Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Этиология, патогенез и патоморфология гриппа в современных условиях (обзор литературы) 10
1.1. Характеристика возбудителей гриппа 10
1.2. Краткие сведения об эпидемиологии и клинике гриппа 11
1.3. Патогенез и патологическая анатомия поражения органов дыхания при гриппе 12
1.4. Патогенез и патологическая анатомия внелегочных поражений при гриппе 17
1.5. Латентная гриппозная инфекция и персистенция вируса гриппа в организме 21
1.6. Осложнения, связанные с суперинфекцией 23
1.7. Факторы риска тяжелого течения заболевания и наступления летального исхода при гриппе 24
1.8. Причины смерти больных гриппом 28
1.9. Основные отличительные признаки летальных исходов от гриппа в период пандемии 2009 – 2010 гг. 29
1.10. Сравнительная характеристика летальных исходов от гриппа во время пандемии 2009 – 2010 гг. и в постпандемический период 30
1.11. Заключение по главе 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Характеристика исследованного клинического материала в эпидемический период 33
2.2. Характеристика материала, подвергнутого иммуногистохимическому исследованию 39
2.3 Методика иммуногистохимического исследования 40
2.4 Методы статистической обработки 41
Глава 3. Результаты исследования 42
3.1. Клинико-морфологический анализ летальных исходов от лабораторно подтвержденного гриппа 42
3.1.1. Клиническая характеристика гриппа 42
3.1.2. Патоморфологическая характеристика гриппа
3.1.2.1. Поражение органов дыхания при гриппе 48
3.1.2.2. Внелегочные поражения при гриппе
3.1.3. Причины смерти и механизмы танатогенеза при гриппе 87
3.1.4. Группы высокого риска наступления летального исхода 89
3.1.5. Анализ летальных исходов от гриппа у беременных 96
3.1.6. Сравнительная характеристика летальных исходов от гриппа во время пандемии 2009-2010 гг. и постпандемический период 112
3.2. Клинико-морфологический и иммуногистохимический анализ летальных исходов острых пневмоний в эпидемический и межэпидемический по гриппу период 114
Обсуждение результатов исследования 131
Заключение 154
Выводы 156
Практические рекомендации 158
Список литературы
- Патогенез и патологическая анатомия поражения органов дыхания при гриппе
- Характеристика материала, подвергнутого иммуногистохимическому исследованию
- Причины смерти и механизмы танатогенеза при гриппе
- Клинико-морфологический и иммуногистохимический анализ летальных исходов острых пневмоний в эпидемический и межэпидемический по гриппу период
Патогенез и патологическая анатомия поражения органов дыхания при гриппе
На организм человека вирус гриппа оказывает ряд патогенетических воздействий. Основные из них – цитопатическое, вазопатическое, иммунодепрессивное [48]: 1. Цитопатическое (цитолитическое) действие вируса на эпителий, прежде всего, бронхов, трахеи и альвеол, эндотелий сосудов, а также нейроэпителий, клетки трофобласта вызывает их альтерацию, некроз, десквамацию. 2. Вазопатическое (вазопаралитическое) действие вызывает полнокровие, стазы, плазмо- и геморрагию. 3. Иммунодепрессивное действие вируса проявляется в угнетении активности нейтрофилов (подавление фагоцитоза), моноцитарных фагоцитов (подавление хемотаксиса и фагоцитоза), в дисфункции иммунной системы (развитие аллергии, появление патогенных иммунных комплексов).
Вирусы гриппа обладают тропностью к эпителию дыхательных путей. Они размножаются в клетках цилиндрического эпителия и вызывают их дегенеративные изменения, используя содержимое клеток для построения новых вирусных частиц. Массированный выход зрелых вирусов в межклеточное пространство нередко сопровождается гибелью эпителиальных клеток. Вирусы гриппа высвобождаются из клеток через их апикальные поверхности, что ограничивает распространение вируса во внутренние среды организма и определяет его преимущественный тропизм к эпителию респираторного тракта [137, 183].
При легком и среднетяжелом течении заболевания в инфекционный процесс преимущественно вовлечены верхние дыхательные пути и трахея, а в тяжелых и летальных случаях наблюдается поражение дистальной части бронхиального дерева и альвеол [185]. При этом репликация вируса происходит в альвеолоцитах, что напрямую, а также опосредованно через воспалительный ответ хозяина, приводит к повреждению альвеол [89].
Макроскопические черты гриппозной инфекции неспецифичны [43, 44]. Слизистая дыхательных путей в различной степени гиперемирована, цианотичная, пораженные отделы легких уплотнены, иногда наблюдается отек.
В слизистой полости носа обычно наблюдается катаральное воспаление с умеренно выраженной гиперемией, лимфоидной инфильтрацией собственной пластинки, разрыхлением и десквамацией покровного эпителия [20, 35, 36, 44]. Аналогичные изменения отмечаются со стороны слизистой гортани, покрытой мерцательным эпителием. Изменения в миндалинах и глотке, как правило, отсутствуют [19]. Наиболее постоянно выявляется поражение трахеи и бронхов в виде простого катарального воспаления, сопровождаемого дистрофическими изменениями поверхностных слоев респираторного эпителия с исчезновением ресничек, набуханием, вакуолизацией цитоплазмы, разрыхлением эпителиального пласта и последующей десквамацией пораженных клеток. Одновременно может наблюдаться кажущаяся беспорядочной пролиферация эпителия с заметным утолщением эпителиального покрова [20, 97]. Для случаев, осложненных бактериальной инфекцией, характерно наличие некротического, геморрагического [16, 28, 97] и даже гнойного [185] трахеита. Поражение мелких бронхов и бронхиол описывается как «некротизирующий бронхит и бронхиолит», который включает тотальное слущивание эпителия и формирование гиалиновых мембран на их внутренней поверхности, а в некоторых случаях – деструкцию и массивную нейтрофильную инфильтрацию их стенок [131]. Имеются также указания на облитерирующий бронхиолит [154].
Морфологические изменения в респираторных отделах легких включают скопление отечной жидкости в просветах альвеол с примесью фибрина, эритроцитов и десквамированных пневмоцитов с пикнотичными ядрами, утолщение альвеолярных перегородок вследствие полнокровия капилляров, интерстициального отека и лейкоцитарной инфильтрации. В целом, данные изменения описываются как вирусная пневмония [44, 101, 123, 156].
Кажущееся утолщение межальвеолярных перегородок, нередко оцениваемое как «интерстициальная пневмония», оказывается лишь спадением отдельных альвеол [44]. Регенерация и восстановление поврежденной паренхимы легких может занимать недели и иногда месяцы [83]. На поздних стадиях вирусной пневмонии наблюдается организация экссудата и реэпителизация альвеол с гиперплазией альвеолоцитов второго типа, а также интерстициальная инфильтрация мононуклеарными лейкоцитами [123]. В отдаленный период выявляется вариабельная по интенсивности интерстициальная мононуклеарная инфильтрация, фиброз альвеолярных перегородок, увеличенное количество альвеолярных макрофагов [201, 204]. В ряде случаев регенерация эпителия дыхательных путей происходит с его метаплазией в многослойный, что приводит к нарушению дренажной функции бронхов и способствует развитию хронических пневмоний смешанной этиологии [11, 28].
Для вирусного поражения альвеолоцитов характерно расширение и интенсивное окрашивание цитоплазмы, а также увеличение ядер с более бледным их окрашиванием. Измененные таким образом клетки в работах А.В. Цинзерлинга названы «гриппозными». На ранних стадиях заболевания в таких клетках содержится антиген вируса [44]. В дальнейшем, по мере увеличения клеток в размерах, они подвергаются лизису. Сходные изменения отдельных альвеолоцитов описаны и другими авторами [131, 154, 155, 161].
Похожие изменения можно обнаружить и в эндотелиальных клетках сосудов легких [29, 44], что, вероятно, указывает на способность вируса поражать не только клетки респираторного эпителия и макрофаги, но также эндотелий, что в свою очередь, может приводить к вирусемии.
В ткани легких, умерших от гриппа, вызванного вирусом Калифорния/2009 (H1N1), на разных сроках заболевания обнаруживались также эпителиальные клетки и макрофаги большего размера, чем описанные ранее, с увеличенным ядерно-цитоплазматическим соотношением, часто с двумя и более ядрами с отчетливыми ядрышками, не имевших склонности к лизису. Такие клетки условно названы «гриппозными клетками второго типа» [8, 29].
В ряде случаев, особенно в первые дни после начала заболевания (или заражения экспериментального животного), в цитоплазме клеток эпителия на всем протяжении дыхательных путей наблюдаются мелкие базофильные богатые РНК включения с небольшим просветлением вокруг. Их принято рассматривать как микроколонии вируса с участием нуклеопротеидов клеточного происхождения [15, 20, 28, 44], наряду с этим встречаются фуксинофильные включения, имеющие вид довольно крупных, округлых, резко очерченных образований и чаще всего располагаются над ядром клетки [35]. Фуксинофильные включения не являются специфичными для гриппа, т.к. возникают при всех респираторных вирусных инфекциях, но не встречаются при бактериальных, микоплазменной и протозойной инфекциях [44].
Характеристика материала, подвергнутого иммуногистохимическому исследованию
Во второй части исследования на секционных материалах трех патологоанатомических отделений стационаров и ГБУЗ «Бюро судебно медицинской экспертизы» (г. Архангельск) проведен клинико морфологический анализ 40 летальных исходов от острых пневмоний за 2009 2013 гг. с использованием ИГХ метода.
Для анализа было выбрано 20 случаев (основная группа), в которых, при наличии пневмонии, клиническая и/или морфологическая картина позволяли заподозрить острую респираторную вирусную инфекцию (ОРВИ), в т.ч. грипп, но по разным причинам такой диагноз не был установлен. В 18 случаях пациенты на ОРВИ не были обследованы, в двух – результат исследования носоглоточного мазка методом ОТ-ПЦР был отрицательным. 17 случаев относились ко времени пандемии 2009-2010 гг. (вскрытия с ноября 2009 по январь 2010), а также сезонного подъема заболеваемости (февраль-март 2011, февраль-апрель 2013), 3 случая наблюдались в межэпидемический период. Морфологические признаки вероятного гриппа включали наличие характерных цитопатических / цитопролиферативных изменений в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах.
Дополнительно была сформирована группа сравнения из 20 случаев, в которых не было клинико-морфологических оснований подозревать грипп. В данной группе было выделено 2 подгруппы. В первую были включены 8 летальных исходов, произошедших в указанные выше эпидемические периоды. В большинстве случаев у умерших имелось тяжелое основное заболевание, а пневмония рассматривалась как танатогенетически значимое осложнение и носила, преимущественно, гнойный характер (в 6 из 8 наблюдений). Во вторую подгруппу было включено 12 наблюдений смертельных исходов от острых бактериальных пневмоний различной этиологии во внеэпидемические периоды.
Во всех случаях были проанализированы истории болезни, протоколы патологоанатомических вскрытий, а также подобраны по 4-5 парафиновых блоков с образцами ткани легкого от каждого наблюдения, с которых на санном микротоме Slide 2003 сделано по 1 срезу, окрашенному на предметном стекле гематоксилином и эозином по стандартной методике. На следующем этапе, после исследования приготовленных гистологических препаратов, из подобранных парафиновых блоков с образцами ткани легкого были выбраны 1-2 блока, наиболее подходящие для ИГХ исследования (для основной группы – с наличием характерных цитопатических изменений, для группы сравнения – с сохраненной структурой легочной ткани и наличием бронхиального эпителия в срезах).
Для ИГХ анализа срезы с одного-двух парафиновых блоков из ткани легкого каждого секционного наблюдения освобождали от парафина в ксилоле, регидратировали в спиртах убывающей концентрации, обрабатывали мышиными моноклональными антителами к нуклеопротеину вируса гриппа А (ОАО «ППДП, г. Санкт-Петербург), отмывали от несвязавшихся антител и инкубировали с раствором вторичных антител, меченных пероксидазой (Sigma, кат.#A2304). После отмывки от несвязанных вторичных антител проводили визуализацию метки при помощи системы визуализации (Abcam, ab64238) в соответствии с инструкцией производителя.
Для положительного контроля использовали парафиновые блоки легкого трех секционных случаев (2009, 2011 и 2013 гг.) с лабораторно и морфологически подтвержденным гриппом, для отрицательного контроля – парафиновые блоки легкого из 3 наблюдений во внеэпидемические периоды, при которых поражения дыхательных путей и легких отсутствовали.
Исследование производили методом микроскопии в проходящем свете в светлом поле с использованием микроскопа Leica DM750 при увеличении: окуляр х10, объектив х10, х20, х40, х63, микрофотосъемку производили при увеличении х200, х400, х630, фотокамерой Leica ICC50.
При анализе результатов ИГХ исследования обращали внимание на тип клеток, дающих реакцию, их внешний вид, локализацию, численность, тип и интенсивность окрашивания. Для определения численности позитивных клеток и интенсивности реакции использовали раздельную полуколичественную оценку: 0 (окраска отсутствует), 1+ (окраска средней интенсивности/количество позитивных клеток – 1-2 на 10 полей зрения при увеличении 400, для эпителия бронхов – позитивность клеток хотя бы в одном эпителиальном пласте в срезе), 2+ (окраска интенсивная/количество позитивных клеток более двух на 10 полей зрения при увеличении 400, для эпителия бронхов – позитивность клеток более чем в одном пласте в срезе).
Причины смерти и механизмы танатогенеза при гриппе
Таким образом, морфологические изменения в легких расценены как грипп, тотальная серозно-десквамативная вирусная пневмония в фазе организации в сочетании с микотической инфекцией дыхательных путей. Одной из особенностей данного случая явилось постепенное ухудшение состояния пациента с нарастанием интоксикации, увеличением объема поражения легких с прогрессированием дыхательной, а затем и полиорганной недостаточности. В течение десяти суток жизнедеятельность организма поддерживалась интенсивной терапией, это повлияло на увеличение общей продолжительности заболевания и отразилось на преобладающих морфологических изменениях в органах дыхания, что проявилось, в частности, в переходе воспалительного процесса в продуктивную фазу, а также в возникновении (или активации) микотической инфекции бронхов.
Третья группа была очень разнородной, в ней наблюдались случаи со всеми вышеперечисленными изменениями, кроме серозно-геморрагического отека: в большинстве случаев (кроме двух) имелись также черты серозно-десквамативной пневмонии, в восьми – с чертами организации, в трех – с чертами острой фазы диффузного альвеолярного повреждения. В просвете альвеол преобладали нейтрофильные лейкоциты, поражения варьировали от мелкоочаговых до сливных, вплоть до абсцедирования. Во всех случаях отмечался слизисто-гнойный бронхит и протяженная десквамация эпителия бронхов, в пяти – гнойно-некротический трахеит. В двух наблюдениях были выражены гиперпластические разрастания клеток альвеолярной выстилки, образовывавшие сплошные поля.
Для определения степени бактериальной наслойки оценивалось количество нейтрофилов в альвеолах. При слабой степени ее выраженности отмечалось незначительное преобладание нейтрофилов среди других клеток в содержимом альвеол. Данные изменения наблюдались у 6 умерших с небольшой продолжительностью заболевания от 7 до 12 суток, в половине случаев имелось сочетание с диффузным повреждением альвеол, а признаки организации отсутствовали (рис. 20).
При выраженной бактериальной наслойке (11 случаев – 24,4%, со средней продолжительностью заболевания 21,2 суток) экссудат был преимущественно нейтрофильным (гнойным), а пневмония носила сливной характер, у 6 умерших – полисегментарный с абсцедированием (рис. 21). и эозином. В 9 случаях (82%) смерть наступила позднее 16 суток от начала гриппозной инфекции, у 8 умерших параллельно наблюдались регенераторные и гиперпластические процессы. Только в 2 случаях имелись остаточные черты диффузного альвеолярного повреждения при преобладании признаков организации. В 4 случаях выявленная гнойная пневмония не сохранила черт вирусной.
В 4 наблюдениях (как при наличии признаков бактериальной коинфекции, так и без нее) у умерших на поздних сроках от начала заболевания (17, 22, 24 и 41 сутки) в просвете альвеол обнаруживались макрофаги с широкой светлой цитоплазмой, имеющей вакуолизированный вид. Такой характер изменений альвеолярных макрофагов позволил заподозрить хламидийную или микоплазменную коинфекцию легких. Ниже – характерный клинический пример.
Пациент В., 53 года, грузчик, злоупотребляющий алкоголем, заболел остро 07.12.2009: отмечался подъем температуры до 39C, сухой кашель, насморк. За медицинской помощью не обращался, ходил на работу. В течение последующих пяти суток – ухудшение состояния: лихорадка до 40,2C, сильная слабость, головная боль, однократно был жидкий стул. Доставлен 12.12 с места работы в профильный стационар бригадой «скорой помощи».
При поступлении состояние расценено как тяжелое по интоксикации. Отмечалась незначительная гиперемия зева и ослабление дыхания в нижних отделах легких (аускультативно), там же – влажные хрипы. Частота сердечных сокращений 96 ударов 1 мин, частота дыхательных движений 20 в 1 мин. На рентгенограмме органов грудной клетки – признаки правосторонней нижнедолевой пневмонии.
С момента поступления в лабораторных показателях отмечались следующие отклонения: выраженный агранулоцитоз (0,2х109/л и тромбоцитопения 22х109/л) при отсутствии анемии, многократное повышение уровня трансаминаз. Был редуцирован диурез (100 мл мочи за первые сутки), мочевина и креатинин крови – на верхней границе нормы, протеинурия – 0,6 г/л. Проводилась противовирусная (тамифлю 75 мг/сут) и антибактериальная (максицеф внутривенно, сумамед) терапия, бронхолитическая, антикоагулянтная, дезинтоксикационная, симптоматическая терапия, стимуляция диуреза возрастающими дозами лазикса. За время госпитализации состояние пациента ухудшалось в связи с развитием острой почечной недостаточности, а также постепенным прогрессированием дыхательной недостаточности. С 18.12 пациент находился в коме, переведен на ИВЛ. На рентгенограмме органов грудной клетки – признаки двусторонней полисегментарной пневмонии. В дальнейшем начали нарастать явления депрессии гемодинамики, и 23.12 наступила смерть. Продолжительность заболевания составила 17 дней.
Заключительный клинический диагноз: грипп A(H1N1)-09, тяжелое течение. Двухсторонняя полисегментарная пневмония. Полиорганная недостаточность (токсический гепатит, нефропатия, агранулоцитоз).
На вскрытии: слизистая трахеи и главных бронхов не ярко гиперемирована, на внутренней поверхности главных и долевых бронхов – рыхлые, легко снимающиеся наложения белого цвета. Легкие увеличены, плотно-эластичные (резиновой плотности), серовато-красные, базальные сегменты – печеночной плотности, темно-вишневые. При пальпации во всех отделах легких, за исключением базальных, определялись многочисленные очажки, более плотные, чем окружающая ткань, но не отличающиеся от нее по цвету. Отмечались пятнистые кровоизлияния под плеврой. Головной мозг значительно размягчен, на разрезе практически бесструктурный, границы между серым и белым веществом не видны, в каудальной части ствола – геморрагическое пропитывание.
Клинико-морфологический и иммуногистохимический анализ летальных исходов острых пневмоний в эпидемический и межэпидемический по гриппу период
В основной группе ИГХ реакция в цитоплазме эпителия бронхов установлена в 10 случаях (50%), в том числе в трех из них – интенсивная, в двух – распространенная. Окраска пластов бронхиального эпителия не была диффузной: позитивность демонстрировали преимущественно клетки с увеличенными светлыми ядрами округлой формы. Окрашивание альвеолоцитов с цитопатическими изменениями (также цитоплазматическое) отмечено в 6 наблюдениях (30%): в пяти – распространенное, в двух из них – интенсивное. Во всех 6 случаях имелось также четкое окрашивание бронхиального эпителия. Случаи с высокой интенсивностью окраски эпителиальных клеток демонстрировали также более распространенное их окрашивание.
Окрашивание цитоплазмы макрофагов без признаков цитопатических изменений обнаружена в 11 наблюдениях (55%), численность окрашенных клеток оценена на 2+ в 4 случаях, интенсивность окраски – в пяти. В 8 наблюдениях из этих одиннадцати (73%) отмечалась также позитивность эпителиальных клеток, во всех этих случаях макрофаги демонстрировали высокоинтенсивное и/или распространенное окрашивание. Окрашенные макрофаги находились преимущественно в интерстиции альвеол и только в трех случаях – в просвете.
В эндотелии кровеносных сосудов реакция встретилась в 3 наблюдениях (15%) в единичных клетках (тип окрашивания – ядерный и цитоплазматический), во всех случаях сочетаясь с окрашиванием альвеолоцитов и/или бронхиального эпителия, а также макрофагов. ИГХ реакция обнаруживалась только в тех эпителиальных клетках, в которых имелись цитопатические / цитопролиферативные изменения. Реакция в бронхиальном эпителии и альвеолоцитах обнаруживалась максимально на 22 сутки от начала заболевания, в эндотелии – на 13 сутки, в интерстициальных макрофагах – на 40 сутки. При наличии признаков бактериальной пневмонии (8 наблюдений с нейтрофильным экссудатом в альвеолах) окрашивание бронхиального эпителия имелось в 3 случаях (37,5%), альвеолярного – в двух (25%). Приводим клинический пример из ряда смертельных исходов от пневмоний, произошедших в эпидемический период.
Клинический пример 7. Пациент Г., 25 л., инвалид с детства (перинатальное поражение ЦНС) заболел остро 05.12.2009 на фоне злоупотребления алкоголем в течение недели (лихорадка до 38C, сухой кашель, боль в груди при дыхании, слабость, с 08.12 – одышка). Самостоятельно не лечился, 09.12 осмотрен участковым врачом, направлен в стационар. При поступлении 09.12.2009: состояние очень тяжелое в связи с выраженной интоксикацией, дыхательной недостаточностью (одышка 32 в 1 мин., акроцианоз, тахикардия 132 в 1 мин.), истощен. На рентгенограмме органов грудной клетки – картина двусторонней полисегментарной пневмонии. Госпитализирован в ОАРиИТ. Проводилась антибактериальная (максицеф, ванкоминин), патогенетическая терапия. В течение суток состояние больного с отрицательной динамикой – прогрессировала дыхательная недостаточность, отмечались судороги, явления психоза, в дальнейшем – брадикардия и остановка сердечной деятельности.
На вскрытии: слизистая нижних дыхательных путей умеренно гиперемирована, в просвете трахеи и бронхов – небольшое количество розовой пенистой слизи. Легкие увеличены, нижние доли печеночной плотности, серо-коричневого цвета, верхние доли с такими же изменениями в задне-нижних отделах. С поверхности разреза уплотненных частей легких стекает скудное количество густой мутной кровянистой жидкости.
При гистологическом исследовании: легочные альвеолы тотально заполнены плотным базофильным экссудатом мелкодисперсного вида (фибрин, микроорганизмы, нейтрофилы, макрофаги). В просвете бронхиол и бронхов – густая слизь с лейкоцитами и десквамированный эпителий. В бронхиальном эпителии выявлена пролиферация клеток с увеличением толщины пласта, одновременно с его разрыхлением и вакуолизацией (рис. 47). При бактериологическом исследовании из ткани легких выделен St. aureus. Исследование на ОРВИ не проводилось.
Патологоанатомический диагноз: Острая двусторонняя полисегментарная гнойная бактериальная пневмония. В результате ИГХ исследования ткани легких интенсивное цитоплазматическое окрашивание выявлено в пластах бронхиального эпителия, в которых имелись вышеописанные десквамативно– пролиферативные изменения (рис. 48), что свидетельствует о том, что они были индуцированы вирусом гриппа, несмотря на ведущие морфологические проявления бактериальной пневмонии.
Распространенное и интенсивное окрашивание бронхиального эпителия и альвеолоцитов обнаружено у 4 из 6 умерших, по которым отсутствовала клиническая информация. Один из этих пациентов, госпитализированный в плановом порядке в период эпидемии гриппа для оперативного лечения опухоли головного мозга, умер внезапно от острой коронарной недостаточности при отсутствии клиники ОРВИ и танатогенетически значимой пневмонии. Ниже приводим подробное описание этого случая.