Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Эмбриология, топографическая анатомия, гистология и иммуноморфология аденоидных вегетации у детей 12
1.2. Мукозальная иммунная система на примере глоточной миндалины 23
1.3. Современная иммунологическая концепция врожденного и адаптивного иммунитета в приложении к лимфоэпителиальным органам на примере глоточной миндалины 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Характеристика операционного материала в клинико-анатомическом аспекте и методы исследования 33
2.2. Методы исследования 39
2.3. Морфометрические исследования и статистическая обработка полученных данных 43
Глава 3. Собственные результаты 45
3.1. Макроскопическая характеристика аденоидов в возрастном аспекте 45
3.2. Микроскопическая характеристика аденоидов в возрастном аспекте 52
3.2.1. Гистологическая, иммуногистохимическая и морфометрическая характеристика эпителиального компонента криптолимфона глоточной миндалины в возрастном аспекте 52
3.2.2. Гистологическая, иммуногистохимическая и морфометрическая характеристика диффузной лимфоидной ткани глоточной миндалины 74
3.2.3. Гистологическая, иммуногистохимическая и морфометрическая характеристика фолликулярного компонента криптолимфона глоточной миндалины 91
Глава 4. Обсуждение результатов 114
Выводы 125
Практические рекомендации 127
Список литературы 129
Приложение 1 151
Приложение 2 158
- Эмбриология, топографическая анатомия, гистология и иммуноморфология аденоидных вегетации у детей
- Макроскопическая характеристика аденоидов в возрастном аспекте
- Гистологическая, иммуногистохимическая и морфометрическая характеристика диффузной лимфоидной ткани глоточной миндалины
- Гистологическая, иммуногистохимическая и морфометрическая характеристика фолликулярного компонента криптолимфона глоточной миндалины
Введение к работе
Актуальность темы
По данным ведущих педиатрических клиник, заболевания органов лимфаденоидного глоточного кольца Вальдейера занимают первое место по распространенности среди всей ЛОР-патологии детского возраста: доля детей с хроническими аденотонзиллитами колеблется от 20% до 50%, а в группе часто болеющих детей от 37% до 70% (Карпова Е.П., 2009). Аденоидные вегетации (разрастания), или аденоиды, представляют собой реактивную гиперплазию глоточной миндалины в ответ на антигенные воздействия (Быкова В.П., Бруевич О.А., Паюшина О.В., 2007). Наибольшая выраженность и распространенность аденоидных вегетаций отмечается в возрасте 3-4 и 5-7 лет. Приведенные «возрастные пики» реактивной гиперплазии глоточной миндалины педиатры и ЛОР врачи связывают с возрастным становлением «незрелой» иммунной системы вследствие расширения внешнего микробного окружением при поступлении детей в дошкольные учреждения и школу (Борзов Е.В., Соколов Р.О., 2003; Борзов Е.В., 2003; Гаращенко Т.И., 2006). Однако, используемый в клинической практике термин «незрелость» иммунной системы, в доступной литературе не имеет должного морфологического эквивалента, кроме того немногочисленные морфологические исследования не учитывают данные о возрастных различиях в структуре глоточной миндалины. До настоящего времени мы не встретили упоминания о возможной связи структуры глоточной миндалины с возрастной незрелостью иммунной системы. В то же время, несмотря на важную роль глоточной миндалины в становлении иммунной системы ребенка (Быкова В.П., Бруевич О.А., Паюшина О.В., 2007) аденотомия остается пока методом выбора в лечении аденоидита (Еремина Н.В., Русецкий Ю.Ю., Чернышенко И.О., 2002; Бруевич О.А., 2006; Гаращенко Т.И., 2007). Изучение удаленных аденоидов у детей разного возраста рассматривается нами как исключительно важная возможность получения информации о морфологических проявлениях возрастной иммунной реактивности детей на уровне данного лимфоэпителиального органа.
Известно, что морфологическим эквивалентом иммунного ответа является гиперплазия лимфоидной ткани с образованием вторичных лимфатических фолликулов, в герминативных центрах которых осуществляется клональная пролиферация В клеток, что показано на примере лимфатических узлов и селезенки (Branrtzaeg P., Halstensen T. S. 1992; Быкова В.П., Иванов А.А., Пакина В.Р., 1996). Однако морфологические проявления иммунного ответа и реактивных изменений лимфоэпителиальных образований лимфаденоидного глоточного кольца Вальдейера, которые в настоящее время рассматриваются в качестве «сторожевых» охранных структур (Быкова В.П., Бруевич О.А., Паюшина О.В., 2007), остаются недостаточно изученными в возрастном аспекте, особенно в свете современной концепции врожденного иммунитета, предложеноой Medzhitov R., Janeway C.A. Jr. (Medzhitov R., Janeway C.A. Jr., 1997; 1998). Согласно этой концепции, запуск адаптивного иммунного ответа невозможен без участия факторов врожденного иммунитета: распознавание антигенной структуры патогена при первом взаимодействии с макроорганизмом и первый немедленный ответ реализуются механизмами врожденного иммунитета. Взаимодействуя с врожденной иммунной системой посредством дендритных клеток, адаптивный иммунитет включается последовательно и отсрочено (Iwasaki A., Medzhitov R., 2002). Система врожденного иммунитета представлена разнообразными клетками, несущими паттерн распознающие рецепторы (pattern-recognition receptors – PRRs), такие как Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors — TLRs), RIG-I-подобные рецепторы (RIG-I-like receptors — RLRs) и др. PRRs взаимодействуют с консервативными молекулярными структурами (патоген-ассоциированными молекулярными паттернами - pathogen associated molecular patterns – PAMPs), общими и специфическими для родственных групп возбудителей (Pasare C, Medzhitov R., 2004; 2005; Kawai T., Akira S., 2006; Ярилин А.А., 2010; Друцкая М.С., Белоусов П.В., Недоспасов С.А., 2011). Результатом этого взаимодействия является образование различных мессенджеров для инициации иммунного ответа, ключевым из которых является нуклеарный фактор B (nuclear factor B), запускающий экспрессию генов, отвечающих за синтез цитокинов и молекул адгезии (Medzhitov R., Janeway C.A. Jr., 2002; Akira S., Takeda K., 2004).
По последним литературным данным методом ПЦР в реальном времени выявлена м-РНК TLRs 1-10 в первичной культуре эпителиальных клеток глоточной миндалины как в нестимулированном состоянии, так и после антигеной стимуляции (Lange M., Lasiter J., Misfeldt M.L., 2009). Однако, в настоящее время, мы не встретили работ, в которых на морфологическом уровне показана экспрессия Toll-подобных рецепторов в аденоидах.
Цель исследования: провести морфологическое и иммуногистохимическое исследование аденоидов детей и уточнить возрастные особенности морфофункциональной организации гипертрофированной глоточной миндалины как лимфоэпителиального органа в свете современных представлений о взаимодействии врожденной и адаптивной иммунной системы.
Задачи исследования
1. Охарактеризовать с помощью гистологических и иммуногистохимических методов функциональные компартменты глоточной миндалины у детей по выделенным возрастным группам;
2. Провести морфометрическую оценку площади функциональных отделов криптолимфона глоточной миндалины в выделенных возрастных группах;
3. Провести количественную морфометрическую оценку иммуногистохимических маркеров функциональной активности клеток врожденного и адаптивного иммунитета глоточной миндалины в выделенных возрастных группах по экспрессии транскрипционного фактора bcl-6; проапоптотического белка p53; молекул В лимфоцитов (CD19, CD20, CD79a), Т лимфоцитов (CD3, CD5), макрофагов (CD68), фолликулярных дендритных клеток (CD21, CD23), тимоцитов (TdT, CD1a); антиапоптотического белка bcl-2; ко-рецептора врожденной иммунной системы (CD80).
4. Оценить пролиферативную активность лимфоцитов по Ki67, как основу гиперплазии лимфоидной ткани в пределах выделенных возрастных групп;
5. Выявить в структуре аденоидов наличие TLR 2, 4, 9, молекулы CD14 и определить их взаимосвязь с выделенными функциональными компартментами;
6. Представить морфофункциональное обоснование возрастной незрелости иммунной системы у детей на уровне лимфоэпителиального органа;
7. На основе полученных данных разработать алгоритм морфологического исследования аденоидов для формулировки патоморфологического диагноза, адекватного запросам педиатрической и ЛОР клиник.
Научная новизна
Морфометрическое исследование аденоидов выявило реципрокные отношения («ножницы») между относительными площадями фолликулярной и диффузной лимфоидной ткани в выделенных возрастных группах.
Установлено снижение протяженности зоны лимфоэпителиального симбиоза и увеличение протяженности респираторного эпителия при сохранении локальных реактивных участков лимфоэпителиального симбиоза по мере увеличения возраста детей.
По экспрессии молекул Т лимфоцитов (CD3, CD5), В лимфрцитов (CD19, CD20, CD79a), макрофагов (CD68) детально охарактеризован относительный клеточный состав функциональных компартментов глоточной миндалины.
Определена экспрессия Ki67 как показателя пролиферативной активности в герминативных центрах фолликулов, установлено статистически достоверное снижение относительного количества пролиферирующих клеток диффузной лимфоидной ткани по мере увеличения возраста детей.
Впервые на морфологическом уровне в структуре аденоидов выявлена экспрессия Toll-подобных 2, 4, 9 рецепторов, молекулы CD14 на эпителиоцитах респираторного эпителия, ретикулярных эпителиальных клетках зоны лимфоэпителиального симбиоза, эндотелиальных клетках венул с высоким эндотелием, а также на макрофагах и фолликулярных дендритных клетках герминативных центров.
Экспрессия молекул TdT и CD1a клетками диффузной лимфоидной ткани, прилежащей к нижним полюсам фолликулов определена как особенность организации аденоидов детей младшей возрастной группы, что позволило разработать морфофункциональное обоснование возрастной «незрелости» иммунной системы у детей на уровне данного лимфоэпителиального органа.
Практическая значимость
На основе морфофункционального обоснования возрастной «незрелости» иммунной системы у детей на уровне лимфоэпителиального органа разработан алгоритм морфологического исследования аденоидных вегетаций для оценки удаленных аденоидов и формулировки патоморофологического диагноза, адекватного требованиям ЛОР-клиники. Созданы базовые данные о морфологических особенностях организации аденоидов в различные возрастные периоды, необходимые для оценки вакцинации, дифференциальной диагностики с вирусными и лимфопролиферативными заболеваниями. Полученные данные служат основанием для органосохраняющего направления в лечении аденоидных вегетаций.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Структура глоточной миндалины детей в выделенные возрастные периоды различается: у детей младшей возрастной группы преобладает относительная и абсолютная площади вторичных фолликулов; по мере взросления детей нарастает относительная площадь парафолликулярной лимфоидной ткани, а также снижается протяженность зоны лимфоэпителиального симбиоза. В тоже время, относительный клеточный состав фолликулярной и диффузной лимфоидной ткани глоточной миндалины не имеет статистически достоверных различий по мере увеличения возраста детей.
2. Лакунарный и люминальный эпителий, дендритные клетки герминативных центров, эндотелий приносящих и выносящих сосудов, полиморфноядерные лейкоциты аденоидов экспрессируют TLR 2, 4, 9.
3. Возрастной особенностью структурной организации глоточной миндалины является наличие клеток с тимическим фенотипом (TdT+ и CD1a+) преимущественно у детей младшей возрастной группы. Клетки с данным фенотипом встречаются в диффузной лимфоидной ткани вблизи сосудистой зоны, прилежащей к нижним полюсам фолликулов. В этой же возрастной группе детей обнаруживаются клетки врожденной иммунной системы – B1a В лимфоциты, с фенотипом CD5+/CD19+, преимущественно в субэпителиальной зоне и просвете лакун.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: заседании Московского отделения Российского общества Патологоанатомов (г. Москва, 2010 г.); VIII всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 2010 г.); VIII Конгрессе Ринологов России (г. Оренбург, 2009 г.); 25-й международной конференции молодых оториноларингологов (г. Амман, Иордания, 2009 г.); 26-й международной конференции молодых оториноларингологов (г. Санкт-Петербург, 2010 г.); на межлабораторной конференции ФГБУ «Научно-клинического Центра Оторинларингологии ФМБА России» (г. Москва, 11.2009 г.).
Внедрение результатов исследования в практику. Разработанный алгоритм морфологического исследований аденоидных вегетаций внедрен в практическую работу патологоанатомических отделений Городской клинической больницы №67 (г. Москва), Детской городской клинической больницы №9 (г. Москвы), Лабораторию патологической анатомии ЛОР-органов ФГБУ «Научно-клинического центра оториноларингологии ФМБА России».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 – в журналах, рекомендованых ВАК РФ.
Личный вклад автора в проведённое исследование. Автором подготовлен обзор данных отечественных и зарубежных литературных источников по теме диссертации, разработан дизайн исследования. Проведена гистологическая обработка биопсийного и операционного материала, изготовлены срезы биоптатов, на которых в последующем осуществлена постановка иммуногистохимических реакций. С помощью светового микроскопа проведен анализ полученных гистологических и иммуногистохимических препаратов, проведено фотодокументирование и морфометрический анализ исследуемых показателей. Осуществлена статистическая обработка полученных данных.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 93 отечественных и 133 зарубежных источников, и двух приложений. Диссертация иллюстрирована 17 графиками, 65 рисунками, 10 таблицами.
Эмбриология, топографическая анатомия, гистология и иммуноморфология аденоидных вегетации у детей
Глоточная миндалина - это непарное образование, развивающееся у эмбриона человека на 4-м месяце из эпителия головной кишки и подлежащей мезенхимы (Хлыстова З.С., Савенко В.А., 1987). По данным Г.Н. Александрова и С.А. Тен (1969) лимфоидные элементы глоточной миндалины под эпителием свода носоглотки обнаруживаются на 4-м месяце внутриутробного развития плода, а по данным В.В. Кускова на 13-й неделе эмбриогенеза (Бруевич О.А., 2006; Кусков В.В., 1974).
Одной из наиболее подробных работ относительно эмбрионального развития глоточной миндалины была кандидатская диссертация В.А. Савенко (1987). По данным автора закладка глоточной миндалины определяется на верхней стенке носоглотки к 14-й неделе развития плода, а внешним ориентиром служит глоточная сумка, кпереди от которой и располагается миндалина, здесь же проходит граница между респираторным эпителием носоглотки и многослойным плоским эпителием ротоглотки (Воробьев В.П., Иванов Г.Ф., 1936; Воробьев В.П., 1958). Первые лимфатические узелки без центров размножения возникают в собственной пластинке слизистой оболочке свода носоглотки к 20-й неделе эмбриогенеза. В итоге своей работы В.А. Савенко условно выделяет 3 периода эмбрионального развития глоточной миндалины: первый с 14 по 17 неделю, когда происходит перестройка тканей из эмбрионального состояния в дефинитивное, в миндалине появляется лимфоидная ткань, содержащая первые Т и В лимфоциты. Во втором периоде, с 18 по 23 неделю устанавливаются тесные взаимоотношения между лимфоидной и эпителиальной тканями, определяются пути миграции лимфоцитов из органа, а также значительно увеличивается число иммунокомпетентных клеток. С 24 по 40 неделю формируются структурно-функциональные единицы миндалины и устанавливаются количественные соотношения Т и В лимфоцитов, характерные для глоточной миндалины детей и взрослых (Савенко В. А., 1987). В то же время, в развитии глоточной миндалины выделяется 2 пика интенсивного увеличения площади лимфоидной ткани и количества Т и В лимфоцитов в органе на 23 и 32 неделе (Хлыстова З.С., 1969; Хлыстова З.С., Савенко В.А., 1987), второй период авторы связывают с началом функционирования глоточной миндалины как полноценного иммунного органа. По данным В Rynnel-Dagoo (1976) и P. Cernelc с соавт. (1978) число Т лимфоцитов в глоточной миндалине плода меньше, чем у взрослого человека, а количество В лимфоцитов практически одинаково (Cernelc P., Kralj J., Cernelc D., 1978; Rynnel-Dagoo В., 1976; Rynnel-Dagoo В., Moller E., Waterfield E., 1977).
Среди авторов впервые описавших и уделивших наибольшее внимание анатомии и гистологии миндалин в антенатальном периоде были Н. Lushka, W. Mayer, Н. Waldeyer, Н.И. Пирогов.
Профессор физиологии Janos Nepomuk Czermak, создавший инструмент для задней риноскопии, в 1860 году первым увидел и описал гипертрофированные разрастания вокруг отверстий слуховых труб. Автор предположил, что данные разрастания были причиной дисфункции слуховой трубы (J. N. Czermak et al., 1861; Bennett О.Р., 1892; Feldmann H., 1999).
Анатом Hubert von Luschka в 1868 году впервые подробно описал строение носоглотки человека и ввёл термин «глоточная миндалина». В своей монографии «Der Schlundkopf des Menschen» H. Luschka описал глоточную миндалину как хорошо выраженное образование, лежащее на задней стенке носоглотки между устьями евстахиевых труб, имеющее складки до 1 мм в толщину, покрытые респираторным эпителием. В миндалине автор описал наличие от 10 до 20 фолликулов, отметив сходство с таковыми в кишечной стенке (Luschka Н., 1868; Feldmann Ы., 1999).
Основатель датской школы отологов W. Mayer, основываясь на 5 летнем опыте со 175 личными наблюдениями и экспертизе 2700 детей в Дании и Англии, в 1870 году подробно описал гипертрофию глоточной миндалины, связывая эту находку с синдромом, включавшим храп, дыхание ртом, типичным выражением лица, глухотой, рецидивирующими средними отитами и характерными нарушениями речи. Именно W. Mayer назвал патологически гипертрофированную глоточную миндалину «аденоидными вегатациями», а также разработал первые инструменты и произвел первую аденоидэктомию (Mayer W., 1870).
Heinrich Wilhelm Waldeyer (1884) отметил тесное взаимоотношение всех миндалин: лимфоидная ткань от глоточной миндалины распространяется в устья евстахиевых труб, оттуда к небным и затем к язычной миндалине, образуя сплошное кольцо лимфоидной ткани в глотке.
Топографо-анатомически глоточная миндалина располагается в своде носоглотки у места перехода верхней стенки, образованной нижней поверхностью клиновидной и затылочной кости, в заднюю, состоящую из фасций и мышц. Особенностью слизистой оболочки здесь является отсутствие подслизистой основы. На боковых стенках носоглотки, соответственно уровню нижней носовой раковины, в виде щели открываются отверстия слуховых труб, ограниченные двумя валиками - передним и трубным. От трубного валика па боковых стенках тянется трубно-глоточная складка. Позади валика и складки находится ямка Розенмюллера, в которой находится ткань тубарной миндалины (Гальцова З.В., 1964).
А.И. Иванов (1988) приводит следующие границы глоточной миндалины: передняя на уровне заднего края сошника, задняя - на 3-4 мм кзади от глоточной ямки (сумки); боковые - наиболее глубокая точка розенмюллеровых ямок (Иванов А. И., 1988).
Макроскопически глоточную миндалину все авторы описывали в виде 5-9 валикообразных складок различной величины и борозд между ними. Углубления между складками носят названия лакун, которые подразделяются на крупные и мелкие. Лакуны глоточной миндалины не ветвятся, менее глубокие и более открытые, по сравнению с криптами нёбных миндалин (Иноченци-Ларионова Т.И., 1960). Они имеют вид прямых или извилистых борозд, направленных кранио-каудалыю. В лакуны открываются выводные протоки слизистых и смешанных желез (Семченко Ю.П., 1967).
Независимо от размера глоточной миндалины, в ней всегда видна срединная борозда, которая делит орган на две половины (Карпов Н.А., Сиповский Н.В., 1956). Наиболее глубокая и заметная часть борозды названа глоточной сумкой или ямкой. Последняя, по описанию Н. Lushka (1868), лежит в центре глоточной миндалины и является остатком некогда существовавшего гипофизарного канала (карман Ратке). По мнению различных авторов, в случае окклюзии глоточной сумки с формированием полости, заполненной секретом, последняя носит название сумки или кисты Торнвальда (Козлов B.C., Шиленкова В.В., Карпов В.А., 2009). По В.П. Воровьеву (1958) глоточная сумка лежит ниже миндалины, на границе между верхней и задней стенками носоглотки по срединной линии, в месте перехода мерцательного эпителия в многослойный плоский (Воробьев В. П., 1958). В целом, в литературе описываются различные варианты строения и расположения лимфаденоидной ткани глоточной миндалины: по расположению, по форме, по внешнему виду. У новорожденных L. Testut (1928) различал три типа строения глоточной миндалины: веерообразную с мелкими лимфоидными валиками; тип крупных лимфоидных валиков и тип с добавочными гранулами, расположенными на поверхности лимфоидных валиков (Testut L., Jacob О., 1929).
Е.В. Шишмарева (2005) описывает следующие варианты строения глоточной миндалины: продольно бороздчатая - борозды ориентированы в сагиттальной плоскости, поперечно бороздчатая - борозды имеют горизонтальное направление, смешанная (Козлов B.C., Шиленкова В.В., Карпов В.А., 2009).
Артериальное кровоснабжение глоточной миндалины происходит от ветвей восходящей глоточной и нёбной артерий. Входящие артерии разветвляются в соединительнотканной строме миндалины, образуют под эпителием веерообразные петли (субэпителиальные артериолы), огибают лимфатические фолликулы и формируют анастомозы, отдавая единичные капилляры к центру фолликулов. Посткапиллярные венулы с высоким эндотелием располагаются в основном у нижних полюсов фолликулов и в субэпителиальной зоне, также как и в других лимфоэпителиальных образованиях принимают участие в поступлении лимфоцитов в ткань миндалины из кровотока (Umetani Y., 1977; S.T. Pals et al., 1986; Girard J.P., Springer T.A., 1995; Csencsits K.L., Jutila M.A., Pascual D.W., 1999; Быкова В. П., Бруевич О. А., Паюшина О.В., 2007). Венозный отток осуществляется по одноименным венам.
В паренхиме миндалины межфолликулярные и парафолликулярные лимфатические капилляры собираются у нижних полюсов фолликулов в эфферентные лимфатические коллекторы, которые по выходе из миндалины впадают в медиальные и латеральные заглоточные лимфатические узлы (Мельник П.А., 1969), а оттуда, через truncus lymphaticus в общий кровоток. По данным В.Т. Талалаева (1928) и П.В. Сиповского (1956) глоточная миндалина не имеет афферентных лимфатических сосудов и сквозного тока лимфы, являясь неинкапсулированным органом (Карпов Н.А., Сиповский Н.В., 1956).
Иннервация миндалины осуществляется ветвями блуждающего и языкоглоточного нерва, а также ветвями крылонёбного узла и верхнего шейного сплетения, распространяющимися в ткань миндалины по ходу приносящих артерий и артериол (Гордон Д.С., 1956; Солдатов И.Б., 1962). В ткани глоточной миндалины отсутствуют инкапсулированные нервные окончания, свободные же нервные окончания подходят к стенкам сосудов и периферической зоне лимфоидных узелков, иногда проникая в них (Гордон Д.С., 1957).
Макроскопическая характеристика аденоидов в возрастном аспекте
На гистологических срезах толщиной 4-5 мкм и 7-9 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, при световой микроскопии в структуре глоточной миндалины четко дифференцировалась фолликулярная и парафолликулярная лимфоидная ткань, а также эпителиальным пласт, выделяя компоненты криптолимфонов.
Фолликулярная и диффузная лимфоидная ткань была распределена весьма неравномерно, несколько напоминая строение лимфатического узла. Вторичные лимфатические фолликулы с морфологически различимыми зонами располагались в один ряд под эпителиальным пластом между плотно упакованной диффузной парафолликулярной лимфоидной тканью, при правильной продольной ориентации среза обладали выраженной полярностью. Наряду с описанной структурой встречались участки диффузной лимфоидной ткани, лишенной фолликулов и/или с наличием дискретно расположенных первичных фолликулов.
В отличие от небных, глоточная миндалина покрыта однослойным многорядным мерцательным эпителием респираторного типа, который находился в состоянии ретикуляции, базальноклеточной гиперплазии, переходноклеточнои метаплазии или сохранял гистотипическое строение с бокаловидными и мерцательными клетками.
Поскольку удаление аденоидных вегетации выполнялось вне обострения, мы редко находили в глоточных миндалинах выраженные воспалительные изменения. Крайне редко встречалась скудная лейкоцитарная инфильтрация, гиперемия, отек субэпителиальной зоны диффузной лимфоидной ткани. Количество бокаловидных клеток варьировало и было по разному представлено в выделенные возрастные периоды.
В выделенных возрастных группах обращали внимание разноразмерность и распределение фолликулов: у детей I группы более крупные, расположены близко друг к другу, а у детей II и III возрастных групп преобладали фолликулы средних и мелких размеров соответственно, расположенные дискретно среди широких полей диффузной лимфоидной ткани (Рисунок 1-4). Крайне редко среди детей II и Ш-ей возрастных групп встречались крупные фолликулы.
При первом морфометрическом исследовании средняя абсолютная площадь фолликула у детей I возрастной группы составила 2,62±1,74x10 мкм" (средняя±2 ошибки среднего), у детей II возрастной группы 2,1±1,34х10 мкм", а у детей Ш-ей возрастной группы этот показатель составили 1,65±1,71х10 мкм" (График 1).
Средняя относительная площадь фолликулярного компонента криптолимфона у детей I возрастной группы составила 49,55±7,82% (средняя±2 стандартных отклонения), у детей II возрастной группы 43,4± 12,62%, а у детей Ш-ей возрастной группы 37,76±9,44%. Средняя относительная площадь диффузной лимфоидной ткани криптолимфона у детей I возрастной группы составила 40,18±10,26%, у детей II и Ш-ей возрастной группы 47,4±13,60% и 52,17± 10,94%) соответственно (График 2).
В то же время относительная площадь эпителиального компонента криптолимфона составила: у детей I группы 10,37±5,40%, у детей II и Ш-ей групп 9,20±3,10% и 10,06±4,26% соответственно.
Таким образом, морфометрическое исследование выявило статистически достоверные (р 0,05) реципрокные отношения («ножницы») между относительными площадями фолликулярной и диффузной лимфоидной ткани в выделенных возрастных группах: снижение площади фолликулов по мере взросления детей и нарастание площади диффузной лимфоидной ткани, что также было подтверждено вычислением рангового коэффициента корреляции Спирмена (сводные статистические данные приведены в Приложении №2, Таблицах 1-4).
Поскольку выявлена статистически достоверная возрастная разница в структуре глоточной миндалины при морфометрическом исследовании компонентов криптолимфона, а морфофункциональной единицей глоточной миндалины является криптолимфон, мы полагаем, что дальнейшее описание гистологической структуры, иммуногистохимических показателей и морфометрических данных выделенных компонентов криптолимфона в возрастной динамике наиболее рационально.
Гистологическая, иммуногистохимическая и морфометрическая характеристика диффузной лимфоидной ткани глоточной миндалины
При световой микроскопии препаратов глоточной миндалины детей всех возрастных групп, окрашенных гематоксилином и эозином, сразу под базальной мембраной эпителиального пласта находился собственный слой слизистой оболочки, в котором располагалась плотно упакованная диффузная лимфоидная ткань, содержащая первичные и вторичные лимфатические фолликулы (Рисунок 30-31).
У детей I возрастной группы встречались участки диффузной лимфоидной ткани, лишенные фолликулов или с наличием единичных больших дискретно расположенных фолликулов.
В целом диффузная лимфоидная ткань была представлена малыми лимфоцитами с тонким ободком очень плотной цитоплазмы и базофильным ядром, а также обнаруживались гистиоциты, эозинофилы, плазматические клетки, последние располагались преимущественно в субэпителиальной зоне.
По отношению к фолликулу и эпителию, диффузная лимфоидная ткань могла быть условно разделена на межфолликулярную, располагающуюся между фолликулами, субэпителиальную и зону сосудистого слоя.
Субэпителиальная зона диффузной лимфоидной ткани аденоидов детей всех возрастных групп была несколько плотнее диффузной межфолликулярной и диффузной лимфоидной ткани сосудистого слоя. В диффузной лимфоидной ткани сосудистого слоя обнаруживались отводящие лимфатические коллекторы, артериолы, венулы (Рисунок 32). Преимущественно у нижних полюсов фолликулов располагались посткапиллярные венулы, с крупным кубовидным эндотелием с обильной базофильной цитоплазмой (Рисунок 33-34).
У детей III возрастной группы в сосудистой зоне обнаруживались умеренные явления склероза и незначительного гиалиноза артериол (Рисунок 34: а-б).
При иммуногистохимическом исследовании эндотелиальные клетки артериол, венул и лимфатических капилляров экспрессировали молекулу CD34, выявляя общую архитектонику сосудистого русла (Рисунок 35).
Лимфоциты диффузной лимфоидной ткани аденоидов детей всех возрастных групп экспрессировали молекулы CD3 и CD5 (Рисунок 36, 37).
В тоже время в диффузной лимфоидной ткани обнаруживались В лимфоциты, экспрессирующие молекулы CD19, CD20, CD79a (Рисунок 38, 39), при этом лимфоциты лимфоцитарной короны экспрессировали преимущественно молекулу CD79a (Рисунок 40).
При морфометрическом исследовании среднее относительное количество В лимфоцитов диффузной лимфоидной ткани, экспрессирующих CD20 у детей I возрастной группы составило 25,44±1,56% (средняя±2 ошибки среднего), у детей II и III возрастной группы аналогичный показатель составил 22,74±1,14% и 23,94±0,66% соответственно (сводные статистические данные приведены в Приложении №2, Таблицах 7-8).
Из графика 5 следует, что относительное количество В лимфоцитов в диффузной лимфоидной ткани экспрессирующих молекулу CD20 остаётся постоянным, вне зависимости от возраста, что также подтверждено при статистическом исследовании.
Молекула КІ67 также экспрессировалась клетками диффузной лимфоидной ткани аденоидов детей выделенных возрастных групп (Рисунок 41,42).
При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток диффузной лимфоидной ткани, экспрессирующих КІ67 у детей I возрастной группы составило 21,02±2,30% (средняя±2 ошибки среднего), у детей II и III возрастной группы аналогичный показатель составил 15,79±2,88% и 13,10±1,28% соответственно (сводные статистические данные приведены в Приложении №2, таблицах 10-12).
Из графиков 6 и 7 следует, что относительное количество клеток диффузной лимфоидной ткани экспрессирующих молекулу КІ67 снижается по мере взросления детей, что также подтверждено при вычислении рангового коэффициента корреляции Спирмена.
При дальнейшем иммуногистохимическом исследовании в диффузной лимфоидной ткани, преимущественно в субэпителиальной зоне обнаруживались клетки моноцитарно-макрофагального ряда, экспрессирующие молекулу CD68. При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток диффузной межфолликулярной лимфоидной ткани и лимфоидной ткани сосудистого слоя, экспрессирующих CD68 у детей I возрастной группы составило 4,02±0,36% (средняя±2 ошибки среднего), у детей II и III возрастной группы аналогичный показатель составил 4,02±0,28% и 4,27±0,44% соответственно.
При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток диффузной лимфоидной ткани в субэпителиальной зоне экспрессирующих CD68 у детей I возрастной группы составило 7,87±1,18% (средняя±2 ошибки среднего), у детей II и Ш-ей возрастной группы аналогичный показатель составил 6,47±0,34% и 8,84±1,00% соответственно.
Из графиков 8 и 9 следует, что относительное количество клеток диффузной лимфоидной ткани экспрессирующих молекулу CD68 остаётся постоянным, вне зависимости от возраста, что также подтверждено при статистическом исследовании.
При детальном иммуногистохимическом исследовании в парафолликулярной лимфоидной ткани нами были обнаружены клетки с фенотипом кортикальных тимоцитов, экспрессирующие молекулы TdT и CD 1а и образующие инфильтраты окружающие нижний полюс фолликулов (Рисунок 43).
При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток диффузной лимфоидной ткани экспрессирующих молекулу TdT у детей I возрастной группы составило 9,72±3,92% (средняя±2 ошибки среднего), у детей II и III возрастной группы аналогичный показатель составил 6,43±3,20% и 5,81±3,94% соответственно. Среднее относительное количество клеток диффузной лимфоидной ткани экспрессирующих молекулу CD 1а у детей I возрастной группы составило 8,36±2,20% (средняя±2 ошибки среднего), у детей II и III возрастной группы аналогичный показатель составил 6,77±4,14% и 2,10± 1,60% соответственно.
Гистологическая, иммуногистохимическая и морфометрическая характеристика фолликулярного компонента криптолимфона глоточной миндалины
При световой микроскопии препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в структуре аденоидов детей всех возрастных групп встречались первичные лимфатические фолликулы и вторичные лимфатические фолликулы с герминативными центрами.
Единичные разноразмерные первичные лимфатические фолликулы обнаруживались у детей I возрастной группы, они располагались в диффузной парафолликулярной лимфоидной ткани и были представлены мелкими клетками с очень плотной цитоплазмой и базофильным ядром (Рисунок 46 а, б).
На гистологических препаратах глоточных миндалин детей всех возрастных групп, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаруживались вторичные фолликулы.
В пределах одного гистологического среза обращали внимание форма, разноразмерность и расположение вторичных фолликулов, а также зональность герминативных центров (Рисунок 47).
Так, у детей I группы среди крупных округлых и эллипсоидных вторичных фолликулов, расположенных близко друг к другу и окруженных 2-4 рядами лимфоцитов мантийной зоны, встречались единичные округлые вторичные фолликулы меньших размеров (средние и мелкие) с широкой мантийной зоной и небольшим герминативным центром.
Данное наблюдение мы расценивали как результат среза, который отражает уровень сечения не по диаметру вторичного фолликула, а по параллели к диаметру, что подтверждалось обнаружением этого же фолликула с выраженной полярностью на серийных срезах. Встречались единичные округлые вторичные фолликулы, представленные сплошь клетками с очень плотной цитоплазмой и базофильным ядром и лишь небольшой группой центробластов в центре.
У детей II возрастной группы среди округлых вторичных фолликулов средних размеров встречались единичные вторичные фолликулы эллипсоидной формы, единичные фолликулы были мелких размеров и окружены 6-10 рядами клеток типа малых лимфоцитов.
На гистологических срезах глоточной миндалины детей III возрастной группы среди вторичных фолликулов округлой и эллипсоидной формы мелких размеров, расположенных дискретно среди широких полей диффузной лимфоидной ткани, встречались единичные фолликулы мелких размеров, представленные сплошь клетками с очень плотной цитоплазмой и базофильным ядром. Наблюдение разноразмерности вторичных фолликулов и побудило нас к проведению морфометрического исследования.
Описанное в литературе зональное строение герминативных центров вторичных фолликулов в силу двухмерное изображения и различного уровня залегания и ориентации фолликулов прослеживалось не в каждом случае. На гистологических срезах глоточной миндалины, окрашенных гематоксилином и эозином, у детей всех возрастных групп обнаруживались вторичные фолликулы, герминативные центры которых были представлены лишь центробластами или центроцитами с единичными макрофагами или без них. Встречались вторичные фолликулы, в герминативных центрах которых обнаруживалось большое количество макрофагов по всей плоскости среза. Присутствие вариабельного количества макрофагов в герминативных центрах фолликулов, возможно, отражало фазу иммунного ответа. Однако высказаться окончательно в отношении фазы иммунного ответа не представляется возможным, поскольку исследованный биопсионный материал относился к детям, постоянно встречающимся с внешним антигенным окружением. Зональное строение и разноразмерность вторичных фолликулов подтвердили серийные гистологические срезы.
При продольной ориентации среза вторичные фолликулы не только имели форму эллипса, но и обладали выраженной полярностью, которая проявлялась различием между базальной частью фолликула, которая прилежала к сосудистому слою, и апикальной - обращенной к эпителию. При правильной ориентации фолликула по отношению к его оси в герминативных центрах обнаруживались две основные зоны, каждая из которых содержала морфологически различимые популяции лимфоцитов (Рисунок 48 а. б, в).
Тёмная зона (зона центробластов) располагалась в удаленной от эпителия базальной части герминативного центра и была представлена близко расположенными клетками с большим пузырьковидным умеренно базофильным ядром, относительно небольшой базофильной цитоплазмой. Обращало внимание большое количество фигур митозов (Рисунок 49 а). Кроме того в этой зоне располагались крупные макрофаги, содержащие в своей цитоплазме фрагменты ядерного хроматина (рисунок 49 б). Зона центробластов постепенно переходит в светлую часть герминативного центра фолликулов -зону центроцитов. Зона центроцитов была представлена клетками с умеренно базофильными, но полиморфными ядрами и более выраженной цитоплазмой. По мере приближения к лимфоцитарной короне в зоне центробластов отмечалось нарастающее количество средних и малых лимфоцитов.
При иммуногистохимическом исследовании лимфоциты, составляющие первичные фолликулы, экспрессировали CD 19, CD20 - маркеры В лимфоцитов, а также молекулу bcl-2 (Рисунок 51).
По периметру первичных фолликулов обнаруживались единичные капилляры, эндотелий которых экспрессировал молекулу CD34.
Описанное полярное строение вторичных фолликулов аденоидов детей всех возрастных групп прослеживалось не только при окраске гематоксилином и эозином, но и при иммуногистохимическом исследовании.
При иммуногистохимическом исследовании центробласты находились в различных фазах клеточного цикла (кроме GO), на что указывала экспрессия молекулы КІ67 - высокоселективного маркера пролиферативной активности (Рисунок 52).
При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток герминативного центра, экспрессирующих КІ67 у детей I возрастной группы составило 72,52±2,74% (средняя±2 ошибки среднего), у детей II возрастной группы 70,40±2,04, а у детей III возрастной группы аналогичный показатель составил 71,35±3,42% (сводные статистические данные приведены в Приложении №2, Таблицах 9-10).
Из графика 12 следует, что относительное количество клеток в герминативном центре, экспрессирующих молекулу КІ67, остаётся постоянным вне зависимости от возраста, что также подтверждено при статистическом исследовании.
Центроциты, центробласты герминативных центров вторичных фолликулов аденоидов детей всех возрастных групп экспрессировали транскрипционный фактор bcl-6 (Рисунок 53).
При морфометрическом исследовании среднее относительное количество клеток герминативного центра, экспрессирующих bcl-6, у детей I возрастной группы составило 40,28±1,76% (средняя±2 ошибки среднего), у детей II возрастной группы 37,41 ±1,18, а у детей III возрастной группы аналогичный показатель составил 36,00±1,20%.