Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Перспективы применения полигидроксиалканоатов в регенеративной медицине 12
1.2 Применение мезенхимальных стволовых клеток для регенерации костно-суставного аппарата 20
2 Материал и методы исследования 36
2.1 Группы животных и сроки забора материала 36
2.2 Подготовка полимера на основе полигидроксиалканоата 37
2.3 Выделение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток 38
2.4 Моделирование повреждения кости нижней челюсти и различные способы влияния на репаративный процесс 42
2.5 Объект исследования, подготовка материала к изучению, морфологические и лучевые методы исследования, морфометрия и статистическая обработка полученных данных 43
3 Регенерация дефекта кости нижней челюсти после применения полигидроксиалканоата с адсорбированными стромальными клетками 46
3.1 Участок повреждения кости нижней челюсти в условиях естественной регенерации 46
3.2 Участок повреждения кости нижней челюсти после имплантации полигидроксиалканоата 47
3.3 Участок повреждения кости нижней челюсти после применения полигидроксиалканоата с адсорбированными стромальными клетками 49
3.4 Радиовизиографическое исследование репаративных процессов в
участке повреждения кости нижней челюсти 53
4 Состояние субмандибулярных лимфатических узлов после имплантации в дефект кости нижней челюсти полигидроксиалканоата с адсорбированными стромальными клетками 55
4.1 Результаты применения стромальных клеток с геном GFP: данные люминисцентной микроскопии 55
4.2 Изменения центров размножения лимфоидных фолликулов 58
5 Обсуждение полученных результатов 72
Выводы 91
Практические рекомендации 93
Список использованных источников
- Применение мезенхимальных стволовых клеток для регенерации костно-суставного аппарата
- Выделение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток
- Участок повреждения кости нижней челюсти после имплантации полигидроксиалканоата
- Изменения центров размножения лимфоидных фолликулов
Применение мезенхимальных стволовых клеток для регенерации костно-суставного аппарата
При обзоре литературы виден резко возросший интерес в ПГА, а как следствие - появление новых научных публикация в таких странах как Китай, Южная Корея, Япония, Индия, Бразилия, а теперь и в России. Это говорит об интересе к данному полимеру и, возможно, об его высокой перспективности. В 2005 г. группой ученых Сибирского федерального университета г. Красноярска, было разработано и запущено производство первых в России биосовместимых и полностью резорбируемых полимеров различной структуры. Были разработаны из ПГА шовные нити, трубчатые эндопротезы и мембраны, которые были допущены к клиническим испытаниям.
Накоплена экспериментальная база, которая демонстрирует богатые свойство ПГА: биодеградация, термопластичность, биосовместимость (Brandl H. et al, 1990; Dawes E.A., 1990; Amass W. et al., 1998). Такое свойство, как термопластичность, дает возможность из полимеров в виде порошков, растворов и сплавов производить пленки, полые конструкции и нити (Волова Т.Г. и др., 2006а, 2006б), а так же подвергать изделия стерилизации общепринятыми мерами, без изменения их свойств: потери прочности, ухудшения адгезивных свойств и появления токсического эффекта (Шишацкая Е.И., 2007; Siew E.L. et al., 2009).
ПГА являются экологически чистыми материалами, то есть они полностью биодеградируемые в природной среде (в морской воде, почве, в средах компостирования и переработки отходов) до конечных нетоксичных продуктов (CO2 и H2O) (Баранцева Г.А. и др., 2002), причем динамику биодеградации можно прогнозировать и регулировать (Баранцева Г.А. и др., 2002; Войнова О.Н. и др., 2009). Это способно решить многие экологические проблемы, связанные с утилизацией упаковочной продукции и медицинских материалов. Потенциально сферы применения ПГА безгранично широки и могут включать медицину, фармакологию, пищевую и косметическую промышленность, сельское и коммунальное хозяйство (Brandl H. et al., 1990; Dawes E.A., 1990; Amass W. et al., 1998; Nobes G.A.R. et al., 1998; Wu Q. et al., 2009).
ПГА не свойственна гидролитическая деградация в водной среде, в связи с чем происходит медленная кинетическая биорезорбция, а во время их деструкции не происходит изменения активной реакции среды (Amass W. et al., 1998), поэтому возможно использование ПГА в качестве носителя-подложки для функционирующих клеток (Шишацкая Е.И., 2007). ПГА могут быть использованы в качестве матриксов для депонирования, доставки и долговременного контролируемого высвобождения препаратов (лекарств, пестицидов) (Шишацкая Е.И. и др., 2008б; Войнова О.Н. и др., 2009; Лившиц В.А. и др., 2009), в частности, рубомицина (Волова Т.Г. и др., 2005).
Е.И. Шишацкая и соавт. (2002) проводили испытания ПГА в различных фазовых состояниях (растворы, эмульсии, порошки), получали и изучали структуру и свойства дву- и трехмерных матриксов в виде гибких прозрачных пленок, мембран, ультратонких волокон, микрочастиц, губок, объемных плотных и пористых конструкций (стекло и полиэстеры – чистый контроль). Была подтверждена пригодность ПГА-матриксов для культивирования клеток in vitro. Производилась оценка биосовместимости и цитотоксичности ПГА матриксов на клетках разного происхождения – мезенхимальные ( клетки эндотелия и фибробласты), энтодермального ( гепатоциты), на первичной культуре остеобластов, полученных из костного мозга. Клетки прижизненно окрашенные трепановым синим подвергались микроскопии, определялся синтез белка и ДНК культивированных клеток, тест клеточной и лекарственной цитотоксичности ММТ (основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки).
Клетки в контрольной группе, выращенные на стекле и полистироле, в своей морфологии не отличались от клеток выращенных в прямом контакте с поверхностью матрикса ПГА. Было установлено, что при прямом контакте с матриксом ПГА не происходило ингибирование синтеза ДНК и пролиферативной активности. Было установлено отсутствие цитотоксичности матрикса из ПГА, отмечена его повышенная биосовместимость по отношению к тканям и клеткам (Шишацкая Е.И. и др., 2002). In vitro продемонстрирован остеогенный потенциал ПГА-конструкций (Шишацкая Е.И. и др., 2008в). Резюмируя научные статьи можно сказать, что не была выявлена разница между действием полигидроксибутирата и сополимерных образцов полигидроксибутират/полигидроксивалериат. Y. Deng с соавт. (2002) продемонстрировали на примере культивации хондроцитов, что смесь полигидпрксибутират-Со гидроксигексаноат/полигидроксибутират, лучше всего подходит для выращивания клеток, чем в контроле с чистым полигидроксибутиратом.
K. Zhao с соавт. (2003) показали отличную биосовместимость смеси полигидпрксибутират-Со-гидроксигексаноат/полигидроксибутират в сравнении с чистым полигидроксибутират-Со-гидроксигексаноатом.
Уже появились статьи, в которых указывается, что ПГА способствуют образованию и дифференциации столовых клеток, например, в нейроны в случае повреждения ЦНС (Xu X.Y. et al., 2010), и что ПГА усиливает образование фибробластов в исследованиях в in vitro (Dong Y. et al., 2010). У пленок, произведенных из разных видов ПГА, отмечаются различные поверхностные свойства, что ведет к различной клеточной адгезии клеток к таким поверхностям.
Напрашивается вывод о том, что биоматериалы для тканевой инженерии индивидуальны для определенных типов клеток. Как вариант, поли-3 17 гидроксибутират удобен для выращивания обкладочных нейроэпителиальных (обонятельных) клеток, а поли-3-гидроксибутирата-Co-3-гидроксивалериат – для МСК (Ahmed T. et al., 2010).
Биодреградация полимера определялась во время острых и хронических экспериментов на лабораторных животных, выявлено, что это зависит от химической структуры полимера, от места введения и формы каркаса матрикса. Биодеградация происходит медленным клеточным и гуморальным путем, начинаясь с поверхности изделия, точечные дефекты не образуются и снижения прочности не определяется. Во время биодеградации ПГА присутствовали макрофаги и гигантские клетки инородных тел с повышенной активностью кислой фосфатазы, похожей на активность фермента в сыворотке крови животных. Больше всего микрочастицы полимера биодеградируют в печени и селезенке.
С момента изготовления ПГА можно использовать до года, в течение этого времени они не вызывают никаких негативных реакций в окружающих тканях и не мешают репарации ( in vivo), по этому их можно применять к качестве нитей эндопротезов и остеоимплантатов. Отмечено что деградация полимера начинается во время длительных экспериментов от 12 недель (Шишацкая Е.И. и др., 2008а, 2009). Выраженные направленные остеопластические свойства имплантатов из полигидроксибутирата были установление в экспериментах по изучению репаративного остеогенеза (Шишацкая Е.И. и др., 2008в).
Выделение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток
В Сибирском федеральном университете (г. Красноярск) была разработана технология получения ПГА, сконструировано и запущено в 2005 году первое отечественное опытное производство биосовместимых и полностью рассасываемых в биологических средах полимеров различной структуры и экспериментальных изделий биомедицинского назначения. Разработанные из ПГА шовные нити, трубчатые эндопротезы и мембраны допущены к клиническим испытаниям (Шишацкая Е.И. и др., 2002, 2008а, 2008б, 2008в; Войнов Н.А., Волова Т.Г., 2004; Волова Т.Г.и др., 2005, 2006а, 2006б, 2009, 2010; Volova T.G. et al., 2007; Шишацкая Е.И., 2007; Бояндин А.Н. и др., 2008; Войнова О.Н. и др., 2009; Яковлев А.В. и др., 2010).
В литературе имеются свидетельства о лизисе ПГА и активном формировании костной ткани на месте его внедрения в участки повреждения различных костей. В экспериментах по изучению репаративного остеогенеза было показано, что имплантаты из некоторых ПГА, в частности полигидроксибутират обладают выраженными направленными остеопластическими свойствами (Шишацкая Е.И. и др., 2008в). Наиболее подходящим для медицинских целей из всех ПГА считается полигидроксибутират, так как наиболее полно отвечает требованиям, предъявляемым к материалам биомедицинского назначения (Ребров А.В. и др., 2002; Дубинский В.А. и др., 2004; Boskhomdzhiev A.P. et al., 2010), который был получен ещ в 1926 году, но только в последнее десятилетие научный интерес к нему и вообще полимерам этого класса особенно усилился. Есть данные о том, что полигидроксибутират обладает наибольшими тромборезистентными и биосовместимыми характеристиками среди изученных ПГА. Хорошая биосовместимость полигидроксибутирата обусловлена в первую очередь тем, что он в виде олигомеров (до 150 остатков 3-гидроксимасляной кислоты) присутствует в крови и тканях млекопитающих (Reusch R.N. et al., 2003).
Биодеградируемый ПГА (сополимер из 85% полигидроксибутирата и 15% гидроксивалериата) в виде матриксов холодного прессования (авторское название) диаметром и высотой 2 мм был предоставлен для исследования Институтом биофизики СО РАН (г. Красноярск). Стерилизацию ПГА проводили автоклавированием вместе с хирургическим инструментарием.
АМСККП выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей, взятых под эфирным наркозом у самцов крыс инбредной линии Wag (Майбородин И.В. и др., 2010б, 2010в, 2011в; Maiborodin I. et al, 2011; Ковынцев А.Н., 2011). Полученную суспензию клеток помещали в пластиковые флаконы («Nunk», Дания), через 48 часов после эксплантации костного мозга неприкрепившиеся клетки сливали. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде -МЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37С в СО2-инкубаторе с 5% СО2 в условиях насыщенной влажности. Смену среды производили каждые три дня. При субкультивировании монослойную культуру рассевали в плотности 1000-5000 клеток/см2 (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), использовали стандартные растворы Версена и трипсина.
Методами световой и флуоресцентной микроскопии и цитологическими методами окрашивания было показано, что культивируемые клетки костного мозга крысы: - были CD90+, CD105+, CD34-, CD45- (Jones Е.А. et al., 2002; Zhou D.H. et al., 2003; Tuli R. et al, 2003; Mayer H., 2004; Mansilla E. et al, 2006; Chamberlain G. et al, 2007; Lee S.Y. et al, 2007; Martins A.A. et al, 2009; Coipeau P. et al., 2009; Berner A. et al., 2010). - in vitro прикреплялись к поверхности пластика культивирования, - имели фибробластоподобную морфологию, которую сохраняли все время культивирования, - поддерживались в культуре в течение нескольких пересевов, - формировали колонии фибробластоподобных клеток при посеве в низкой плотности, - в присутствии линейно-специфичных факторов дифференцировались в клетки костной ткани. Для исследования использовали клетки 2-3 пассажей. Однако физические, морфологические и фенотипические признаки также не являются специфическими критериями, которые могут быть использованы для точной идентификации АМСККП. Способность АМСККП к индуцированной дифференцировке in vitro в кости, жир и хрящ является единственным критическим требованием для определения предполагаемых популяций стволовых клеток.
Индукция остеогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток in vitro: МСК имеют различную морфологию, что зависит, в первую очередь, от способов их получения и культивирования. Поэтому перед применением необходимо проведение теста на возможность дифференцировки в заданном направлении (Tallheden Т. et al, 2003).
Поскольку АМСККП свойственна дифференцировка в клетки костной ткани и условия ее проведения наиболее воспроизводимы, этот вид дифференцирования обычно используют для характеристики культур стволовых клеток in vitro и он является типичным заданным по умолчанию путем развития для большинства АМСККП в культуре. Для индукции остеогенной дифференцировки использовали 0,1 M дезоксиметазон, 50 M аскорбиновую кислоту и 10 mM -глицерофосфат («Sigma», США), вызывающие остеогенную дифференцировку (Niemeyer P. et al, 2004; Montjovent М.О. et al., 2004; Minamide A. et al, 2005; Cao T. et al, 2005; Laino G. et al, 2006; Romero-Prado M. et al, 2006; Chai G. et al., 2006; Jger M., Krauspe R., 2007; Song S.J. et al, 2007; Bischoff D.S. et al, 2008; Liu J. et al, 2009а, 2009б; Park K.H. et al, 2009; Reichert J.C. et al, 2009; Hamidouche Z. et al, 2009, 2010; Shi X. et al, 2010; Wang Y. et al, 2010; Korecki C.L. et al, 2010; Hu J. et al, 2010).
Участок повреждения кости нижней челюсти после имплантации полигидроксиалканоата
Численная плотность иммуно- и плазмобластов спустя 1 неделю была выше на 73% и в 2,1 раза, соответственно, относительно состояния спустя 4 и 5 недель. На 2 неделе бластов было больше на 82,5% и в 2,2 раза, также соответственно, и также по сравнению с состоянием на 4 и 5 неделях. К 5 неделе таких клеточных элементов было меньше на 67,9%, чем на 3 неделе (Приложение Д табл. 6) (Приложение Е рис. 38-42).
В герминативных центрах лимфоидных фолликулов лимфатических узлов на все сроки эксперимента присутствовали плазмоциты, нейтрофилы и эритроциты, которых не было у интактных животных. Причем, эритроциты всегда были практически во всех наблюдениях, плазматические клетки сначала были у отдельных крыс, а с 4 недели – также у всех особей. А нейтрофилы присутствовали всегда в качестве случайных находок (Приложение Д табл. 6).
Через 1 неделю процент ретикулярных клеток был меньше на 51%, в 2 и 2,2 раза, соответственно, чем в контроле, на 4 и 5 неделях. Спустя 2 недели клеток стромы было меньше на 40,4%, 90,4% и в 2 раза, соответственно, относительно состояния в контроле, на 4 и 5 неделях. К 3 неделе число данных клеточных элементов также было меньше на 59,7% и 71,8%, также соответственно, по сравнению с состоянием на 4 и 5 неделях. Следует отметить, что на 4 и 5 неделях число ретикулярных клеток было выше на 35,6% и 45,9%, соответственно, чем в контроле (Приложение Д табл. 6).
Численная плотность ретикулярных клеток на 4 неделе была достоверно больше в 2,4, 2,1 раза и на 74,4%, соответственно, по сравнению с состоянием на 1, 2 и 3 неделях. На 5 неделе клеток стромы было больше на 70,7%, в 2,6, 2,3 раза и на 88,2%, также соответственно, чем в контроле и через 1, 2 и 3 недели после операции (Приложение Д табл. 6).
Процент макрофагов на все сроки эксперимента был выше, чем в контроле. Через 1, 2, 3, 4 и 5 недель величина значения этого показателя была больше на 95,4%, в 2,2, 2,5, 2,6 и 2,8 раза, соответственно, чем в контроле. Кроме того, на 5 неделе макрофагов было больше на 43,7%, чем на 1 неделе после операции (Приложение Д табл. 6) (Приложение Е рис. 38-42).
Число макрофагов на единицу площади среза на 2, 3, 4 и 5 неделях было больше в 2,2, 2,6, 3 и 3,3 раза, соответственно, по сравнению с контролем (Приложение Д табл. 6) (Приложение Е рис. 38-42).
Относительное содержание митозов через 1 и 2 недели было больше в 2,1, 2, 3,4 и 3,7 раза, соответственно, чем в контроле и спустя 3, 4 и 5 недель (Приложение Д табл. 6).
Абсолютное число делящихся клеток спустя 1 неделю было выше в 2,1, 2,9 и 3,3 раза, соответственно, по сравнению с данными в контроле, спустя 4 и 5 недель. На 2 неделе митозов было больше в 3 и 3,4 раза, также соответственно, относительно состояния на 4 и 5 неделях (Приложение Д табл. 6).
Относительное содержание клеток с признаками деструктивных изменений через 1, 2, 3, 4 и 5 недель превосходило в 2,6, 2,6, 3,1, 3,5 и 3,5 раза, соответственно, контрольный уровень (Приложение Д табл. 6) (Приложение Е рис. 38-42).
Численная плотность клеток с явлениями деструкции также была на 1, 2, 3, 4 и 5 неделях больше в 2,5, 2,7, 3,3, 4 и 4,1 раза, также соответственно, и также по сравнению с состоянием у интактных крыс (Приложение Д табл. 6) (Приложение Е рис. 38-42).
Различия в состоянии герминативных центров между крысами со спонтанным заживлением участка повреждения кости нижней челюсти и репаративными процессами на фоне использования ПГА были найдены в изменениях количества практически всех клеточных элементов: численности лимфоцитов, иммуно- и плазмобластов, плазмоцитов, ретикулярных клеток, макрофагов, эритроцитов и клеток с признаками деструктивных изменений (Приложение Д табл. 4, 6).
При спонтанном заживлении нижней челюсти процент лимфоцитов на 5 неделе был статистически достоверно выше на 30,6%, чем на этот срок на фоне использования ПГА (Приложение Д табл. 4, 6).
Относительное содержание иммуно- и плазмобластов на 4 и 5 неделях после операции с внедрением ПГА было ниже на 58,2% и 63,8%, соответственно, чем при самостоятельной репарации (Приложение Д табл. 4, 6).
Плазмоциты полностью отсутствовали спустя 5 недель, а эритроциты -через 3, 4 и 5 недель после операции и естественном заживлении, однако после использования полимера данные клетки на указанные сроки были найдены у всех особей (Приложение Д табл. 4, 6).
Процент ретикулярных клеток на 4 и 5 неделях при спонтанном заживлении был статистически достоверно ниже на 73,7% и 59%, соответственно, чем на аналогичные сроки на фоне использования ПГА (Приложение Д табл. 4, 6).
Абсолютное содержание клеток стромы на 4 и 5 неделях после операции с внедрением ПГА также было больше в 2 раза и на 77,6%, и также соответственно, чем при самостоятельной репарации (Приложение Д табл. 4, 6).
Процент макрофагов на 4 и 5 неделях при естественной репарации был статистически достоверно ниже на 58,3% и 71,7%, соответственно, чем на аналогичные сроки на фоне использования ПГА (Приложение Д табл. 4, 6).
Количество макрофагов на единицу площади среза на 5 неделе после операции с применением ПГА также больше на 92,9%, чем при самостоятельной репарации (Приложение Д табл. 4, 6).
Относительное и абсолютное число клеточных элементов с признаками деструктивных изменений через 5 недель после применения ПГА были больше в 2,5 и 2,8 раза, соответственно, относительно аналогичного срока спонтанной регенерации (Приложение Д табл. 4, 6).
Достоверных отличий между состоянием центров размножения лимфоидных фолликулов субмандибулярных лимфатических узлов после имплантации в участок повреждения кости нижней челюсти между чистым ПГА или ПГА с адсорбированными АМСККП не было обнаружено (Приложение Д табл. 5, 6).
Изменения центров размножения лимфоидных фолликулов
Эритроциты могли попасть в структуры лимфатических узлов из места хирургического вмешательства. Однако, было отмечено увеличение числа этих клеток и через 2 недели и позже после начала эксперимента.
Любая воспалительная реакция сопровождается блокадой микроциркуляторного русла. Кроме того, в результате выброса биоактивных веществ в ответ на антигенную стимуляцию происходит нарушение сосудистой проницаемости (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990).
Возможно, что в первую очередь именно вследствие нарушений сосудистой проницаемости как в месте операции, так и в самих лимфатических узлах, происходит найденное возрастание численности клеточных элементов красной крови.
Отличия между состоянием центров размножения субмандибулярных лимфатических узлов после имплантации в участок повреждения кости нижней челюсти чистого ПГА или ПГА с АМСККП не найдены.
Если применение АМСККП и вызывает какие-либо изменения в центрах размножения лимфоидных фолликулов, то такие изменения маскируются изменениями, которые обусловлены присутствием в дефекте кости нижней челюсти инородного тела – ПГА, способствующего инициации и поддержанию хронической воспалительной реакции (Майбородин И.В. и др., 2010а, 2011б, 2012а, 2012б).
Через 1 неделю после имплантации ПГА с адсорбированными АМСККП с трансфицированным геном GFP в дефект кости нижней челюсти в субмандибулярных лимфатических узлах присутствовали овальные скопления ярко светящихся клеток. Эти клетки были очень крупными, до 20 мкм в диаметре.
Если в дефекте кости нижней челюсти, куда имплантировали полимер с адсорбированными АМСККП, их цитоплазма светилась более-менее равномерно, и иногда было видно темное ядро, то в лимфатических узлах в светящихся клетках светилась не вся цитоплазма, а разные по размерам овальные гранулы, то есть клетка представляла собой скопление ярко светящихся частиц с четкими ровными краями. Размер этих гранул достигал 10 мкм. Кроме того, в узлах светящиеся клетки никогда не выстраивались в цепочки и не формировали замкнутых кольцеобразных структур, даже отдаленно похожих на сосуды.
Такие клетки со свечением располагались в лимфоидных фолликулах, в пользу чего свидетельствует то, что на некоторых препаратах четко видны различия в плотности тканей между скоплениями светящихся клеток и вокруг них и то, что такие скопления имеют шаровидную форму и расположены только в корковом веществе недалеко от капсулы, то есть в корковом плато, а не в паракортексе и не среди мозговых синусов в мякотных тяжах.
Скорее всего, как уже было отмечено в предыдущей главе, светящиеся клетки в лимфатических узлах являются макрофагами. Такое заключение сделано на основании нескольких причин: 1. Размер клеток. Только очень немногие клетки могут превышать по размеру 20 мкм, и среди таких клеточных элементов - макрофаги. 2. Наличие множества разнокалиберных включений, которые, скорее всего, являются лизосомами. 3. Неправильная форма клеток. 4. Расположение в лимфатических узлах. Выше уже было отмечено, что в лимфатических узлах макрофагов очень много в герминативных центрах лимфоидных фолликулов, куда они представляют антигены для осуществления иммунных функций и где они фагоцитируют и лизируют клетки с признаками деструктивных изменений, множество которых образуется при делении и дифференцировке В-лимфоцитов. Кроме того, при исследовании цитограммы лимфоидных узелков было обнаружено, что уже через 1 неделю после имплантации ПГА с адсорбированными АМСККП количество макрофагов значительно превышало исходный уровень. Наиболее вероятно, что светящиеся разнокалиберные гранулы в макрофагах являются лизосомами с поглощенным флуоресцентным материалом. В главе 3 уже было отмечено существование множества данных об аутофлуоресценции макрофагов в некоторых условиях (Njoroge J.M et al., 2009; Rijt van L.S et al., 2004; Vermaelen K., Pauwels R., 2004; Kable E.P., Kiemer A.K., 2005; Garn H., 2006; Mendes-Jorge L. et al., 2009; Mitchell A.J. et al., 2010; Davis R.W. et al., 2010; Li F. et al., 2012; Duan M. et al., 2012). Но в таком случае должна быть точно такая флуоресценция макрофагов в лимфатических узлах животных после применения ПГА без АМСККП. Однако, в данном случае в лимфатических узлах светятся только единичные небольшие клетки (эритроциты).
В лимфатических узлах животных после применения ПГА без АМСККП светящиеся объекты независимо от формы и цитоплазменных включений полностью отсутствовали как по одиночке, так и скоплениями, как в лимфоидных фолликулах, так и в других структурах данных органов. В широком поле зрения были видны единичные небольшие светящиеся объекты (клетки), но это были эритроциты во внутриузловых сосудах, об аутофлуоресценции красных клеток крови в литературе также имеется множество публикаций (Stoya G. et al., 2002; Liu S. et al., 2002; Jimnez-Daz M.B. et al., 2005; Xie L. et al., 2007; Khandelwal S., Saxena R.K., 2007; Wu X. et al., 2010; Campo J.J. et al., 2011; Watson J., 2011).
Можно сделать предположение, что такие крупные светящиеся клетки в лимфатических узлах являются не просто макрофагами, а макрофагами, которые фагоцитировали введенные АМСККП или структуры, сформированные из таких клеток. В научной литературе имеются результаты исследований, указывающие на возможность флуоресценции макрофагов за счет свечения фагоцитированного и метаболизированного материала в их гранулах (Plowman P.N., Flemans R.J., 1980; Wang N.K. et al., 2009; Luhmann U.F. et al., 2009; Iida T., 2011; Lei L. et al., 2012).