Патоморфологическое исследование миелофиброза при хроническом лимфолейкозе в динамике лечения Шоленберг Евгений Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Современные представления о структурно функциональных особенностях костномозгового микроокружения. роль миелофиброза и пато морфологического исследования костного мозга при хроническом лимфолейкозе 13

1.1. Стромальное костномозговое микроокружение в норме. Представление о миелофиброзе 13

1.2. Этиопатогенез миелофиброза 18

1.3. Клиническая значимость миелофиброза 25

1.4. Диагностика миелофиброза 26

1.5. Значение патоморфологического исследования костного мозга и миелофиброза у пациентов с хроническим лимфолейкозом 29

1.6. Резюме 40

Собственные исследования

Глава II. Характеристика клинических наблюдений и методы исследования 42

2.1. Общая характеристика клинических наблюдений 42

2.2. Методы клинического исследования 44

2.3. Цитологические методы исследования периферической крови и костного мозга 45

2.4. Методы патоморфологического исследования 46

2.5. Методы статистического анализа 48

Глава III. Патоморфологическое исследование миелофиброза при хроническом лимфолейкозе 49

3.1. Характеристика миелофиброза при хроническом лимфолейкозе в активной фазе заболевания и у пациентов, ответивших на лечение 49

3.2. Изучение взаимосвязи миелофиброза и опухолевой ткани при хроническом лимфолейкозе

3.3. Резюме

Глава IV. Анализ взаимосвязей миелофиброза, клеточных популяций костного мозга и клинических проявлений хронического лимфолейкоза 66

4.1. Изучение взаимосвязи миелофиброза и ростков гемопоэза в активной фазе хронического лимфолейкоза 66

4.2. Изучение взаимосвязи миелофиброза и ростков гемопоэза у пациентов, ответивших на химиотерапию 68

4.3. Изучение ассоциаций миелофиброза и клеток костномозгового микроокружения 70

4.4. Клиническая и прогностическая значимость миелофиброза при хроническом лимфолейкозе 72

4.5. Резюме 74

Глава V. Патоморфологические особенности миелофиброза при хроническом лимфолейкозе. клиническая и прогностическая значимость миелофиброза (обсуждение результатов исследования) 77

Заключение 84

Выводы 86

Практические рекомендации 88

Список сокращений

• Этиопатогенез миелофиброза
• Цитологические методы исследования периферической крови и костного мозга
• Изучение взаимосвязи миелофиброза и опухолевой ткани при хроническом лимфолейкозе
• Изучение взаимосвязи миелофиброза и ростков гемопоэза у пациентов, ответивших на химиотерапию

Введение к работе

Актуальность темы. Распространенность хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) постоянно растет. Каждый год заболеваемость ХЛЛ составляет 3 – 3,5 на 100 тысяч населения, среди лиц старше 65 лет – до 20 на 100 тыс. населения. Примерно 70% пациентов заболевают в промежутке между 50 и 70 годами. Средний возраст при дебюте заболевания – 55 лет, менее 10% заболевают, будучи моложе 40 лет (Волкова М.А., 2007).

Большое значение в диагностике ХЛЛ имеет гистологическое исследование костного мозга, которое позволяет определить тип опухолевого поражения и оценить изменения костномозгового микроокружения, что дает возможность спрогнозировать течение заболевания (Ругаль В.И. и др., 2013). При этом одними из наиболее важных компонентов стромального микроокружения являются волокна соединительной ткани (прежде всего, коллагеновые волокна), гиперпродукция которых приводит к развитию миелофиброза (МФ) (Crawford S.E. et al., 1998).

Частота встречаемости МФ при ХЛЛ относительно небольшая – от 10 до 20% (Kimura A. et al., 1993). Понимание механизмов формирования МФ при ХЛЛ необходимо не только с точки зрения выяснения фундаментальных основ патологии, но и, в первую очередь, для определения терапевтических мишеней и методов воздействия на них (Pallasch Ch.P. et al., 2006; Seitz G. et al., 2006; West D. et al., 2006).

Известно, что взаимоотношения «строма – паренхима» в системе кроветворения являются основополагающими для нормального развития и созревания лимфоидных и миело-идных клеток. В настоящее время доказано, что дефекты стромы могут играть основную роль в развитии гемобластозов (Krause D. et al., 2011), при этом точные механизмы развития МФ при ХЛЛ до конца не понятны. По некоторым данным, среда с опухолевыми В-лимфоцитами содержит высокую концентрацию ИЛ-1, который усиливает активность костномозговых фибробластов; показана корреляция уровня ИЛ-1 с ретикулиновым МФ (Kimura A. et al., 1993).

К основным причинам развития МФ при ХЛЛ могут относиться естественное течение заболевания и/или проводимое лечение (Lemancewicz D. et al., 2004). После лечения ретикулиновый МФ обратим, при этом происходит восстановление нормальной архитектоники костного мозга; коллагеновый МФ только частично подвергается обратному развитию на фоне химиотерапии. Часто ретикулиновый и коллагеновый МФ наблюдаются в участках опухолевой инфильтрации костного мозга при ХЛЛ. После лечения снижение ыраженности опухолевого поражения костного мозга обычно ассоциировано с уменьшением распространенности МФ.

Клинико-лабораторная и прогностическая значимость МФ у пациентов с ХЛЛ изучена мало. Известно, что МФ при ХЛЛ связан с более тяжелым течением болезни и пониженной выживаемостью. Общая 5-летняя выживаемость при МФ 0-1 наблюдается у 86,9% пациентов, в то время как при МФ 2-3 – только у 51,9%. Смертность в течение 5 лет при начальном МФ составляет 10,2%, при выраженном – 39,7%. Выраженный МФ чаще, чем начальный, сопровождается анемией и тромбоцитопенией (Tadmor T. et al., 2013).

Исходя из имеющихся фактов, можно говорить о большой клинико-патогенетической значимости исследования МФ при ХЛЛ. Однако ввиду недостаточности статистических данных и неточной количественной оценки фиброзной ткани в костном мозге МФ до сих пор не входит в состав критериев прогноза. Следовательно, необходимо

дальнейшее углубленное изучение патогенетических взаимосвязей опухолевой прогрессии и изменений, происходящих в костномозговом микроокружении, а также определение клинико-лабораторной и прогностической значимости этих изменений.

Степень разработанности темы исследования. В последнее время возрастает количество исследований, посвященных изучению роли МФ при ХЛЛ (Pallasch Ch.P. et al., 2006; Seitz G. et al., 2006; West D. et al., 2006). Проводятся исследования по выяснению основных причин развития МФ (Lemancewicz D. et al., 2004), а также по изучению ассоциаций выраженности МФ с тяжестью течения ХЛЛ (Tadmor T. et al., 2013). В то же время, малоизученными остаются вопросы о взаимосвязях костномозгового микроокружения и МФ при ХЛЛ. Недостаточно освещены ассоциации МФ и клинических проявлений заболевания, влияния развития МФ на гемопоэз.

Цель исследования – изучить частоту, выраженность и распространенность миело-фиброза при хроническом лимфолейкозе в динамике химиотерапии, установить взаимосвязи между миелофиброзом и клинико-лабораторными показателями для определения его прогностической значимости.

Задачи исследования:

1. Установить частоту встречаемости миелофиброза, определить структурные особенности и выраженность миелофиброза при ХЛЛ в динамике химиотерапии.

2. Определить гистологические варианты опухолевого поражения костного мозга в трепанобиоптатах подвздошной кости. Провести автоматизированное морфометрическое исследование распространенности опухолевого поражения костного мозга в динамике химиотерапии ХЛЛ.

3. Исследовать взаимосвязи между выраженностью миелофиброза и показателями ростков гемопоэза, клеток костномозгового микроокружения в трепанобиоптатах подвздошной кости в динамике химиотерапии.

4. Изучить корреляции и ассоциации миелофиброза с различными клиническими факторами. Выявить взаимосвязи между распространенностью и выраженностью миело-фиброза и патоморфологическими изменениями печени и селезенки.

5. Определить прогностическую значимость миелофиброза при ХЛЛ.

Научная новизна. Впервые по данным патоморфологического и автоматизированного морфометрического исследования трепанобиоптатов подвздошной кости определена частота, структура и распространенность МФ в различные фазы ХЛЛ. Установлено, что МФ развивается в 27% наблюдений активной фазы ХЛЛ (дебют, рецидив и прогрессия), при этом в трепанобиоптатах преобладает сочетание начального и выраженного МФ. При рецидиве и прогрессии частота и распространенность МФ выше, чем в дебюте заболевания. У пациентов, которые ответили на лечение, МФ встречается в 29% случаев, при этом доминирует начальный МФ.

Впервые показано, что при МФ чаще встречается диффузный тип опухолевого поражения костного мозга. Распространенность как начального, так и выраженного МФ напрямую взаимосвязана с распространенностью (объемом) опухолевой ткани в костном мозге, содержанием лимфоцитов в миелограмме и числом лимфоцитов в периферической крови.

Выявлена прямая связь между продолжительностью заболевания и выраженностью МФ: по данным однофакторного анализа, выраженный МФ ассоциирован с длительностью ХЛЛ более 2,6 лет. Ассоциации начального МФ с длительностью ХЛЛ не обнаружено.

По данным многофакторного анализа, выявлены ассоциации начального МФ с такими факторами, как содержание лимфоцитов в миелограмме более 30%, число лимфоцитов

в периферической крови более 12,5х10⁹/л, распространенность опухолевой ткани в трепа-нобиоптате более 48%. Выраженный МФ ассоциирован с содержанием лимфоцитов в ми-елограмме более 41%, числом лимфоцитов в периферической крови более 15,7х10⁹/л, распространенностью опухолевой ткани в трепанобиоптате более 64%.

Впервые проанализированы взаимосвязи между выраженностью МФ и показателями ростков кроветворения при ХЛЛ. Обнаружено, что как в активной фазе ХЛЛ, так и при достижении частичной или полной ремиссии наименьшие значения показателей эритрона, мегакариоцитарно-тромбоцитарного и гранулоцитарного ростков встречаются при выраженном МФ. Установлена обратная взаимосвязь между распространенностью как начального, так и выраженного МФ и показателями гемопоэза.

Впервые при исследовании клеточного состава костномозгового микроокружения в активной фазе ХЛЛ выявлена прямая корреляция между процентным содержанием фиб-робластов и процентным содержанием лимфоцитов в миелограмме, а также их числом в периферической крови. Обнаружено, что между показателями эритрона и числом клеток костномозгового микроокружения, имеющих отношение к развитию МФ, существует отрицательная корреляция.

Впервые выявлено, что распространенность как начального, так и выраженного МФ напрямую взаимосвязана с размерами печени и селезенки, полученными по данным УЗИ.

Установлены морфологические критерии, отражающие неблагоприятный прогноз ХЛЛ: распространенность начального МФ в трепанобиоптате более 20%, распространенность выраженного МФ более 11%, а также диффузный тип опухолевого поражения костного мозга в дебюте ХЛЛ.

Теоретическая и практическая значимость. Получена новая информация о выраженности и распространенности МФ при ХЛЛ в динамике химиотерапии, в том числе в зависимости от специфики опухолевого поражения костного мозга. Выявлены корреляции и ассоциации МФ с некоторыми клиническими и лабораторными показателями, которые указывают на его прогностическую значимость.

Автоматизированное морфометрическое исследование МФ в трепанобиоптатах подвздошной кости при ХЛЛ имеет значительные преимущества перед его оценкой исключительно по шкале Европейского консенсуса. Данный способ позволяет объективизировать диагностику, а именно, наряду с морфологическими особенностями (наличием и соотношением разных видов соединительнотканных волокон) определить площадь очагов МФ, т.е. его распространенность в трепанобиоптатах.

Результаты проведенного исследования демонстрируют важность комплексного па-томорфологического анализа трепанобиоптатов подвздошной кости, при котором необходимо оценивать распространенность начального и выраженного МФ, составляющих основу прогноза ХЛЛ, а также тип опухолевого поражения костного мозга. Эти показатели целесообразно включить в состав факторов прогноза ХЛЛ.

Методология и методы исследования. Методология исследования основана на применении принципов и методов комплексного структурного анализа патологических процессов, использования теоретических разработок и обобщений о микроокружении стромы и о миелофиброзе. В работе применены современные методы цитологического и патоморфологического анализа и обработки полученных данных. Объект исследования – аспираты костного мозга, трепанобиоптаты подвздошной кости, мазки периферической крови пациентов с ХЛЛ. Предмет исследования – патоморфологические особенности МФ в динамике химиотерапии и связь этих изменений с состоянием ростков гемопоэза, осо-

бенностями клеточного состава костномозгового микроокружения и клиническими проявлениями заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту.

6. Активная фаза ХЛЛ сопровождается развитием МФ в 27% наблюдений, при этом чаще отмечается сочетание начального и выраженного МФ. В рецидиве и прогрессии частота и распространенность начального и выраженного МФ больше, чем в дебюте. У пациентов, ответивших на лечение, МФ встречается в 29% случаев, преобладает начальный МФ. Распространенность МФ при частичной и полной ремиссии меньше, чем в активной фазе.

7. Имеются различия в частоте встречаемости типов опухолевого поражения костного мозга в зависимости от наличия МФ. В дебюте, а также при рецидиве и прогрессии ХЛЛ распространенность как начального, так и выраженного МФ прямо коррелирует с распространенностью опухолевой ткани в костном мозге, содержанием лимфоцитов в миело-грамме и числом лимфоцитов в периферической крови.

8. Наибольшее угнетение ростков гемопоэза отмечается при выраженном МФ, степень угнетения коррелирует с распространенностью МФ как в активную фазу ХЛЛ, так и в фазу ремиссии. Обнаружены взаимосвязи между распространенностью начального и выраженного МФ и числом клеток костномозгового микроокружения. Наблюдается отрицательная зависимость между уровнем показателей эритрона и количеством клеток костномозгового микроокружения, которые отражают распространенность МФ.

9. Клинические проявления ХЛЛ коррелируют с выраженностью МФ. Неблагоприятными прогностическими факторами являются распространенность начального МФ в трепанобиоптате более 20%, выраженного МФ – более 11%, а также диффузный тип опухолевого поражения костного мозга в дебюте ХЛЛ.

Степень достоверности результатов диссертации. Были использованы современные методы патоморфологического, цитологического и морфометрического исследования костного мозга, способы статистической обработки данных. Они соответствуют поставленным целям исследования, его задачам и способствуют получению достоверных результатов. Количество клинических наблюдений, на основе которых выполнена диссертация, является достаточным (80 пациентов с ХЛЛ), исследования проводились с применением сертифицированного оборудования. Научные положения, выводы и практические рекомендации, сформулированные в ходе работы, не носят характера умозрительных заключений, вытекают из результатов работы и основаны на результатах собственных исследований.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всероссийской конференции, посвященной 155-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова «Актуальные вопросы патологической анатомии в мирное и военное время» (Санкт-Петербург, 2014), 7-й Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2015), Научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2016), межлабораторной научной конференции ФГБНУ «Институт молекулярной патологии и патоморфологии» (Новосибирск, 2016).

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в гематологическом отделении с блоком асептических палат и патологоана-томическом отделении ГБУЗ НСО «Новосибирская Государственная областная клиническая больница», а также в лаборатории молекулярно-клеточных и иммуноморфологических основ онкогематологии ФГБНУ «Институт молекулярной патологии и патоморфологии».

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Работа представляет собой самостоятельное научное исследование, проведенное на высоком методическом уровне. Все исследования, обзор литературы, анализ и интерпретация морфологических данных, статистическая обработка результатов выполнены лично автором.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 7 работ, в том числе 5 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России для публикаций основных результатов исследования.

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 105 страницах компьютерного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы – 1 глава, характеристики клинических наблюдений и методов исследования – 1 глава, результатов собственных исследований – 2 главы, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Текст иллюстрирован 20 таблицами и 19 рисунками.

Этиопатогенез миелофиброза

Коллаген III-го типа формируется из трех 1[III]молекул. Посттрансляционные модификации, такие как добавление глюкозных и галактозных остатков к лизингидроксильным группам, выполняются в аппарате Гольджи. Коллагеновые молекулы не формируются в фибриллы и волокна до тех пор, пока не произойдет их секреция в экстрацеллюлярное пространство и удаление N- и C-концевые пропептидов экстрацеллюлярными проколлагенпепти-дазами (Bauermeister D.E., 1971).

Впервые термин «ретикулин» ввел в 1892 г. Зигфрид для того, чтобы охарактеризовать порошкообразную субстанцию, остающуюся после экстрагирования желатина из коллагеновых «ретикулиновых» волокон. Целью было отличить химически межфибриллярное вещество (т. н. «ретикулин») от интактных коллагеновых волокон. Впоследствии термин «ретикулин» определили как «аргирофильные волокна, идентифицируемые различными методами с включением серебра» (Beckman E.N., Brown A.W., 1990).

Ученые обнаружили, что ретикулин в основном состоит из отдельных фибрилл или маленьких пучков фибрилл коллагена III типа, окружающих сердцевину фибрилл коллагена I типа, при этом все вышеуказанные волокна внедрены в матрицу гликопротеинов и гликозаминогликанов. Ретикулин включает в себя примерно 10% углеводов, в противоположность I-му типу коллагена, который содержит лишь 1% углеводов. Тогда как коллаген I-го типа формирует толстые волокна, коллаген III типа обычно формирует отдельные волокна или маленькие пучки из тонких волокон. Меньший диаметр волокна и увеличенное содержание межфибриллярного вещества и отличают ретикулин от коллагена (Fakoya F.A., 2002; Ushiki T., 2002).

Продукция коллагеновых и/или ретикулиновых фибриллярных белков осуществляется фибробластами костного мозга, которые включают в себя адвентициальные ретикулярные клетки, перисинусоидальные адвентициаль-ные клетки, периартериальные адвентициальные клетки. Выявлена прямая корреляция между ретикулиновыми отложениями и адвентициальными рети кулярными клетками (Puchtler H., 1964).

Состояние, которое характеризуется повышением в костном мозге объема соединительнотканных волокон без точного указания на их количество и качество (ретикулин или коллаген), называется миелофиброзом (МФ). Предполагается, что МФ – комплексный процесс, который включает в себя сборку и накопление коллагеновых компонентов экстрацеллюлярного матрикса и неколлагеновых компонентов экстрацеллюлярного матрикса (фибронектин) (Thiele J., Kvasnicka H.M., 2007).

Однако в связи с этим наблюдается расхождение между патоморфоло-гическим и клиническим определением МФ. Клиническое определение включает в себя лабораторные особенности, которые связаны с экстрамедуллярным кроветворением. Диагностическими критериями миелоидной метаплазии являются: каплевидный эритроцитоз, лейкоэритробластоз, прогрессирующая анемия, спленомегалия, коллагеновый МФ (Tefferi A. et al., 2006). По этой причине ранние (продромальные) стадии ретикулинового фиброза не обнаруживаются клиницистами и выявляются исключительно при регулярном выполнении биопсии костного мозга (Tefferi A., 2005).

Этиология и клиническая значимость МФ еще до конца не ясны. Однако имеются основания для того, чтобы предположить, что клинические осложнения, которые связаны с ретикулиновым фиброзом, отличаются от клинических осложнений, ассоциированных с коллагеновым фиброзом. Некоторые исследования показали, что количество костномозгового ретикулина имеет слабо выраженную взаимосвязь с тяжестью основного заболевания и количеством лейкоцитов, тромбоцитов, уровнем гемоглобина. С другой стороны, присутствие коллагеновых волокон и их число обнаружили сильную взаимосвязь с этими показателями (McCarthy D.M., 1985).

Есть предположения о различном патогенезе коллагенового и ретикулинового МФ. Ретикулиновый МФ часто можно обратить вспять при успешной терапии, в отличие от коллагенового, который обратим с меньшей веро 17 ятностью (Hasselbalch H.C., 1993; Kuter D.J. et al., 2007). Существует ряд нозологий, при которых определяется только ретикулиновый МФ: легочная артериальная гипертензия, волосатоклеточный лейкоз (Gruber G. et al., 1999), висцеральный лейшманиоз, ВИЧ инфекция, лечение гемопоэтическими ростовыми факторами, например, rhTPO (рекомби-нантный человеческий тромбопоэтин), IL-3 (интерлейкин-3) и IL-11 (интер-лейкин-11) (O Malley D.P. et al. 2005; Popat U. et al. 2005; Popat U. et al., 2006).

Достаточное количество заболеваний вызывают оба вида фиброза. Это как доброкачественные состояния: дефицит витамина Д и аутоиммунный ми-елофиброз (клиникопатологическое состояние, которое характеризуется им-мунопатогенетическими механизмами и встречается как изолированно, так и в связи с системными и/или органспецифическими аутоиммунными заболеваниями); так и неопластические состояния: первичный МФ (Pullarkat V. et al., 2003).

Распространенный МФ наиболее характерен для злокачественных заболеваний: острого лимфобластного лейкоза, ХМЛ, острого панмиелоза с МФ, неходжкинских лимфом, лимфомы Ходжкина, миелодиспластического синдрома (в частности, вторичного миелодиспластического синдрома), па-роксизмальной ночной гемоглобинурии, плазмоклеточной миеломы, а также болезней костей и соединительной ткани, остеопетроза, первичного и вторичного гиперпаратиреоидизма, туберкулеза, недостаточности витамина Д, остеомаляции, первичной гипертрофической остеартропатии, других грану-лематозных заболеваний, системной красной волчанки, системной склеродермии, синдрома Шегрена, первичного аутоиммунного миелофиброза, синдрома серых тромбоцитов, антифосфолипидного синдрома, первичного мие-лофиброза, эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ), острого мегакариобластного лейкоза, острого миелолейкоза (ОМЛ), системного мастоцитоза, метастатических опухолей.

Цитологические методы исследования периферической крови и костного мозга

Трепанобиоп-сию подвздошной кости в каждом случае выполняли по строгим медицинским показаниям. Трепанобиоптаты подвздошной кости фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировали в растворе ЭДТА. Обезвоживание и пропитывание парафином проводили в автомате для обработки тканей STP-120. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, по методу ван Гизона, импрегнировали серебром по методу Гомори.

Степень миелофиброза устанавливали согласно шкале Европейского консенсуса (Thiele J. et. al., 2005). МФ 1-й степени (ретикулиновые волокна расположены рыхло, преимущественно в периваскулярных зонах) расценивали как начальный фиброз, МФ 2-й и 3-й степени (увеличение количества диффузно расположенных ретикулиновых волокон с очагами скопления кол-лагеновых волокон или их утолщенными пучками) – как выраженный (Tad-mor T. et al., 2013).

При патоморфологическом анализе выделяли очаговый, диффузный и интерстициальный типы опухолевого поражения костного мозга (Rozman C. et al., 1984). Очаговый тип характеризовало появление одного или нескольких нечетко отграниченных от миелоидной ткани скоплений лимфоидных клеток. Для интерстициального типа характерно расположение лимфоидных инфильтратов в миелоидной ткани между сохранившимся объемом адипоцитов. При диффузном типе лимфоидные клетки занимают все пространство костномозговых полостей с замещением жировой ткани в лакунах губчатой кости. Автоматизированное морфометрическое исследование МФ проводили с использованием программы анализа изображений AxioVision 4.6, камеры Axio Cam, микроскопа Zeiss, компьютера.

В парафиновых срезах трепанобиоптатов, импрегнированных серебром по Гомори и окрашенных по ван Гизону, при увеличении 200 измеряли абсолютную площадь очагов начального МФ (МФ1) и выраженного МФ (МФ2-3). Измерение абсолютной площади гемопоэтической и опухолевой ткани проводили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Изучали все костномозговые полости одного среза, что соответствовало 5-7 полям зрения микроскопа и 20-30 полям зрения камеры (в зависимости от размера среза). Площадь одного поля зрения камеры известна и составляла 364000 мкм2 (0,7 мм2).

Сложив площадь очагов начального/выраженного МФ во всех полях зрения камеры, получали суммарную абсолютную площадь каждого из вариантов в пределах одного среза. Аналогичным образом получали суммарную абсолютную площадь гемопоэтической и опухолевой ткани. Затем вычисляли относительную площадь очагов (распространенность) начального МФ (SМФ1), выраженного МФ (SМФ2-3) и опухолевой ткани (SОП) по формулам: SМФ1 = (абс. площадь очагов МФ1) / (абс. площадь гемопоэт. ткани) 100%; SМФ2-3 = (абс. площадь очагов МФ2-3) / (абс. площадь гемопоэт. ткани) 100%; SОП = (абс. площадь опухолевой ткани) / (n полей зрения 364000) 100%. Также в трепанобиоптатах подвздошной кости подсчитывали число ме-гакариоцитов в срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Число мега-кариоцитов среза трепанобиоптата представляло собой сумму чисел мегака-риоцитов в 20 случайных полях зрения камеры.

Исследование печени и селезенки в аутопсийных наблюдениях. Для гистологического исследования вырезали кусочки размерами 1х1х0,5см из правой и левой доли печени (по 2 из периферической и центральной части), а также из селезенки. Полученные образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин и изготавливали серийные сре 48 зы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа, трихромом по Массону, азур-эозином по Романовскому.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы SPSS (версия 17.0). Результаты отображены в виде M±, где М – среднее арифметическое значение, – стандартное отклонение, а также M±m, где М – среднее арифметическое значение, m – ошибка средней арифметической. Проверку статистической гипотезы о нормальности распределения и равенстве выборочных дисперсий анализируемых данных по SМФ. и Sоп осуществляли с использованием критериев Шапиро-Уилка и Левена.

С целью сравнения средних значений различных выборок использовали t-критерий Стьюдента (в случаях нормального распределения и равенства выборочных дисперсий) или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Связь между двумя переменными выявляли с использованием коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмана. Для однофакторного и многофакторного анализа применяли модель логистической регрессии. Критериями достоверности считали значения вероятности ошибки р 0,05 и отношения шансов (OR) 1,0.

Изучение взаимосвязи миелофиброза и опухолевой ткани при хроническом лимфолейкозе

В рецидиве и прогрессии ХЛЛ обнаружены аналогичные взаимосвязи опухолевой и фиброзной ткани. Относительная площадь очагов начального МФ прямо коррелировала с относительной площадью опухолевой ткани (r=0,491, p=0,025), содержанием лимфоцитов в миелограмме (r=0,399, p=0,009), числом лимфоцитов в периферической крови (r=0,703, p=0,003); распространенность выраженного МФпрямо коррелировала с относительной площадью опухолевой ткани (r=0,542, p=0,013), содержанием лимфоцитов в миелограмме (r=0,961, p=0,007), числом лимфоцитов в периферической крови (r=0,852, p=0,005).

По результатам однофакторного анализа обнаружено, что факторами, ассоциированными с начальным МФ, являются содержание лимфоцитов в миело-грамме более 30% (р=0,009, r=9,83, CI=1,82-72,54), число лимфоцитов в периферической крови более 12,5х109/л (p=0,018, r=9,65, CI=2,26-75,11), диффузный тип опухолевого поражения костного мозга (р=0,001, r=6,70, CI=2,03-98,22), Sоп в трепанобиоптате более 48% (р=0,043, r=7,38, CI=3,74-19,64) (табл. 7).

Выраженный МФ по результатам однофакторного анализа ассоциирован с содержанием лимфоцитов в миелограмме более 41% (р=0,025, r=1,8, CI=0,4-34,5), числом лимфоцитов в периферической крови более 15,7х109/л (p=0,005, r=1,3, CI=1,6-105,3), диффузным типом опухолевого поражения костного мозга (р=0,042, r=1,9, CI=1,6-35,4), Sоп в трепанобиоптате более 64% (р=0,017, r=1,9, CI=1,8-39,0), рецидивом и прогрессией заболевания (р=0,033, r=1,7, CI=0,8-45,6) (табл. 8). Многофакторный анализ показал ассоциацию начального МФ с такими факторами, как содержание лимфоцитов в миелограмме более 30% (р=0,003, r=5,19, CI=1,63-79,12), числом лимфоцитов в периферической крови более 12,5х109/л (p=0,012, r=6,15, CI=2,16-85,14), Sоп в трепанобиоптате более 48% (р=0,014, r=5,38, CI=5,76-21,06).

Выраженный МФ по данным многофакторного анализа ассоциирован с содержанием лимфоцитов в миелограмме более 41% (р=0,017, r=1,7, CI=0,6-38,7), числом лимфоцитов в периферической крови более 15,7х109/л (p=0,001, r=1,6, CI=1,9-154,9), Sоп в трепанобиоптате более 64% (p=0,017, r=2,3, CI=1,4-201,5).

МФ развивается у 27% пациентов в активной фазе ХЛЛ, при этом при рецидиве/прогрессии МФ наблюдается чаще, чем в дебюте заболевания. Сочетание начального и выраженного МФ в трепанобиоптатах подвздошной кости выявляется с большей частотой, чем изолированно начальный или выраженный МФ, как в дебюте, так и в рецидиве ХЛЛ. Распространенность начального и выраженного МФ в рецидиве и прогрессии ХЛЛ оказалась больше, чем в дебюте. Как в дебюте, так и в рецидиве заболевания распространенность начального МФ превысила распространенность выраженного МФ.

В трепанобиоптатах костного мозга опухолевый клон в дебюте, прогрессии и рецидиве заболевания преимущественно имел очаговый рост, реже диффузный и наиболее редко интерстициальный. Самая большая распространенность начального и выраженного МФ отмечены у пациентов с диффузным типом опухолевого поражения костного мозга, как в дебюте, так и при рецидиве/прогрессии ХЛЛ. В дебюте, рецидиве и прогрессии ХЛЛ распространенность как начального, так и выраженного МФ прямо коррелирует с распространенностью опухолевой ткани в костном мозге, содержанием лимфоцитов в миелограмме и числом лимфоцитов в периферической крови.

По данным однофакторного анализа выявлена ассоциация выраженного МФ с длительностью ХЛЛ более 2,6 лет (р=0,007, OR 74,12, 95% CI 3,17 – 347,03). Ассоциации начального МФ с длительностью ХЛЛ не обнаружено.

У большей части пациентов с ХЛЛ, ответивших на лечение (71,1%), МФ отсутствовал. Наличие МФ отмечено у 28,9% пациентов. В структуре МФ доминировал начальный МФ. У меньшей доли пациентов отмечалось сочетание начального и выраженного МФ.

Распространенность начального МФ у пациентов, ответивших на химиотерапию, оказалась достоверно больше, чем распространенность выраженного МФ. В фазе ответа на химиотерапию распространенность начального и выраженного МФ оказалась меньше, чем в дебюте, а также в фазе рецидива и прогрессии заболевания.

По результатам однофакторного анализа обнаружено, что факторами, ассоциированными с начальным МФ, являются содержание лимфоцитов в миелограмме более 30%, число лимфоцитов в периферической крови более 12,5х109/л, диффузный тип опухолевого поражения костного мозга, распространенность опухолевой ткани в трепанобиоптате более 48%.

Выраженный МФ по результатам однофакторного анализа ассоциирован с содержанием лимфоцитов в миелограмме более 41%, числом лимфоцитов в периферической крови более 15,7х109/л, диффузным типом опухолевого поражения костного мозга, распространенностью опухолевой ткани в тре-панобиоптате более 64%, рецидивом и прогрессией заболевания.

Многофакторный анализ показал ассоциацию начального МФ с такими факторами, как содержание лимфоцитов в миелограмме более 30%, число лимфоцитов в периферической крови более 12,5х109/л, распространенность опухолевой ткани в трепанобиоптате более 48%. Выраженный МФ по данным многофакторного анализа ассоциирован с содержанием лимфоцитов в миелограмме более 41%, числом лимфоцитов в периферической крови более 15,7х109/л, распространенностью опухолевой ткани в трепанобиоптате более 64%.

Изучение взаимосвязи миелофиброза и ростков гемопоэза у пациентов, ответивших на химиотерапию

В активной фазе ХЛЛ процентное содержание фибробластов в миело-грамме прямо коррелировало с распространенностью выраженного и начального МФ, содержанием лимфоцитов в миелограмме и их числом в периферической крови, обратно коррелировало с содержанием эритроидных клеток. Процентное содержание адвентициальных клеток обратно коррелировало с содержанием эритроидных клеток в миелограмме.

Костномозговой фибробласт – ключевой клеточный медиатор МФ. Ад-вентициальные клетки являются предшественниками фибробластов. Ретикулярные клетки – это клетки соединительной ткани, участвующие в синтезе коллагена (Гистология, цитология и эмбриология: Учебник для мед. вузов / под ред.: Ю. И. Афанасьева, Н. А. Юриной, 2002). Поэтому более высокая частота и распространенность МФ в активной фазе ХЛЛ характеризуется большим числом данных клеток по сравнению с ремиссией заболевания. Выявленные прямые корреляции между количеством фибробластов и лимфоцитов, а также обратные корреляции между числом фибробластов, адвентици-альных клеток и клеток эритрона вполне закономерны.

В нашей работе показана взаимосвязь МФ и клинических проявлений ХЛЛ. Выявлено, что генерализованная лимфаденопатия, гепатомегалия и спленомегалия при ХЛЛ более часто отмечаются у больных с МФ по сравнению с пациентами без МФ. Выраженный МФ всегда ассоциирован с гепато-мегалией и спленомегалией. Распространенность МФ прямо взаимосвязана с размерами печени и селезенки. Стадия С ХЛЛ характеризуется наибольшей распространенностью как начального, так и выраженного МФ.

Полученные ассоциации и корреляции говорят о тесной взаимосвязи гиперпластического синдрома, связанного с ростом опухоли, и миелофибро-за. Аналогичные взаимосвязи уже выявлены рядом авторов при хроническом миелолейкозе (Ругаль В.И. и др., 2012; Стругов В.В. и др., 2013), множественной миеломе (Бакиров Б.А., 2013), идиопатическом МФ (Криволапов, Ю.А., Леенман Е.Е., 2006).

Имеются данные и о взаимосвязях клинико-лабораторных показателей и МФ при ХЛЛ. Выявлено, что более выраженный МФ ассоциирован с большим уровнем сывороточного 2-микроглобулина. Обнаружена ассоциация развернутой стадии ХЛЛ и выраженного ретикулинового фиброза. Выраженный МФ чаще встречается у пациентов с тромбоцитопенией. У пациентов с МФ 2-3 средний уровень гемоглобина (117 г/л) достоверно ниже среднего уровня гемоглобина (127 г/л), характерного для МФ 0-1 (Tadmor T., et al., 2013).

Полученные результаты объясняются тем, что естественное течение ХЛЛ сопровождается увеличением содержания фиброзных волокон в костном мозге. Степень МФ отражает один из этапов развития, на котором было выявлено заболевание (Tadmor T. et al., 2013).

Таким образом, представленный в работе морфофункциональный анализ паренхиматозно-стромальных взаимосвязей свидетельствует о том, что структурная организация стромальных элементов костного мозга направлена на поддержание динамического равновесия гемолимфопоэза и претерпевает значительные перестройки при ХЛЛ, свидетельствующие об их важной роли в патогенезе заболевания.

На наш взгляд, вероятность важной, если не ключевой роли дефектов стромального микроокружения в патогенезе ХЛЛ очень высока. Отмеченные морфологические особенности стромы костного мозга больных ХЛЛ могут быть обусловлены как первичным поражением кроветворного микроокружения, так и цитокиновым дисбалансом в результате воздействия на строму лейкозного клона. Стромально-паренхиматозные взаимоотношения в системе кроветворения являются базисными для развития и созревания клеточных элементов в норме, что позволяет говорить о роли дефектов стромальных нишеобразующих структур в прогрессии ХЛЛ. Ряд исследователей указывали на прогностическое значение МФ при ХЛЛ (Weistner A., 2003; Tadmor T. et al., 2013). Однако отсутствие точных количественных данных не позволяло включить миелофиброз в шкалу оценки прогноза. Предложенный нами метод автоматизированной морфометри-ческой оценки миелофиброза позволил выделить точные количественные па-томорфологические критерии прогноза. Таким образом, МФ может быть включен в систему прогноза при ХЛЛ.