях (20% наблюдений). Умеренно дифференцированная аденокарцинома выявлена в 22 случаях (63%). И низкодифференцированная аденокарцинома составила 6 наблюдений (17%).
При исследовании глубины прорастания основной опухоли было выявлено, что в 8 случаях (22,8% наблюдений) опухоль располагалась в пределах слизистой оболочки. В 15 случаях (42,9% наблюдений) опухоль прорастала подслизистую основу и врастала в мышечную оболочку. В 12 случаях (34,3% наблюдений) основная опухоль прорастала мышечную оболочку и врастала в серозную оболочку. В данной группе ДРЖ был диагностирован в 6 случаях (17,1%), а КРЖ – в 29 (82,9%).
Оперативное вмешательство было выполнено радикально, что подтвердилось в ходе гистологического исследования краев резекции. Вторичные изменения в опухолевой ткани выражались в кровоизлияниях, участках некрозов и гнойного воспаления.
Следует отметить, что при гистологическом исследовании всех удаленных во время операции лимфатических узлов метастазы были выявлены в 8 случаях, что составило 22,8% всех наблюдений, при этом в СЛУ метастазы отсутствовали. У 6 пациентов из 8 основная опухоль имела низкую степень дифференцировки и прорастала все слои стенки желудка. Подобные случаи, по-видимому, свидетельствуют о парадоксальном метастазировании (так называемые «скачущие» метастазы).
Состав клеточной популяции сигнального лимфатического узла и воспалительно-реактивного инфильтрата основной опухоли. За единицу счета принималось процентное отношение клеток экспрессирующих антиген ко всем гематогенным клеткам. В СЛУ CD20-положительные клетки располагались в В-зависимых зонах лимфатического узла (рисунок 30), и в процентном отношении составили 62,9%. На рисунок 31 показана диффузная инфильтрация CD20-положительными клетками основной опухоли. Среди клеток, инфильтрирующих КРЖ, В-лимфоциты составляли 13,8%, а в ДРЖ – 14,5%.
Сравнительная характеристика групп исследования. Статистический анализ полученных данных
При корреляционном анализе в КРЖ были выявлены сильные положительные связи между такими показателями как количество CD4+ клеток и клеток с экспрессией синдекана-1, с экспрессией галектина-3 и p53-положительными клетками. Умеренные положительные связи были обнаружены между долей клеток, экспрессирующих bcl-2, и CD8+ клетками, между плазматическими клетками и клетками с экспрессией Ki-67, CD4+ Т-лимфоцитами и клетками, экспрессирующими галектин-3. Умеренные отрицательные связи были установлены между такими показателями, как количество клеток, экспрессирующих bcl-2, с одной стороны, и количество CD4+ лимфоцитов и галектин-экспрессирующих клеток, с другой.
В ДРЖ были выявлены сильные корреляционные связи между количеством клеток, экспрессирующих CD68, с одной стороны, с другой стороны, числом В-лимфоцитов, плазматических клеток, и площадью экстрацеллюлярного матрикса с экспрессией ламинина. Такие же сильные связи выявлялись между площадью микроциркуляторного русла и количеством опухолевых клеток с экспрессией Е-кадгерина и Ki-67. Клетками с экспрессией Ki-67 и CD4+ Т-клетками, а также между количеством CD56 и CD8+ клеток. Сильные отрицательные корреляционные связи в ДРЖ были выявлены между числом макрофагов, с одной стороны, и числом клеток с экспрессией Ki-67, Е кадгерина и площадью микрососудов, с другой. Сильные отрицательные корреляционные связи также выявлены между количеством плазматических клеток и CD4+ клеток, числом В-лимфоцитов и числом клеток с экспрессией галектина-3, между площадью микроциркуляторного русла, и площадью экстрацеллюлярного матрикса с экспрессией ламинина. При сравнении исследованных показателей в СЛУ без метастазов и в КРЖ корреляционные связи распределились следующим образом. Сильные положительные связи были выявлены между площадью занятой микрососудами в СЛУ и долей плазматических клеток, а также CD8+ клеток в воспалительно-реактивном инфильтрате РЖ. Сильные корреляционные связи были обнаружены между числом В-лимфоцитов в опухоли и СЛУ, а также между количеством макрофагов в СЛУ и количеством клеток с экспрессией синдекана-1 в РЖ.
Умеренные положительные связи были выявлены между количеством плазматических клеток в СЛУ и количеством NK-лимфоцитов в КРЖ, а также площадью микрососудов.
Умеренные отрицательные связи были выявлены между количеством клеток с экспрессией Ki-67 (в СЛУ), и CD56+, CD68+ клеток (в составе воспалительно-реактивного инфильтрата КРЖ).
При корреляционном анализе исследованных показателей в СЛУ и ДРЖ были выявлены сильные положительные связи между количеством натуральных киллеров в СЛУ и показателями экспрессии адгезивных молекул (синдекана-1 и ламинина) в РЖ. Также, сильные положительные связи были выявлены между количеством CD8+ лимфоцитов и NK-клеток, макрофагами и площадью микроциркулаторного русла, а также показателями экспрессии молекул адгезии (Е-кадгерина и ламинина) в СЛУ и РЖ соответственно.
Сильные отрицательные связи обнаружены между числом CD4+ Т-лимфоцитов в СЛУ и числом клеток с экспрессией p53 в РЖ, а также площадью микроциркуляторного русла и площадью экстрацеллюлярного матрикса с экспрессией ламинина.
Межгрупповые корреляционные связи КРЖ и ДРЖ. При статистическом анализе исследованных показателей всех случаев КРЖ и ДРЖ (без разделения на опухоли с метастазами и без метастазов в СЛУ) были выявлены отличные по силе и характеру распределения корреляционные связи, что отображено на схеме 5. В случае КРЖ отмечается преобладание сильных корреляционных связей, причем подавляющее большинство корреляций группируется вокруг молекул адгезии и показателей пролиферативной активности (значительная часть носит отрицательный характер). Так, сильная отрицательная связь выявлена между долей клеток экспрессирующих галектин-3 и синдекан-1. Сильные и умеренные связи обнаруживаются между долей клеток с экспрессией bcl-2 и долей клеток с экспрессией молекул адгезии (галектин-3, синдекан-1 и ламинин). Умеренная отрицательная корреляция связывает показатели экспрессии Е-кадгерина и Ki-67. В ДРЖ также прослеживается тенденция к группировке связей вокруг показателей экспрессии молекул адгезии, хотя и менее выраженная. Характер связей децентрализованный. Часть корреляций связана с показателями экспрессии Е-кадгерина. Единственная сильная корреляционная связь выявлена между показателями экспрессии CD56 и CD68.