Введение к работе
Актуальность проблемы. Флеботромбозы и тромбоэмболические осложнения – патологические процессы, имеющие важное медико-социальное значение. Согласно мировым статистическим данным, каждый год тромбирование вен диагностируют у 1 – 2 человек из 1000. К наиболее частым и опасным разновидностям этого патологического процесса относятся тромбозы в системе нижней полой вены (95% всех венозных тромбозов), обусловливающие большинство случаев тромбоэмболии легочной артерии. Тромбоэмболия легочной артерии занимает третье место в причинах летальности от сердечно-сосудистой патологии (Баешко А.А. и др., 2000; Швальб П.Г. и др., 2010). Необходимо отметить тот факт, что флеботромбозы в большинстве случаев обусловливают развитие угрожающих для жизни осложнений: посттромбофлебитические синдромы диагностируются более чем у половины больных, перенесших флеботромбоз нижних конечностей, у 2 – 4% пациентов, оставшихся в живых после обнаружения тромба в легочной артерии, развивается хроническая легочная гипертензия. Все перечисленные патологические процессы приводят к потере трудоспособности и резкому снижению уровня и качества жизни (Фокин А.А., Сощенко Д.Г., 2014; Goldhaber S.Z., 2012; Wong P., Baglin T., 2012).
В настоящее время предложены различные способы терапии венозного тромбоза, характеризующиеся разной эффективностью (Баешко А.А. и др., 2000; Воробьева Н.М. и др., 2011; Клецкин А.Э. и др., 2014; Гавриленко А.В., Воронов Д.А., 2015; Крылов А.Ю. и др., 2015). Основное внимание уделяется антикоагулянтной и тромболитической терапии (Лебедев И.С., Леонтьев С.Г., 2003; Protack C.D. et al., 2007), однако в последние годы среди перспективных подходов к лечению тромбозов и сопряженных с ними ишемиче-ских состояний рассматриваются клеточные технологии, основанные на применении стволовых клеток разной локализации для стимуляции реканализации сосудов, реваскуля-ризации и регенерации ишемизированных тканей (Покровский А.В., Сапелкин С.В., 2008).
Среди мультипотентных стволовых клеток, с которыми проводятся наиболее интенсивные исследования, выделяются так называемые стромальные или стволовые клетки (МСК), называемые некоторыми исследователями «мезенхимальными» или «мезенхим-ными», которые располагаются, главным образом, в красном костном мозге. Такие стволовые клетки имеют потенциал для дифференцировки в клетки-предшественники или непосредственно в перициты и эндотелиоциты (Ribatti D. et al., 2002; Cho H. et al., 2003; Carmeliet P., 2004; Bergers G., Song S., 2005), что позволяет использовать их для потенцирования регенераторных и восстановительных процессов в случаях нарушенной микроциркуляции, т.е. для реваскуляризации тканей (Tong Z. et al., 2008; Gu Y. et al., 2009; Meng Q.Y. et al., 2010).
Предприняты экспериментальные и клинические исследования для обоснования возможности лечения хронической ишемии тканей путем введения клеток костного мозга и показано их стимулирующее влияние на ангиогенез (Суковатых Б.С., Орлова А.Ю., 2017). В экспериментальных исследованиях изучены изменения количества и функционального состояния мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения для улучшения течения ишемической болезни конечностей после стимуляции костного мозга, в частности, после введения рекомбинантного человеческого гранулоцитарного макро-фагального колониестимулирующего фактора (Tong Z. et al., 2008). Показано, что в таких условиях происходит значительное увеличение количества сосудистых коллатералей в зоне ишемии в сравнении с контролем (Tong Z. et al., 2008). Прорастание сосудов через венозный тромб, быстрое восстановление проходимости вены и кровообращения в задействованных при флеботромбозе тканях были описаны на животных с применением проан-гиогенных цитокинов (Chen Y.K. et al., 2008; Tong Z. et al., 2008; Santo S.D. et al., 2009).
Проанализированы среднесрочные результаты трансплантации аутологичных костномозговых мононуклеарных клеток при лечении ишемии нижних конечностей у людей, ко-
торым в зависимости от клинического течения осуществляли от 1 до 4 трансплантаций (Gu Y. et al., 2009). После наблюдений в течение 8 – 56 мес (в среднем 21,5 мес) были получены положительные среднесрочные результаты трансплантаций таких клеток. Результаты этих исследований в целом свидетельствуют о перспективности применения клеточных технологий для лечения ишемических повреждений тканей.
Степень разработанности темы исследования. В опубликованных статьях явно недостаточно результатов исследований по использованию клеточных технологий для воздействия на состояние флеботромбоза. Работы в основном описывают результаты терапии артериальной недостаточности и применения мезенхимальных стромальных клеток (МСК) для реваскуляризации ишемизированных тканей (Isner J.M., 2000; Kocher A.A. et al., 2001; Jackson K.A. et al., 2001; Kamihata H. et al., 2001; Takahashi M. et al., 2006; Fukushima S. et al., 2007; Grauss R.W. et al., 2007). Присутствуют только единичные статьи о применении проангиогенных релизов и мононуклеарных клеточных элементов костного мозга и периферической крови для восстановления кровотока через и в обход вен с тромбами.
Цель исследования – изучить патоморфологию флеботромбоза и особенности регенерации и ремоделирования сосудистого русла в условиях применения мультипотентных стромальных клеток костномозгового происхождения (МСККП) в эксперименте.
Задачи исследования:
-
Провести патоморфологический анализ процессов восстановления кровотока и микроциркуляции по тромбированной v. femoralis крыс в условиях внутривенной инъекции МСККП.
-
Изучить патоморфологические особенности динамики микроциркуляции после экспериментального флеботромбоза с последующей инъекцией МСККП рядом с пораженной веной.
-
Провести патоморфологический анализ процессов регенерации лимфатических сосудов в периваскулярной клетчатке при экспериментальном флеботромбозе в условиях использования МСККП.
-
Изучить изменения лимфотока в тканевом регионе тромбированной вены при введении МСККП.
-
Изучить изменения структуры и цитоархитектоники регионарных лимфатических узлов после инфузии МСККП.
-
С помощью патоморфологического анализа сравнить эффективность паравазальных и внутривенных инъекций МСККП в условиях экспериментального флеботромбоза.
7. Изучить миграционные свойства МСККП при непосредственном введении в тром-
бированную вену и ее регион.
Научная новизна. Впервые с помощью патоморфологического анализа установлено поражение мелких тканевых венозных ветвей при моделировании магистрального флебо-тромбоза. Впервые показано, что МСККП участвуют в реваскуляризации тромбов и росте новых ветвей магистральной вены (v. femoralis).
Впервые выявлено, что регенерация сосудистых структур микроциркуляторного русла происходит как при паравазальном, так и при внутривенном введении МСККП, но введение МСККП непосредственно в вену с тромбом более эффективно.
Впервые обнаружено, что при инъекции МСККП периваскулярно к тромбированной вене они участвуют в развитии сосудистых структур грануляций в месте хирургического вмешательства, что создает дополнительные условия для быстрого очищения и рубцевания раны. Впервые приведены доказательства того, что МСККП после введения не мигрируют в другие ткани и кровоток и не подвергаются быстрой деструкции в месте инъекции, а формируют оболочки кровеносных сосудов путем дифференцировки в перициты и эндотелиоциты.
Впервые получены данные о том, что при моделировании флеботромбоза без после-
дующей терапии показатели лейкоцитарной инфильтрации и уровня васкуляризации тканей больше исходных до 4-й недели после операции. После инъекции МСККП в вену с тромбом и рядом с ней численные показатели лейкоцитарной инфильтрации и васкуляри-зации даже спустя 5 нед остаются больше исходных данных.
Впервые проведено изучение возможности использования клеточных технологий для восстановления лимфатического русла в регионе тромбированных вен. МСККП участвуют в процессах лимфоангиогенеза как встраиваясь в растущие, вместо поврежденных, лимфатические сосуды, так и полностью формируя все их оболочки и даже клапаны.
Впервые продемонстрировано, что использование МСККП со встроенной ДНК гена GFP для воздействия на флеботромбоз не создает условий для значительного ответа регионарных лимфатических узлов. Установлены статистически значимые изменения структурных и клеточных реакций лимфоидных фолликулов со светлыми центрами, вызванные хирургической интервенцией, моделированием тромбоза вен или инъекцией МСККП.
Теоретическое и практическое значение работы. Получены новые знания об особенностях регенерации сосудистых структур микроциркуляторного русла при магистральном флеботромбозе при использовании МСККП. С помощью люминесцентной микроскопии показано, что применение МСККП стимулирует реваскуляризацию тромба и неоангиогенез в окружающих тромбированную вену тканях. Установлено, что для ревас-куляризации тромба более эффективно введение МСККП непосредственно в участок фле-ботромбоза. Паравазальное введение МСККП способствует более раннему образованию сосудов грануляций в участках хирургических вмешательств и наложения лигатур, в результате чего возможно более быстрое удаление клеточного детрита из раны и, соответственно, более ранняя регенерация тканей в месте хирургического разреза.
Полученные данные о том, что при магистральном флеботромбозе происходит одновременное нарушение и даже полная блокада лимфотока в регионе, обусловливают целесообразность инфузий МСККП для потенцированного восстановления тканевого лим-фодренажа. При разработке клеточных технологий с применением МСККП необходимо учитывать возможность инициации иммунного ответа на инъецированные клетки с чужеродной и, возможно, даже антигенной ДНК белка GFP или самого флюоресцирующего протеина.
Методология и методы исследования. Методология исследования основана на применении принципов и методов комплексного морфологического анализа патологических процессов, теоретических разработках проблемы тромбозов (их этиологии, патогенеза, исходов), современных представлениях о репаративной регенерации и применении клеточных технологий для ее стимуляции, общих подходах к моделированию патологических процессов. Использованы современные методы морфологического анализа (световая и люминесцентная микроскопия, морфометрический анализ) и обработки количественных данных. Объект экспериментальных исследований – образцы бедренных мышц, магистральные вены задних конечностей, лимфатические узлы экспериментальных животных, после моделирования флеботромбоза. Предмет исследования – особенности реваскуляри-зации тромбированных вен и репаративной регенерации окружающих их тканей после применения разных схем введения МСККП.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Применение МСККП при экспериментальном флеботромбозе способствует более быстрой реваскуляризации тромбированных вен и более интенсивным процессам неоан-гиогенеза.
-
МСККП присутствуют в стенках новообразованных сосудов в составе грануляций, сформированных в местах хирургических вмешательств.
-
МСККП принимают непосредственное участие в формировании новых лимфатических сосудов в тканевом регионе тромбированной вены и в области регионарных лимфатических узлов.
4. Инъецированные МСККП подвергаются частичной макрофагальной резорбции. Ин-волютивная деградация грануляций, образованных из МСККП, также сопровождается макрофагальными реакциями. Макрофаги с люминесценцией цитоплазменных включений присутствуют в лимфоидных фолликулах регионарных лимфатических узлов после инъекций МСККП с внедренной ДНК протеина GFP.
Степень достоверности результатов диссертации. Использованные методы исследования (световая, люминесцентная микроскопия, морфометрический анализ), способы моделирования флеботромбоза и методы статистической обработки количественных данных соответствуют поставленным цели и задачам, позволяют получить достоверные результаты и сделать обоснованные выводы. Диссертация выполнена на достаточном экспериментальном материале (использованы 369 крыс-самцов инбредной линии Wag, у которых моделировали венозный тромбоз). Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.
Апробация материалов диссертации. Основные положения и выводы диссертации доложены на научно-практической конференции, посвященной 80-летию медицинского профессионального образования в ХМАО – Югре и 20-летию со дня основания Ханты-Мансийской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы современной фундаментальной и клинической медицины» (Ханты-Мансийск, 2014), 7-м Санкт-Петербургском венозном форуме «Актуальные вопросы флебологии» (Санкт-Петербург, 2014), Международном конгрессе «Славянский венозный форум» (Витебск, 2015), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Новосибирск, 2015), 2-м Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2015), XII международной конференции, посвященной 25-летию НИИ клинической и экспериментальной лимфологии «Лимфология: от фундаментальных исследований к медицинским технологиям» (Новосибирск, 2016), на заседании научных сотрудников лабораторий стволовой клетки, инвазивных медицинских технологий и персонализованной медицины ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, 2017).
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследований внедрены в научно-исследовательскую работу отдела «Центр новых медицинских технологий» ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск), учебный процесс ФГАОУ ВО Новосибирского национального исследовательского государственного университета» и лечебную практику ГБУЗ Новосибирской области «Новосибирская клиническая центральная районная больница».
Публикации. По теме и результатам диссертации опубликованы 32 работы, из них 21 – в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, главы с обзором литературы, главы материала и методов исследования, 4 глав собственных результатов, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и 7 приложений. Диссертация изложена на 360 стр. компьютерного текста, иллюстрирована 41 таблицей и 126 многокомпонентными комбинированными рисунками. Список использованных источников включает 301 источник (90 отечественных и 211 иностранных). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.