Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 15
2 Материал и методы исследования 41
3 Структура рубца на матке пациентов после кесарева сечения 55
4 Особенности гистологического строения рубца миометрия у больных после консервативной миомэктомии 66
5 Структурные изменения матки и регионарных лимфатических узлов после родов с рубцом миометрия в эксперименте 72
6 Гидрометра в эксперименте и сопутствующие изменения регионарных лимфатических узлов 102
7 Морфологические результаты введения аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения 8 рубец матки крыс 135
8 Структурные реакции тканей матки и регионарных лимфатических узлов после применения клеточных технологий на фоне гидрометры в эксперименте 152
Заключение 174
Выводы 185
Практические рекомендации 187
Список использованных источников
- Материал и методы исследования
- Особенности гистологического строения рубца миометрия у больных после консервативной миомэктомии
- Гидрометра в эксперименте и сопутствующие изменения регионарных лимфатических узлов
- Структурные реакции тканей матки и регионарных лимфатических узлов после применения клеточных технологий на фоне гидрометры в эксперименте
Введение к работе
Актуальность проблемы. Преимущества, получаемые при естественных родах после кесарева сечения, значительно превышают риски повторного кесарева сечения (Mo-zurkewich E.L., Hutton E.K., 2000; Bretelle F. et al., 2001; Ben A.N. et al., 2003). Возрастание количества операций кесарева сечения создает новую проблему - ведение беременности и родов у пациенток с рубцом на матке (Ahmed S.M., Daffalla S.E., 2001; Berghahn L. et al., 2001; Ekele B.A. et al., 2001; Fasubaa O.B. et al., 2001; Aboyeji A.P. et al., 2001).
В оценке состоятельности рубцов матки после кесарева сечения немалую роль играет изучение сосудов и нервов этих рубцов (Якутина М.Ф., 1968). Степень васкуляризации, связь рубца с мышечной тканью, отсутствие воспалительных изменений могут служить признаком состоятельности рубца (Kiss D. et al., 1978; Lazarov L., Stratiev S., 1993). Следует отметить, что даже минимальная воспалительная реакция приводит к рассасыванию коллагеновых волокон соединительной ткани и, таким образом, приводит к ослаблению рубца на матке после кесарева сечения (Шехтер А.Б., Милованова З.П., 1975).
Рубец на матке после кесарева сечения больше не является препятствием к вагинальным родам (Stone J.L. et al., 1994; Kaplan B. et al., 1994; Benifla J.L. et al., 1995; Zabransky F., 1995; Phelan J.P. et al., 1998; Vause S., Macintosh M., 1999; Rozenberg P. et al., 1996, 1997, 1999; Appleton B. et al., 2000; Shimonovitz S. et al., 2000; Wasef W.R., 2000; Ben A.N. et al., 2003; Ofir K. et al., 2004; Scioscia M. et al., 2005; Hassan A., 2005), тем более, что материнская и детская смертность при разрыве рубца матки в родах в специализированном учреждении с высококлассной анестезиологической помощью не больше или даже намного меньше, чем при разрыве неоперированной матки (Chen K.C., Hsieh T.T., 1992; Stone J. et al., 1992; Vedat A. et al., 1993; Appleton B. et al., 2000; Yap O.W. et al., 2001).
Степень разработанности темы исследования. Несмотря на большой объем литературных данных, посвященных структуре рубца на матке у женщин или экспериментальных животных, полностью отсутствуют результаты изучения рубцов миометрия после вагинальных родов. Кроме того, нет сведений об изменениях регионарных лимфатических узлов после вагинального родоразрешения в условиях рубца на матке.
Вместе с этим, в доступной литературе содержится множество экспериментальных данных о применении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) для восстановления поврежденных тканей и даже целых органов. Имеется одно сообщение о результатах применения аутологичных гемопоэтических мультипотентных клеток периферической крови для коррекции кожных стрий после беременности (Майбородин И.В. и др., 2010а). Однако, в научных публикациях нет результатов исследований воздействия ММСК на состояние рубцов миометрия, а также лимфатические узлы, находящиеся в регионе применения клеточных технологий.
Цель исследования – изучить особенности патоморфологии рубцов миометрия у женщин после кесарева сечения и миомэктомии, определить критерии их состоятельности, установить возможность использования аутологичных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения для воздействия на репаративные процессы и оценить возможность естественного родоразрешения с рубцом на матке.
Задачи исследования:
-
Методами световой микроскопии исследовать структурную организацию рубцов миометрия, удаленных у женщин при завершении следующей беременности после кесарева сечения и миомэктомии в анамнезе.
-
Оценить возможность самопроизвольных родов в условиях рубца на матке в эксперименте. Изучить изменения микрогемоциркуляции, лимфотока и цитограммы тканевых лейкоцитов различных отделов стенки матки и рубца миометрия, установить основные реакции регионарных (подвздошных) лимфатических узлов после родов с рубцом мио-метрия.
-
Создать экспериментальную модель рубцового сужения полости матки и гидромет-
ры на крысах.
-
Определить структурно-клеточные изменения регионарных лимфатических узлов в различные сроки при нарушении оттока из полости матки.
-
Изучить возможность влияния на состояние рубцов миометрия использованием клеточных технологий в эксперименте. Определить структуры, формирующиеся в рубце из введенных аутологичных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения (АММСККП).
-
Оценить основные изменения регионарных лимфатических узлов после применения АММСККП в регионе лимфосбора.
-
Исследовать возможность самопроизвольных родов у крыс после инъекции АММСККП в рубец миометрия.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение структурной организации рубцов миометрия после кесарева сечения и после миомэктомии. Показано, что морфология рубцов на матке и пограничных с ними зон, образующихся после кесарева сечения или миомэктомии, существенно не различается.
Впервые создана модель поперечного рубца на матке у мелких экспериментальных животных, позволяющая изучать особенности течения беременности и родов, возникновения и развития осложнений в таких условиях.
Впервые в эксперименте продемонстрирована возможность беременности и вагинального родоразрешения в условиях наличия рубца миометрия.
Впервые показано, что через 1,5-2 месяца после родов отсутствуют достоверные изменения гемомикроцикуляции и лимфотока в глубоких слоях эндометрия, миометрии и рубце миометрия у крыс в условиях моделирования рубца миометрия по сравнению с нерожавшими крысами с рубцом на матке.
Впервые установлено, что в клинических условиях и эксперименте ткани на границе рубца и миометрия травмируются при беременности в условиях рубца на матке сильнее, относительно самого рубца, о чем свидетельствует большое число разных по размеру и сроку образования кровоизлияний, явления лимфостаза, высокое количество лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов, макрофагов и эритроцитов на границе рубца и миометрия.
Впервые проведено экспериментальное исследование возможности использования АММСККП для восстановления в рубце миометрия сосудистого русла, поврежденного при моделировании рубцового сужения полости матки. Доказано, что введенные в рубец АММСККП с трансфицированным геном GFP принимают прямое участие в ускоренном формировании сосудов de novo.
Впервые установлено, что после применения АММСККП животные с рубцовым сужением обеих маточных начинают рожать раньше, процент родивших крыс в этой группе был выше, у них было больше как общее количество, так и максимальное число потомства. Материнская смертность в этой группе, наоборот, была меньше.
Впервые получены данные, что применение АММСККП с трансфицированным геном GFP для коррекции сосудистого русла рубцов миометрия не вызывает значительных реакций со стороны регионарных лимфатических узлов. Вместе с этим в лимфоидной паренхиме регионарных лимфатических узлов всех животных появляются макрофаги со светящимися лизосомами в цитоплазме.
Теоретическое и практическое значение работы. Получены новые знания об особенностях структурной перестройки рубцов миометрия в клинических условиях и эксперименте в течение беременности и родов. При установлении показаний и противопоказаний к родам у женщин с рубцом миометрия, независимо от причин его формирования, необходимо исследовать не только собственно рубец, но и пограничную с ним зону, то есть те участки, в которых возможны отрывы гладкомышечных клеток миометрия от плотной волокнистой соединительной ткани рубца.
Установлено, что противопоказанием к повторному естественному родоразрешению
при наличии рубца миометрия могут быть полости с жидкостью, геморрагии и фрагменты шовного материала в рубце матки и пограничной с ним зоны. В связи с тем, что после применения АММСККП на фоне моделирования в эксперименте рубцового сужения полости матки и гидрометры происходит более быстрое восстановление кровотока, целесообразно использование клеточных технологий для ускоренного восстановления структурной целостности матки. Вместе с этим необходимо учитывать возможность активации иммунитета против введенных АММСККП с трансфицированным геном GFP или самого светящегося белка.
Методология и методы исследования. Методология исследования основана на применении принципов и методов морфологического и анализа патологических процессов, использовании теоретических разработок и обобщений о типовых патологических процессах развития и реорганизации рубца. В работе использованы современные методы морфологического анализа и обработки полученных данных. Объект экспериментальных исследований – крысы с искусственно созданным рубцом на матке. Объектом клинической части работы были пациентки с рубцом миометрия после кесарева сечения или миомэктомии. Предмет исследования – морфологические особенности развития и реорганизации соединительнотканноого рубца на месте повреждения тканей матки.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Структурная организация рубцов миометрия, развивающихся после кесарева сечения, и рубцов, формирующихся после консервативной миомэктомии, существенно не различается.
-
Изменения в пограничных с рубцом зонах миометрия более значительны, чем в самом рубце, происходят не расслоение или разрывы рубца, а его отрыв по месту прикрепления к гладкомышечным клеткам.
-
В клинических условиях и эксперименте допустимы естественные роды при наличии рубца матки.
-
После введения в рубец матки АММСККП они формируют кровеносные сосуды за счет дифференцировки в клетки их сосудистых оболочек. Экспрессия гена GFP не только в эндотелии сосудов, но и в их адвентиции, указывает на то, что возможно дифференцирование введенных АММСККП как в эндотелиальном, так и в перицитарном направлениях.
-
После применения АММСККП с трансфицированным геном GFP в лимфоидных узелках регионарных лимфатических узлов появляются многочисленные макрофаги с ли-зосомами, где флуоресцирует фагоцитированный материал.
Степень достоверности результатов диссертации. Все использованные методические (морфологический и морфометрический анализ) приемы и способы статистической обработки соответствуют поставленным цели и задачам и позволяют получить достоверные результаты. Диссертация выполнена на достаточном экспериментальном (266 крыс инбредной линии Wag с искусственно созданным рубцом миометрия) и клиническом (1581 женщина, которой предстояла операция кесарева сечения; с рубцом на матке после кесарева сечения в исходе предыдущей беременности; с рубцом миометрия после миомэк-томии) материале с использованием сертифицированного оборудования. Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.
Апробация материалов диссертации. Основные положения и выводы диссертации доложены на 2 Всероссийской конференции с международным участием «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2000), научно-практической конференции «Актуальные проблемы перинатологии, акушерства и гинекологии», посвященной 70-летию кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2008), Международной гистологической
конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте»
(Тюмень, 2008), XX (XXIV) Всероссийской научной конференции Российского общества
ангиологов и сосудистых хирургов «Диагностика и коррекция нарушений регионарного
кровообращения и микроциркуляции в клинической практике» (Саратов, 2008), Междуна
родной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии»
(Новосибирск, 2008), III и IV Международных молодежных медицинских конгрессах
«Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2009, 2011», 4, 7 и 8 межреги
ональных конференциях, посвященных памяти акад. РАМН проф. Л.В. Полуэктова (Омск,
2010, 2013), ежегодных научных конференциях «Фундаментальные науки – медицине»
(Новосибирск, 2010, 2013), Всероссийской научно-практической конференции «Актуаль
ные проблемы сердечно-сосудистой патологии», посвященной 20-летию Кузбасского кар
диологического центра (Кемерово, 2010), VII международной конференции «Молекуляр
ная медицина и биобезопасность» (Москва, 2010), Всероссийской конференции «Регене
ративная биология и медицина» (Москва, 2011), III Международной Интернет-
конференции «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных»
(Казань, 2012), научно-практической конференции, посвященной 80-летию медицинского
профессионального образования в ХМАО – Югре и 20-летию со дня основания Ханты-
Мансийской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы современной
фундаментальной и клинической медицины» (Ханты-Мансийск, 2014), 7 Санкт-
Петербургском венозном форуме «Актуальные вопросы флебологии» (Санкт-Петербург, 2014), Международном конгрессе «Славянский венозный форум» (Витебск, 2015), 2 Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2015) и на заседании научного персонала лабораторий ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и преподавателей кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России (Новосибирск, 2015).
Публикации. По теме и результатам диссертации опубликована 51 печатная работа, из них 21 – в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, главы с обзором литературы, главы материалов и методов исследования, 6 глав собственных результатов с их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и 13 приложений. Диссертация изложена на 428 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 68 таблицами и 149 многокомпонентными комбинированными рисунками. Список использованных источников включает 718 источников (129 отечественных и 589 иностранных).
Материал и методы исследования
Z.Sestanovic и соавт. (2003) исследовали влияние различной техники ушивания матки (однорядный прерывистый, однорядный непрерывный, двухрядный непрерывный, двухрядный прерывистый) разным шовным материалом (кетгут, дексон и викрил) на процессы заживления матки после нижней поперечной гистеротомии во время кесарева сечения. Из 7830 пациенток после кесарева сечения 1946 пациенток (24,8%) имели повторную беременность, завершившуюся в 1059 случаях (55%) вагинальным родоразрешением и в 887 (45%) – повторным кесаревым сечением. Наилучшие результаты были обнаружены после ушивания матки однорядным прерывистым швом с использованием викрила или дексона. Наихудшие – после применения двухрядного непрерывного или прерывистого кетгутового шва. Подобные клинические результаты были получены и другими исследователями (Cohain J.S., 2004; Стариков Н.В., 2005; Поздняков И.М., 2006).
Однако морфологических критериев преимущества того или иного способа ушивания матки не обнаружено (Кохан И.А., 2002; Стариков Н.В., 2005; Поздняков И.М., 2006).
Для предупреждения разрывов матки при последующих беременностях и родах предлагают во время операции кесарева сечения ушивать орган од 19
норядным швом, при этом рубец получается значительно уже и, следовательно, меньше вероятность ишемии краев раны, присоединения инфекции, образования гематомы и, впоследствии, разрыва по рубцу (Kleissl H.P. et al., 1975; Kiss D. et al., 1978; Tischendorf D., 1987; Lal K., Tsomo P., 1988; Muller R. et al., 1990; Кохан И.А., 2002; Стариков Н.В., 2005; Поздняков И.М., 2006), но есть и прямо противоположные данные о меньшем количестве разрывов матки в родах после ушивания разреза двухрядным швом (Pruett K.M. et al., 1988). Качество шва (continuous, everted; continuous, inverted; interrupted, everted; interrupted, inverted) не влияет на формирование рубца (Dunnihoo D.R. et al., 1989).
Определенное значение для формирования качественного рубца имеет уровень травматизации краев разреза матки - чем меньше повреждение, тем более качественный рубец (Negura-Marderos A. et al., 1977; Negura A. et al., 1988). Рубец на толстом сегменте матки более прочен, чем на тонком, при толщине сшитого сегмента более 4,5 мм разрывы при последующих родах практически не происходят (Rozenberg P. et al., 1996, 1997, 1999; Qureshi B. et al., 1997; Montanari L. et al., 1999; Twickler D.M. et al., 2000).
В экспериментах было обнаружено, что если после кесарева сечения применять гормон роста (рекомбинантный), то рубец получается более толстым (меньше клеточная составляющая и больше коллагена) и значительно увеличивается прочность его к разрыву (Bowers D. et al., 2001).
Если при предыдущей беременности кесарево сечение выполняли с поперечным разрезом матки, то при последующих вагинальных родах вероятность разрыва матки меньше, чем после сечения с продольным разрезом (Neeser E. et al., 1988; Halperin M.E. et al., 1988; Lonky N.M. et al., 1989; Laza-rov L., 1990; Лебедев В.А. и др., 1991; Tucker J.M. et al., 1993; Ranzinger M. et al., 1994), но полностью исключить это осложнение нельзя, необходима постоянная настороженность (Ranzinger M. et al., 1994; Daus K.M., 1995; Стариков Н.В., 2005). R.W. Naef с соавт. (1995) и T.D. Shipp с соавт. (1999) сообщают об одинаковой частоте родовых осложнений после кесарева сечения с вертикальным или поперечным швом матки.
Достаточно много исследователей морфологическими, клиническими и другими методами изучали морфологическими, клиническими и другими методами формирование рубца матки у беременных женщин и экспериментальных животных (кролики) после исполнения кесарева сечения различными методами (Wojdecki J., Grynsztajn A., 1970; Prochorow M., Lazar W., 1971; Waniorek A., 1972а, 1972б; Goranov M., Popovich D., 1978а, 1978б; Vugt van P.J., 1979; Kanadys W., 1979; Макаров И.О. и др., 1989; Лебедев В.А. и др., 1991; Кохан И.А., 2002; Стариков Н.В., 2005; Поздняков И.М., 2006; Мото-рина Ю.П., 2007).
Количество соединительной ткани (фиброзной) в рубце матки обычно достигает 35,7% (Mejia R et al., 1989; Кохан И.А., 2002; Стариков Н.В., 2005; Поздняков И.М., 2006; Моторина Ю.П., 2007). По данным гистероскопии через 1 год после кесарева сечения полное восстановление мышечной ткани наблюдали в 18 случаях (из 32), частичное замещение тканей матки соединительной тканью – у 8 пациентов и полное – у 6 (Мареева Л.С. и др., 1989). О нескольких типах соединительной ткани рубца матки сообщают M. Fukuda с соавт. (1992).
В срок от 2 до 15 лет после кесарева сечения в рубце матки были обнаружены различные патологические изменения, включающие деформацию и расширение нижнего маточного сегмента (75%), нависание гиперплазиро-ванного эндометрия над поверхностью рубца, где эндометрия нет (61%), формирование полипа по контурам границ рубца (16%), умеренная лимфоци-тарная инфильтрация (65%), остаточные фрагменты шовного материала с образованием гигантских клеток инородных тел (92%), расширение капилляров (65%), свободные эритроциты в эндометриальной строме рубца, предваряющие кровоизлияния (37%), ятрогенный аденомиоз границ рубца (28%) (Ka-zakov B.J. et al., 1994; Morris H., 1995; Кохан И.А., 2002; Стариков Н.В., 2005; Поздняков И.М., 2006; Майбородин И.В. и др., 2008). Довольно часто сообщают о некрозах части шва после кесарева сечения и/или кровотечениях из него, как позднем осложнении операции, даже при отсутствии беременности (Stewart K.S., Evans T.W., 1975; Rooyen van A.J. et al., 1977; Madsen P., Olsen C.E., 1977; Paraskevaides E. et al., 1993).
В оценке состоятельности рубцов матки после кесарева сечения немалую роль играет изучение сосудов и нервов этих рубцов (Якутина М.Ф., 1968). Степень васкуляризации, связь рубца с мышечной тканью, отсутствие воспалительных изменений могут служить признаком состоятельности рубца (Kiss D. et al., 1978; Lazarov L., Stratiev S., 1993). Следует отметить, что даже минимальная воспалительная реакция приводит к рассасыванию коллагено 21 вых волокон соединительной ткани и, таким образом, приводит к ослаблению рубца на матке после кесарева сечения (Шехтер А.Б., Милованова З.П., 1975).
В эксперименте было показано, что женские половые гормоны (уровень в плазме крови, соответствующий последнему триместру беременности) уменьшают общий синтез белка в грануляционной ткани, особенно синтез различных типов коллагена. Также при этом снижается разрушение коллагена, растворимость его не меняется. Возможно, что активный синтез коллагена и других протеинов в тканях матки и плода сопровождается уменьшением синтетических процессов в других тканях. Таким образом, возможна гормональная терапия интенсивного образования рубцов (Hagberg L. et al., 1980).
В случае несостоятельности рубца на матке при последующей беременности после кесарева сечения в оперированной области нижнего сегмента было найдено высокое содержание коллагена и уменьшение экспрессии всех изоформ трансформирующего ростового фактора-бета, снижении ростового фактора соединительной ткани при увеличении ростового фактора фиб-робластов и незначительном повышении уровня экспрессии ростового фактора сосудистого эндотелия, опосредованного тромбоцитами ростового фактора и фактора некроза опухолей-альфа (Pollio F. et al., 2006).
Преимущества, получаемые при естественных родах после кесарева сечения значительно превышают риски повторного кесарева сечения (Phelan J.P. et al., 1987; Nielsen T.F. et al., 1989; Berger D. et al., 1991; Mozurkewich E.L., Hutton E.K., 2000; Bretelle F. et al., 2001; Ben A.N. et al., 2003; Стариков Н.В., 2005; Поздняков И.М., 2006). Риск разрыва матки с рубцом после кесарева сечения при вагинальном родоразрешении должен соответствовать риску повторной операции кесарева сечения (Rachagan S.P. et al., 1991; Mo-zurkewich E.L., Hutton E.K., 2000).
Особенности гистологического строения рубца миометрия у больных после консервативной миомэктомии
Попытка применения клеточных технологий для коррекции рубца миометрия была предпринята в соответствии с данными литературы о возможности влияния на рубцовую ткань, и даже ее обратного развития в результате применения ММСК.
H. Kamihata и соавт. (2001) показали, что интенсивный неоваскулогенез после имплантации костномозговых клеток в область инфаркта миокарда обусловлен не только непосредственным участием АМСККП, но и значительной экспрессией этими клетками таких факторов ангиогенеза как фактор роста эндотелия сосудов, ангиопоэтин и другие.
Имеются данные о результатах применения аутологичных гемопоэти-ческих мультипотентных клеток периферической крови для коррекции кожных стрий после беременности: после использования клеточных технологий во всех наблюдениях в соединительной ткани на месте дермы происходит увеличение числа сосудов за счет процессов неоангиогенеза, уменьшение степени лейкоцитарной инфильтрации, утончение и упорядочивание расположения коллагеновых и эластиновых волокон (Майбородин И.В. и др., 2010а).
Было проведено 2 независимых эксперимента с интервалом между ними, примерно, в 3 года. Все крысы для исследования результатов применение клеточных технологий в условиях рубцового сужения полости матки получены из вивария Института цитологии и генетики СО РАН, который соответствует категории SPF, работу с животными осуществляли в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. В качестве модели были использованы самки крыс линии Wag массой 180 – 200 г возрастом 6 мес. В асептических условиях моделировали гидрометру, как описано выше.
Выделение аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения.
Использование ММСК, выделенных у одних особей крыс, для введения другим особям основано на результатах многочисленных литературных сообщений, что недифференцированные ММС не экспрессируют поверхностные маркеры иммуногенности, не вызывают иммунного ответа даже после аллогенной и ксеногенной трансплантации, также ингибируется пролиферация аллогенных Т-клеток, подавляются воспалительные и имунные процессы (Patel S.A. et al., 2008; Iyer S.S., Rojas M., 2008; Meng E. et al., 2008; Caplan A.I., 2009; Poncelet A.J. et al., 2009; Undale A.H. et al., 2009; Niemeyer P. et al., 2010а, 2010б; Yamaza T. et al., 2010; Charbord P., 2010). Эмбриональные ММСК также не обладают иммуногенными свойствами и проявляют иммуно-супрессивный эффект (Heng B.C. et al., 2005а, 2005б; Poncelet A.J. et al., 2009).
АММСККП выделены посредством вымывания костного мозга из эпифизов бедренных костей, взятых под эфирным наркозом у самцов крыс ин-бредной линии Wag (Майбородин И.В. и др., 2010б, 2010в, 2011а, 2012б; Maiborodin I. et al., 2011). Полученная суспензия клеток была помещена в пластиковые флаконы («Nunk», Дания), через 48 ч после эксплантации костного мозга неприкрепившиеся клетки удаляли. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде -МЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37С в СО2-инкубаторе с 5% СО2 в условиях насыщенной влажности. Смену среды производили каждые три дня. При субкультивировании монослойную культуру рассеивали в плотности 1000 – 5000 клеток/см2 (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), использовали стандартные растворы Версена и трипсина. Методами световой и флуоресцентной микроскопии и цитологическими методами окрашивания было доказано, что культивируемые клетки костного мозга крысы: - являются CD90+, CD105+, CD34-, CD45- (Jones E.A. et al., 2002; Zhou D.H. et al., 2003; Tuli R. et al., 2003; Mayer H., 2004; Mansilla E. et al., 2006; Chamberlain G. et al., 2007; Lee S.Y. et al., 2007; Martins A.A. et al., 2009; Coipeau P. et al., 2009; Berner A. et al., 2010). - in vitro прикрепляются к поверхности пластика культивирования, - имеют фибробластоподобную морфологию, которую сохраняли все время культивирования, - поддерживаются в культуре в течение нескольких пересевов, - формируют колонии фибробластоподобных клеток при посеве в низкой плотности, - в присутствии линейно-специфичных факторов дифференцируются в клетки костной ткани. Для исследования использовали клетки 2 - 3 пассажей.
Однако физические, морфологические и фенотипические признаки не являются окончательными специфическими критериями, которые могут быть использованы для точной идентификации АММСККП. Способность АММСККП к индуцированной дифференцировке in vitro в клетки костной, жировой и хрящевой тканей является единственным критическим требованием для определения предполагаемых популяций стволовых клеток.
Индукция остеогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток in vitro: АММСККП имеют различную морфологию, что зависит, в первую очередь, от способов их получения и культивирования. Поэтому перед применением необходимо проведение теста на возможность диффе-ренцировки в заданном направлении (Tallheden T. et al., 2003).
Поскольку АММСККП свойственна дифференцировка в клетки костной ткани и условия ее проведения наиболее воспроизводимы, этот вид дифференцирования обычно используют для характеристики культур стволовых клеток in vitro и он является типичным заданным по умолчанию путем развития для большинства АММСККП в культуре. Для индукции остеогенной дифференцировки использованы 0,1 M дезоксиметазон, 50 M аскорбиновую кислоту и 10 mM -глицерофосфат («Sigma», США), вызывающие остеогенную дифференцировку (Bischoff D.S. et al., 2008; Liu J. et al., 2009а, 2009б; Park K.H. et al., 2009а, 2009б; Reichert J.C. et al., 2009; Hamidouche Z. et al., 2009, 2010; Shi X. et al., 2010; Wang Y. et al., 2010; Korecki C.L. et al., 2010; Hu J. et al., 2010).
Остеогенную дифференцировку определяли по 2 маркерам: по активности щелочной фосфатазы и минерализации межклеточного матрикса ионами кальция. Цитохимическое выявление щелочной фосфатазы проведено с использованием Нитротетразолиевого синего в присутствии субстрата щелочной фосфатазы 5-бромо-4-хлоро-3-индолила. Накопление кальция в межклеточном матриксе регистрировали по окрашиванию Ализарином красным.
Трансфекция АММСККП геном GFP. АММСККП 2 пассажа, полученные от крысы указанной линии, трансфицировали ДНК плазмиды pЕGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., USA), содержащей ген зеленого флуоресцентного белка GFP под контролем промотора цитомегаловируса и ген устойчивости к неомицину под контролем промотора вируса SV40, необходимого для последующей селекции с использованием дженетицина G418 (pEGFP-N1; Clontech Laboratories Inc., USA). Трансфекцию проводили в присутствии реагента для трансфекции TurboFect (Fermentas life sciences, Inc, Canada) согласно рекомендациям производителя, применяли протокол для трансфекции сус-пезионных клеток. Трансфекцию проводили, используя 1х106 клеток в 1 мл суспензии, 4 мкг ДНК плазмиды и 10 мкл реагента для трансфекции (TurboFect).
Через 4 ч после трансфекции клетки разводили нетрансфицированными клетками в соотношении 1:2,5. Смесь готова к введению. Оставшиеся после трансплантации клетки поддерживали в культуре в течение 10 дней для оценки эффективности трансфекции и стабильности экспрессии введенного гена.
Экспрессию введенного гена GFP АММСККП крысы оценивали визуально под флуоресцентным микроскопом, непосредственно просматривая культуру или используя камеру Горяева для подсчета трансфицированных клеток через 48 ч после трансфекции. Эффективность трансфекции оценивали как процент светящихся клеток относительно всех клеток в камере Горяева. Трансфицированные клетки в разбавленной культуре составляли около 3%. Как и в большинстве случаев при использовании технологии, основанной на введении плазмидной ДНК, наблюдали только временную экспрессию введенного гена зеленого флуоресцентного белка в АММСККП крысы. Культивирование клеток, трансфицированных плазмидой pЕGFP-N1, без селекции (не использовали дженетицин (G418, Sigma, USA)) показало снижение количества клеток, синтезирующих зеленый флуоресцентный белок, вследствие их вытеснения нетрансфицированными клетками. Тем не менее спустя 1 нед в культуре трансфицированных клеток 1 пассажа, высеянных из плотности 5000 клеток на 1 см2 наблюдали клетки, синтезирующие зеленый флуоресцентный белок.
Применение аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костномозгового происхождения. 1 эксперимент, 2009 г. 100 мкл смеси (1х106 клеток в 1 мл суспензии) при релапаротомии и после удаления нелизированных остатков шовного материала (игла 0,4х12 мм) вводили в область сформированного рубца через 2 мес после перевязки маточного рога справа самкам крыс. Левый рог матки выступал в качестве контроля. Кроме того, как контроль, были использованы интактные животные.
Гидрометра в эксперименте и сопутствующие изменения регионарных лимфатических узлов
Усиленная антигенная стимуляция при беременности (Clark D.A., McDermott M.R., 1978; Clarke A.G., 1979; Chambers S.P., Clarke A.G., 1979; Kamel S., Wood G.W., 1990; Johansson M. et al., 2004) приводит к запуску процесса формирования вырабатывающих антитела плазматических клеток, это подтверждается расширением мякотных тяжей (описано выше и также совпадает с результатами других исследователей (Бородин Ю.И. и др., 1986; Георгиева Р., Ковачев К., 1986; Sulila P. et al., 1988; Sulila P., Mattsson R., 1990; Dresser D.W., 1991; Bernadotte F., Mattsson R., 1992; Bischof R.J. et al., 1996; Hegde U.C., Nainan R., 1998)), где расположена основная масса зрелых и незрелых плазмоцитов.
Дифференцировавшиеся и продолжающие созревать клетки плазмоци-тарного ряда (иммуно- и плазмобласты, незрелые и зрелые плазмоциты) (Бородин Ю.И., Григорьев В.Н., 1986) оказываются в паракортикальной зоне, где участвуют в формировании иммунного ответа со стороны Т-клеток, макрофагов и пр. Появление клеток плазмоцитарного ряда в паракортикальной зоне лимфатических узлов, регионарных к матке, наблюдали и другие исследователи:
Ю.И.Бородин и соавт. (1986) отмечают, что начиная с 17-х суток беременности крыс, в паракортикальной зоне узлов появляются плазмобласты, плазмоциты, клетки Мотта, моноциты и макрофаги. Одновременно в В-зонах и мозговых синусах увеличивается число бластов, плазмоцитов, моноцитов, макрофагов и делящихся клеток, сокращается процент ретикулярных клеток.
K. Sasaki и T. Ito (1980) обнаружили, что на 10 – 15-й дни беременности мышей группы плазмоцитов присутствуют в паракортикальной зоне брыжеечных лимфатических узлов, численность этих клеток быстро возвращается к исходной после родов.
У группы животных рожавших с рубцом на матке антигенная стимуляция при беременности (возможно, что последствия этой стимуляции уже исчезли) суммируется с антигенной стимуляцией из поврежденных тканей в месте прикрепления миометрия к рубцовой ткани в стенке матки. В данном случае образование и поступление в лимфатический узел антигенных веществ возможно как в результате прямого повреждения пограничных тканей (разрывы), так и в результате метаболических и гипоксических повреждений клеток (нарушения микроциркуляции, кровоизлияния и лимфостаз). В результате этого суммирования антигенного воздействия на лимфатический узел, которое продолжается достаточно длительное время и после физиологического завершения беременности, наиболее вероятно, и возросло число плазмоцитов в группе животных после родов с рубцом на матке.
Относительная численность макрофагов у интактных крыс была меньше в 2,1 раза, на 90% и 2,2 раза, соответственно, чем у рожавших ложноопе-рированных, нерожавших с рубцом на матке и рожавших с рубцом. Численная плотность этих клеток в группе интактных животных также была меньше в 2,1 раза, на 89% и в 2,3 раза, также соответственно, относительно рожавших ложнооперированных крыс, нерожавших с рубцом на матке и с рубцом на матке после родов (Приложение Ж, табл. 45) (Приложение З, рис. 37, 39-41).
Возрастание численности макрофагов во всех опытных группах животных, по сравнению с интактными, скорее всего, связано с проведением лапа-ротомии (наличие увеличенного числа данных клеток у нерожавших животных с рубцом на матке). После операции в лимфатические узлы поступает большое количество тканевого и клеточного детрита (повреждение в месте хирургического разреза, наложение швов и т.д.).
Этот детрит при попадании в узлы сначала проходит по сети промежуточных синусов, расположенных, в том числе, и в паракортикальной зоне, где частично поглощается макрофагами. В данном случае увеличение числа макрофагов в паренхиме паракортекса, возможно, вызвано присутствием ан-тиген-содержащего детрита в промежуточных синусах. Отсутствие параллельного возрастания количества моноцитов и нейтрофилов, по-видимому, свидетельствует как об отдаленности проведенного хирургического вмешательства по времени, так и о том, что операция была проведена с хорошим соблюдением правил асептики и антисептики.
Далее детрит поступает в синусную систему мозгового вещества, где продолжает подвергаться обработке антителами, макрофагами и другими фагоцитами. Если объем детрита достаточно велик, часть его может пройти через регионарные лимфатические узлы и подвергнуться деградации в вышележащих узлах.
Конечно, возможно, что возрастание численности макрофагов связано и с депрессией Т-клеточного иммунитета. Не исключено, что некоторые клетки этой зоны (лимфоциты) погибли, подвергшись воздействию супрессирующих цитокинов. Однако это явление должно было бы сопровождаться увеличением численности деструктивных форм клеток в паракортикальной зоне в течение беременности, чего не было ни в наших исследованиях, ни отмечено в литературных данных.
Цитоархитектоника лимфоидных фолликулов без герминативных центров. В лимфоидных фолликулах без центров размножения можно отметить, что процент макрофагов у интактных крыс был меньше в 2 раза, на 95,1 и 79,5%, соответственно, чем у рожавших ложнооперированных, нерожавших с рубцом на матке и рожавших с рубцом. Численная плотность этих клеток в группе интактных животных также была меньше в 2,1 раза, на 84,5% и 90,1%, и также соответственно, относительно рожавших ложнооперирован-ных крыс, нерожавших с рубцом на матке и с рубцом на матке после родов (Приложение Ж, табл. 46).
Возрастание количества макрофагов у всех групп опытных животных, скорее всего, как и в паракортексе, связано с поступлением тканевого детрита после хирургической операции.
Увеличение численности макрофагов может быть связано и с антигенной стимуляцией. При быстром делении и дифференцировке клеток В-линии возрастает число клеточных элементов с различными дефектами, в том числе и генетическими. Эти клетки с различными дефектами подвергаются разрушению и фагоцитозу макрофагами. Однако эти процессы, как и в паракор-тексе, должны сопровождаться увеличением численности клеток с деструктивными изменениями, чего также нами не было обнаружено.
Цитоархитектоника мантийной зоны лимфоидных фолликулов с герминативными центрами. В мантийной зоне лимфоидных узелков с центрами размножения во всех группах опытных животных было увеличено число иммуно- и плазмобластов. Относительное количество таких клеток у интактных крыс было меньше на 90%, в 2 раза и на 99,5% соответственно, чем у рожавших ложнооперированных, нерожавших с рубцом на матке и после родов с рубцом. Численность бластов на единицу площади среза мантийной зоны в группе интактных крыс было меньше в 2 раза, на 97,3% и в 2,1 раза, также соответственно, и также относительно ложнооперированных животных, нерожавших с рубцом на матке и после родов с рубцом (Приложение Ж, табл. 47).
Структурные реакции тканей матки и регионарных лимфатических узлов после применения клеточных технологий на фоне гидрометры в эксперименте
В месте перевязки маточных рогов при моделировании гидрометры с последующим введением АММСККП развивается воспалительная реакция, характеризующаяся поступлением в регионарные лимфатические узлы, в данном случае – подвздошные, большого объема клеточного и тканевого детрита (Жданов Д.А., 1952; Foldi M., 1969; Ottaviani G., 1970; Casley-Smith J.R., 1973; Панченков Р.Т. и др., 1986; Бородин Ю.И., 1989; Буянов В.М., Алексеев А.А., 1990; Бородин Ю.И. и др., 1995 – 1997), который поглощается макрофагами этих органов.
Несомненно, что вместе с этим детритом в лимфатические узлы поступает и часть введенных АММСККП, тем более, что не все они жизнеспособны. В узлах макрофаги поглощают антигенный материал и, не исключено, попавшие туда АММСККП и их фрагменты. Следует отметить, что эксперименты проведены на линейных инбредных крысах, но, по-видимому, взятые у одной особи АМСККП все-таки в какой-то мере являются чужеродными для других животных, может быть даже не за счет генетических отличий (чужеродный трансфицированный ген GFP и, соответственно, синтезируемый им протеин), а, например, биохимических или метаболических.
Макрофаги фагоцитируют вместе с детритом и попавшие в лимфатические узлы АММСККП вместе со светящимся белком GFP. В таких случаях лизосомы макрофагов, в которых находится флуоресцентный белок, могут светиться в ультрафиолетовом отраженном свете так же, как и сами АММСККП с трансфицированным геном GFP. Следует еще раз отметить наличие в литературе данных о флуоресценции макрофагов за счет фагоцитированного материала (Plowman P.N., Flemans R.J., 1980; Wang N.K. et al., 2009; Luhmann U.F. et al., 2009; Mitchell A.J. et al., 2010; Iida T., 2011; Lei L. et al., 2012; Potter K.A. et al., 2012). Также не исключено и встраивание ДНК белка GFP в геном макрофагов и наработка этого белка, но такая возможность кажется маловероятной. То, что макрофаги с поглощенным клеточным светящимся детритом сконцентрированы в герминативных центрах лимфатических узлов, можно объяснить с 2-х позиций:
Во-первых, в герминативных центрах идут размножение, активация и дифференцировка клеток В-линии, которые в дальнейшем будут синтезировать антитела против определенных антигенов. Для запуска и успешного осуществления этого процесса необходимо присутствие макрофагов с данным антигеном. В самих центрах размножения имеется множество макрофагов, которые могут поглощать антигены из окружающих тканей и, по-видимому, лимфы, проходящей по промежуточным синусам.
Во-вторых, макрофаги могут фагоцитировать светящиеся клетки или вышедший из них при разрушении белок GFP из лимфы и или мигрировать в фолликулы для активации и запуска процесса пролиферации и дифференци-ровки В-лимфоцитов или передавать антигены другим макрофагам, находящимся уже непосредственно в лимфоидных узелках. Не исключена возможность фагоцитирования АММСККП и их детрита в месте рубцового сужения рога матки, миграции макрофагов с антигеном в лимфатические узлы вместе с током лимфы и уже в этих органах миграции или передачи антигенов фагоцитам центров размножения.
В литературе описана возможность фагоцитоза макрофагами чужеродных веществ, оказавшихся в тканях при разрушении других макрофагов, поглотивших их ранее (Гаврилин В.Н., Шкурупий В.А., 1995; Гаврилин В.Н., 1997). Возможен и экзоцитоз лизосомальных ферментов одними фагоцитами (Курбангалеев С.М. и др., 1977; Курбангалеев С.М., 1985; Kanzler M.H., 1986; Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990; Fredriksson M.I. et al., 2003) и поглощение этих ферментов вместе с детритом другими макрофагами.
Таким образом, не исключено создание иммунной защиты против вве 173 денных АММСККП с трансфицированным геном GFP или самого светящегося белка. Возможно, что после повторного введения клеток с трансфицированным геном GFP такие клеточные элементы будут очень быстро уничтожаться системой иммунитета и из них не будет формироваться никаких структур.
Крупные светящиеся клетки присутствовали в лимфатических узлах и спустя 3 нед после применения АММСККП, хотя интенсивность флуоресценции значительно снизилась. По-прежнему в таких клетках светилась не вся цитоплазма, а множество различных по размерам гранул. По-видимому, сразу после введения АММСККП часть этих клеток и их детрит попадает в регионарные лимфатические узлы, где фагоцитируются макрофагами и обеспечивают их свечение.
До 2 нед происходит формирование сосудов из АММСККП, а далее их созревание в области атрофии и сужения маточного рога. В течение этого же периода светящиеся клетки в сосудистых оболочках постепенно замещаются собственными клетками организма-донора. Разрушенные структуры со светящимися клетками (построенные из введенных АММСККП с трнсфициро-ванным геном GFP), также попадают в лимфатические узлы и поглощаются макрофагами.
Постепенно инъецированные АММСККП замещаются собственными клетками и структурами. В месте лигирования маточных рогов по-прежнему идет воспалительный процесс. Также по-прежнему в лимфатические узлы поступает клеточный детрит. Но ввиду того, что структур, построенных из введенных АММСККП, становится все меньше, в лимфатических узлах сокращается содержание светящихся гранул в макрофагах и интенсивность свечения.
На основании изучения лимфатических узлов, регионарных к месту инъекции АММСККП, становятся возможными ответы на вопросы: Куда исчезает детрит от введенных нежизнеспособных клеток, и куда поступают фрагменты структур (в данном случае сосудов), построенных с участием АММСККП по мере вытеснения их собственными клетками?
Детрит из введенных АММСККП и образованный при замещении этих клеток в различных структурах собственными клетками организма-донора, наиболее вероятно, оказывается в регионарных лимфатических узлах, куда поступает с током лимфы. Далее в этих органах остатки АММСККП фагоци 174 тируются макрофагами, которые концентрируются в лимфоидных узелках. Флуоресцирующий белок GFP обеспечивает яркое свечение таких макрофагов в течение времени, большего, чем люминесценция структур, сформированных из АММСККП в тканях.
Следует отметить возможность фагоцитоза детрита из АММСККП макрофагами непосредственно в месте инъекции и миграции этих фагоцитов в лимфатические узлы. В результате этого светящийся белок GFP все равно оказывается в макрофагах, расположенных в лимфоидных фолликулах.
Применение АММСККП с трансфицированным геном GFP на фоне нарушения оттока из полости матки не вызывает статистически значимых изменений в состоянии регионарных лимфатических узлов. Однако, в лим-фоидных узелках регионарных лимфатических узлов появляются многочисленные крупные макрофаги с множеством овальных светящихся включений в цитоплазме. Численность таких макрофагов нарастает в течение 2 недель после операции, а далее очень медленно начинает уменьшаться. По-видимому, введенные таким способом АММСККП частично поглощаются макрофагами. В том и другом случае эти макрофаги оказываются в центрах размножения лимфоидных фолликулов лимфатических узлов, где, в связи с этим, не исключена инициация иммунитета против ДНК и белка GFP.