Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Патогистологические изменения в ткани головки бедра при различных этиологических формах коксартроза 13
1.2. Механизмы взаимодействия остеобластов и остеокластов в процессе ремоделирования костной ткани 18
1.3. Значение фактора роста эндотелия сосудов в развитии остеоартроза .20
1.4. Тетрат-резистентная кислая фосфатаза в оценке резорбтивной активности остеокластов 23
1.5. Апоптоз и пролиферативная активность клеток костной ткани при остеоартрозе 1.5.1. Маркеры апоптоза (р53 и bcl-2) 24
1.5.2. Маркер пролиферативной активности (Ki-67) 28
1.6. Резюме 30
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Материалы исследования 31
2.2. Методы исследования 33
ГЛАВА 3. Морфологические особенности строения головки бедра при коксартрозе 38
3.1. Макроскопические особенности строения головки бедра при коксартрозе 38
3.2. Гистопатологические особенности строения ткани головки бедра при коксартрозе 41
3.3. Морфометрические особенности ткани головки бедра при коксартрозе
3.3.1. Толщина суставной поверхности, костных балок и их площадь 47
3.3.2. Выраженность фиброза суставной поверхности и костной ткани 50
3.4. Резюме 54
Глава 4. Иммуногистохимические особенности костной ткани головки бедра при коксартрозе 56
4.1. Оценка уровня экспрессии VEGF клетками костной ткани 56
4.2. Средняя площадь сосудов микроциркуляторного русла 60
4.3. Уровень экспрессии TRAcP остеокластами и количество остеокластов 62
4.4. Оценка уровня пролиферативной активности и апоптоза клеток костной ткани головки бедра
4.4.1. Особенности экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67 65
4.4.2. Особенности экспрессии маркера ингибитора апоптоза bcl-2 68
4.4.3. Особенности экспрессии маркера активатора апоптоза р53 71
4.5. Резюме 73
ГЛАВА 5. Корерляционный анализ морфологических и иммуногистохимических показателей костной тканиголовки бедра при коксартрозе 75
5.1. Корреляционный анализ при диспластическом коксартрозе 75
5.2. Корреляционный анализ при постишемическом коксартрозе 79
5.3. Корреляционный анализ при посттравматическом коксартрозе 81
5.4. Резюме 83
Заключение 85
Выводы 89
Практические рекомендации 91
Список сокращений и условных обозначений 92
Список литературы
- Механизмы взаимодействия остеобластов и остеокластов в процессе ремоделирования костной ткани
- Методы исследования
- Морфометрические особенности ткани головки бедра при коксартрозе
- Особенности экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67
Введение к работе
Актуальность темы. Остеоартроз – одно из древнейших заболеваний, признаки которого выявлены по скелету динозавров и египетских мумий et al., 2003). В настоящее время отсутствуют достоверные данные об эпидемиологии болезней суставов как в России, так и в других странах мира. По последним данным, в России остеоартрозом страдает от 10% до 12% населения (Забелло Т.В. и др., 2015). Остеоартроз – самая распространенная патология суставов, значительно ухудшающая качество жизни больных и являющаяся одной из основных причин возникновения временной и стойкой потери трудоспособности (Dieppe P.A. et al., 2005; Buchanan W.W. et al., 2002). По прогнозам, к 2020 году в связи с увеличением продолжительности жизни и ростом ожирения количество больных коксартрозом будет в два раза выше, чем в настоящее время. В США к 2030 году количество пациентов, страдающих остеоартрозом, увеличится до 67 миллионов человек et al.,2015).
По данным различных авторов, среди всей патологии суставов у взрослого
населения коксартроз составляет от 6,5% до 25% (Волокитина Е.А., 2012; et
al., 2009). Инвалидизация пациентов при данном заболевании может доходить до 64%
(Атаманский И.А. и др., 2004). Основные причины развития коксартроза – дисплазия
, 2014), травма тазобедренного сустава et al., 2014) и асептический
некроз головки бедренной кости (Агаджанян В.В. и др., 1988). Эндопротезирование –
наиболее распространенный метод лечения пациентов с терминальными стадиями
коксартроза. Однако риск развития большого числа осложнений после проведения
эндопротезирования подталкивают на поиск и разработку альтернативных
малоинвазивных методов лечения пациентов с данной патологией суставов. К таким методам можно отнести различные способы трансплантации костной ткани в патологически измененные компоненты сустава, использование клеточных технологий, множество вариантов реваскуляризирующих операций и многое другое (Зайдман А.М. и др., 2005; Зайдман А.М. и др., 2015; Шушарин А.Г., 2011; Petti C.A. et al., 2015; Gordon M et al., 2016; Wehling P. et al., 2016; Freitag J. et al., 2016). Для более объективной оценки результатов лечения данными методами необходимо четко понимать гистопатологические и иммуногистохимические особенности ткани головки бедренной кости при отдельных этиологических формах коксартроза.
Ученые на протяжении нескольких десятилетий неоднократно пытались дать морфологическую характеристику изменениям хрящевой ткани при остеоартрозе и создать различного рода классификации (Mankin H.J. et al., 1971; et al., 2016). В последнее время большое значение при изучении особенностей развития остеоартроза уделяется ни только хрящевой ткани, но и субхондральной кости с происходящими в ней нарушениями процессов синтеза и резорбции (Камилов Ф.Х. и др., 2014; et al., 2013). Особое внимание уделяется созреванию, дифференцировке, взаимному влиянию остеокластов и остеобластов (Trouvin A.P. et al., 2010; Sagalovsky S. et al., 2011); а также такому биологическому процессу, как апоптоз клеточных элементов хрящевой и костной ткани и его роли в развитии и прогрессировании остеоартроза (Sun Y. et al., 2002; Дубиков А.И., 2008). Отмечено, что происходит изменение равновесия между экспрессией белков р53 и bcl-2 при различных патологических процессах в суставах в зависимости от стадии заболевания et al., 2003). Оценка пролиферативной активности остеобластов путем выявления белка Ki-67 в их ядрах позволяет также судить о процессах ремоделирования костной ткани. Однако имеющиеся в литературе данные достаточно неоднородны. Исследователи указывают, что количество Ki-67 позитивных остеобластов в неизмененной костной ткани составляет от 5% до 20% et al., 2007).
Нарушение микроциркуляции в субхондральных отделах костной ткани при остеоартрозе неизбежно приводит к развитию гипоксии и нарушению остеогенеза
(Conaghan P.G. et al., 2005). При этом компенсаторные механизмы реализуются по средствам синтеза VEGF клетками костной ткани et al., 2009).
Таким образом, несмотря на достаточно большое количество исследовательских
работ, посвященных изучению особенностям процессов костного ремоделирования,
многие аспекты данной проблемы остаются нерешенными. Так, в доступной литературе
отсутствуют обобщенные данные гистологических, морфометрических и
иммуногистохимических характеристик ткани головки бедренной кости при коксартрозе с учетом его этиологической формы.
Степень разработанности темы исследования
На данный момент отечественные и зарубежные научные исследования сводится к описанию изменений в синовиальной оболочке, связочном аппарате сустава и хрящевой ткани при коксартрозе без учета его этиологии и не затрагивают изменений, происходящих в субхондральной кости. Остаются нерешенными проблемы, касающиеся изучения морфологических и иммуногистохимических особенностей субхондральной костной ткани головки бедра при коксартрозе различной этиологии. Описанные механизмы ремоделирования костной ткани и взаимное влияние остеобластов и остеокластов делают возможным и необходимым рассмотрение данной проблемы методом иммуногистохимии. Взгляды ученых на роль пролиферативной активности и апоптоз клеток костной ткани при остеоартрозе достаточно противоречивы et al., 2007 et al., 2015). Неоднозначен взгляд на определение роли гипоксии и компенсаторно-приспособительных механизмов к ней при коксартрозе (Новочадов В.В. и др., 2014; et al., 2010; et al., 2010).
Таким образом, цель работы, заключающаяся в изучении патоморфологических и иммуногистохимических особенностей ткани головки бедра при диспластическом, постишемическом и посттравматическом коксартрозе, можно считать оправданной. Актуальность данного исследования подтверждается и набирающими популярность малоинвазивными оперативными методами лечения больных коксартрозом.
Цель исследования - Изучить патоморфологические и иммуногистохимические особенности ткани головки бедра при диспластическом, постишемическом и посттравматическом коксартрозе.
Задачи исследования:
-
Изучить морфометрические особенности и выраженность фиброза суставной поверхности и субхондральной костной ткани головки бедра с учетом этиологической формы коксартроза.
-
Оценить реакцию клеток костной ткани головки бедра на гипоксию с учетом этиологической формы коксартроза.
-
Изучить резорбтивную активность остеокластов костной ткани головки бедра с учетом этиологической формы коксартроза.
-
Охарактеризовать экспрессию маркеров апоптоза (p53, bcl-2) и пролиферации (Ki-67) клетками костной ткани головки бедра с учетом этиологической формы коксартроза.
-
Провести корреляционный анализ резорбтивной активности остеокластов, экспрессии VEGF, маркеров апоптоза и пролиферации клетками костной ткани головки бедра при коксартрозе различной этиологии.
Научная новизна. Впервые описаны морфологические изменения ткани головки бедра, характерные для диспластического, постишемического и посттравматического коксартроза. Установлено, что фиброзные изменения суставной поверхности имеют максимальное проявление при посттравматическом коксартрозе, а при диспластическом значительно преобладает фиброз костной ткани субхондральных отделов головки бедра. Характерной особенностью постишемического коксартроза являются минимальные
фиброзные изменения суставной поверхности и ее максимальная толщина. Максимальный размер костных балок определяется при диспластическом коксартрозе, а при коксартрозе постишемической и посттравматической этиологий данный показатель имеет минимальное значение. Причем при посттравматическом коксартрозе костные трабекулы в субхондральном отделе головки расположены плотнее друг к другу, чем при постишемической этиологии данного патологического процесса.
Впервые с учетом этиологической формы описан такой компенсаторно-
приспособительный механизм к гипоксии, развивающейся в головке бедра при
коксартрозе, как экспрессия VEGF клетками костной ткани. Показано, что при
диспластическом коксартрозе данный механизм реализуется преимущественно
остеобластами, а при постишемическом – остеокластами. При коксартрозе посттравматической этиологии остеокласты и остеобласты в равной степени участвуют в реализации данного механизма. При всех трех исследованных этиологических формах коксартроза наименьший вклад в реализацию компенсаторно-приспособительного механизма к гипоксии вносят остеоциты. Проведенная оценка площади сосудов микроциркуляторного русла костной ткани головки бедра показала, что при постишемическом коксартрозе сосуды значительно крупнее, чем при коксартрозе посттравматической и диспластической этиологии.
Впервые путем определения уровня экспрессии TRAcP остеокластами и подсчета их количества установлено, что наиболее интенсивно процессы резорбции протекают в костной ткани головки бедра при постишемическом коксартрозе. Различия в резорбции при коксартрозе посттравматической и диспластической этиологии заключаются в меньшем количестве остеокластов в последнем.
Впервые дана детальная характеристика пролиферативной активности и апоптозу клеток костной ткани головки бедра при коксартрозе различной этиологии. Отмечено статистически достоверное различие в пролиферативной активности остеобластов при посттравматическом, постишемическом и диспластическом коксартрозе. Установлено, что экспрессия белка bcl-2 осуществляется как остеобластами, так и остеоцитами. Характер данной экспрессии имеет свои особенности при отдельных этиологических формах коксартроза. Экспрессия белка р53 осуществляется исключительно остеоцитами в крайне незначительном количестве и не имеет статистически достоверных различий при отдельных этиологических формах коксартроза.
Впервые проведенный корреляционный анализ показателей экспрессии маркеров
пролиферации и апоптоза клетками костной ткани головки бедра указал на характерные
особенности коксартроза различной этиологии. При диспластическом коксартрозе
отмечена обратная взаимосвязь между экспрессией белков р53 и bcl-2 остеоцитами и
прямая корреляция между экспрессией белка bcl-2 остеоцитами и остеобластами. Схожая
картина отмечается между экспрессией белка bcl-2 остеоцитами и остеобластами в
костной ткани головки бедра при посттравматическом коксартрозе. При
постишемическом коксартрозе уровень пролиферативной активности остеобластов напрямую коррелирует с уровнем экспрессии белков bcl-2 и р53 остеоцитами, а также с bcl-2 остеобластами.
Теоретическая и практическая значимость. Новые знания, полученные в результате проведенной исследовательской работы, расширяют представление о патогенезе и особенностях клеток костной ткани головки бедра при коксартрозе различной этиологии (диспластический, постишемический и посттравматический). Результаты работы могут служить основой для дальнейшего исследования взаимосвязи патоморфологических и иммуногистохимических характеристик клеток костной ткани при других патологических процессах опорно-двигательной системы человека.
Комплексная оценка гистопатологических, морфометрических и
иммуногистохимических показателей костной ткани головки бедра при коксартрозе может быть использована для уточнения этиологии данного патологического процесса.
Установленные особенности костной ткани головки бедра способны помочь в поиске более целенаправленного и эффективного лечения, позволяют провести оценку качества консервативной терапии и хирургического лечения как в практическом здравоохранении, так и в экспериментальных исследованиях.
Методология и методы исследования. Комплекс принципов и подходов
исследования основан на изучении научной литературы по теме выполненной работы,
применении современных методов гистопатологического, морфометрического,
иммуногистохимического анализа и статистической обработке полученных данных.
Объект исследования – головка бедренной кости, удаленная в процессе
эндопротезирования у больных с коксартрозом III-IV стадий. Предмет исследования – патоморфологические и иммуногистохимические изменения в ткани головки бедра при коксартрозе различной этиологии.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Диспластический коксартроз характеризуется выраженным фиброзом костной ткани головки бедра и максимальным размером костных балок; постишемический – максимальной толщиной суставной поверхности и выраженным истончение костных балок; посттравматический – фиброзом суставной поверхности.
-
Компенсаторный механизм к гипоксии в костной ткани головки бедра при диспластическом коксартрозе реализуется преимущественно остеобластами, при постишемическом – остеокластами, при посттравматическом – остеобластами и остеокластами в равной степени.
-
Максимальная резорбтивная активность остеокластов и их количество характерны для костной ткани головки бедра при постишемическом коксартрозе; при диспластическом коксартрозе отмечено минимальное количество остеокластов.
-
Максимальная пролиферативная активность остеобластов костной ткани головки бедра определяется при диспластическом коксартрозе, минимальная – при посттравматическом; экспрессия bcl-2 остеобластами максимальна при постишемическом коксартрозе, минимальна – при диспластическом; экспрессия bcl-2 остеоцитами максимальна при диспластическом коксартрозе, минимальна – при посттравматическом; экспрессия р53 регистрируется только в остеоцитах и не имеет статистически достоверных различий в зависимости от этиологии коксартроза.
-
При описанных формах коксартроза отмечается корреляция экспрессии bcl-2 остеоцитами и остеобластами; при диспластическом коксартрозе белки р53 и bcl-2 остеоцитов имеют обратную корреляцию; уровень пролиферативной активности остеобластов при постишемическом коксартрозе прямо коррелирует с уровнями экспрессии белков р53 и bcl-2 остеоцитов и с белком bcl-2 остеобластов.
Степень достоверности результатов диссертации. Использованные современные
методы морфологического, морфометрического и иммуногистохимического
исследований, а также статистическая обработка полученных данных соответствуют
поставленным цели и задачам и позволяют получить достоверные результаты.
Диссертация выполнена на достаточном по объему материале (95 объектов исследования).
Все этапы исследования проведены на сертифицированном оборудовании.
Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований и не носят характера умозрительных заключений, а вытекают из результатов выполненной работы.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на ежегодной
Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Многопрофильная больница: интеграция специальностей» (Ленинск-Кузнецкий, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: междисциплинарные аспекты медицины» (Ленинск-Кузнецкий, 2015).
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.
Работа представляет собой самостоятельное научное исследование, проведенное на высоком методическом уровне. Все исследования, обзор литературы, анализ и интерпретация морфологических данных, статистическая обработка результатов выполнены лично автором.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 8 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования результатов диссертаций.
Получен патент на изобретение: Устройство для фиксации головки бедренной кости в процессе ее распила для подготовки биологического материала к гистологическому исследованию : патент № 2593158 Рос. Федерация : МПК51 А61 В 17/00 / Д.А. Давыдов, И.М. Устьянцева; заявитель и патентообладатель ФГБ ЛПУ «Научно-клинический центр охраны здоровья шахтеров». - № 2015115221/05; заявл. 22.04.2015; опубл. 27.07.2016, Бюл. № 21.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 23 рисунками, 22 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и условных обозначений и списка литературы, включающего 37 отечественных и 143 зарубежных источников.
Механизмы взаимодействия остеобластов и остеокластов в процессе ремоделирования костной ткани
Причины развития посттравматического остеоартроза тазобедренного сустава – одномоментная травма или хроническая микротравматизация, вызывающие повреждение связочного аппарата сустава, хрящевой ткани, субхондральной пластинки и губчатой кости.
Асептический некроз головки бедренной кости – патологический процесс, являющийся результатом нарушения кровотока в зоне эпифиза, с дальнейшим некрозом элементов как костного мозга, так и костной ткани головки бедра, что в конечном итоге (IV стадия заболевания) приводит к развитию вторичного остеоартроза тазобедренного сустава (Шушарин А.Г. и др., 2012 Tripathy S.K. et al., 2015).
Попытки дать гистопатологическую характеристику ткани головки бедренной кости при остеоартрозе предпринимаются на протяжении нескольких десятилетий. Так, для характеристики патологических изменений хряща при остеоартрозе в 1971 году Mankin H. J. и соавторы разработали специальную балльную шкалу (Mankin H.J. et al., 1971). Балльная оценка отражает несколько позиций: потерю структурной организации хрящевой ткани (от 0 до 6 баллов), нарушение клеточных характеристик (от 0 до 3 баллов), потерю окрашивания сафранином-О (от 0 до 4 баллов) и нарушение целостности гиалинового хряща (0 баллов – целостность сохранена, 1 балл – целостность нарушена).
Международным обществом по изучению остеоартроза (OARSI) была предложена новая, более современная система оценка гистопатологических изменений суставного гиалинового хряща. Авторами данной системы выделяются 6 стадий изменений (Hawellek T. et al., 2016). Патологические изменения в хрящевой ткани начинаются с поверхностной зоны, постепенно распространяясь на более глубокие отделы, вплоть до полного стирания суставного хряща. За 0 стадию предложено принимать интактное состояние суставного хряща. При I стадии целостность суставной поверхности хряща остается ненарушенной, однако наблюдается исчезновение бесклеточной пластинки. В хондроцитах одновременно наблюдаются признаки апоптоза, гипертрофии и пролиферации. Во II стадии присоединяются такие изменения, как неглубокие трещины и горизонтальное разволокнение в пределах поверхностной зоны хряща. В III стадии вертикальные трещины захватывают и центральную зону. Хондроциты располагаются хаотично, образуя очаговые скопления. При IV стадии патологического процесса хрящевая ткань имеет микроворсинки, которые периодически отшнуровываются в полость сустава. На V стадии в патологический процесс вовлекается субхондральная кость, что характеризуется хаотичным расположением костных балок с нечеткими контурами и фиброзом межбалочного пространства. VI стадия – это деформация суставных поверхностей различной степени выраженности. Обнаженная субхондральная кость резко утолщена, с признаками дегенеративных изменений в виде склероза и фиброза.
Классификация OARSI, по сравнению с классификацией Mankin H. J., более информативна и универсальна так как затрагивает не только изменения, происходящие в гиалиновом хряще суставной поверхности, но и в субхондральной костной ткани. Однако, как можно наблюдать, данные классификации не указывают на характерные особенности костной ткани головки бедра при остеоартрозе тазобедренного сустава с учетом его этиологии.
Для коксартроза описан ряд общих гистопатологических признаков, свидетельствующих о выраженных дегенеративно-дистрофических изменениях суставного хряща. Это проявляется в истончении, разволокнении и фрагментации хрящевых структур. Изогенные группы хондроцитов теряют свою вертикальную гистоархитектонику, а сами клетки подвергаются вакуолизации и лизису (Guo W.S. et al., 2008). Интертерриториальное пространство хрящевой ткани теряет базофилию, приобретает оксифильную окраску. Большинство хондроцитов подвергаются деструктивным изменениям. В местах локально истонченного и разрушенного суставного хряща разрастается рыхлая волокнистая соединительная ткань. В просвете микрососудов отмечаются признаки сладжирования форменных элементов крови, микротромбозы, а также повреждение эндотелиоцитов (Takeda M. et al., 2008).
В краевых отделах головки бедра дегенеративные измененные хряща сочетаются с проявлениями неоостеогенеза, что приводит к формированию остеофитов. Происходит уплощение головки бедренной кости. Участки реактивного остеогенеза на месте деструктивно измененного суставного хряща также подвергаются деструкции. В отдельных участках сохраняются структуры новообразованной пластинчатой костной ткани, чередующиеся с небольшими остаточными очагами гиалиновой хрящевой ткани с признаками кальцификации (Аверьянов А.А. и др., 2012).
Кроме общих гистологических признаков были установлены и некоторые специфичные морфологические особенности строения головки бедра в зависимости от этиологии остеоартроза. Так, при посттравматической этиологии остеоартроза отмечена мозаичная структура суставного хряща головки бедра (участки неизмененной гиалиновой хрящевой ткани чередуются с зонами выраженных деструктивных изменений). В участках деструкции суставного хряща выявлены клеточная диссоциация изогенных групп хондроцитов с признаками кариопикноза, кариорексиса, плазморексиса. В местах разрушения хрящевой пластинки обнаруживается плотная оформленная волокнистая соединительная ткань (Гольдберг О.А. и др., 2012).
Методы исследования
Для решения поставленных задач в исследование было включено 95 пациентов, поступавших в отделение травматологии и ортопедии ГАУЗ КО ОКЦОЗШ для эндопротезирования тазобедренного сустава за период с 2013 г по 2015 г с клинически выставленным диагнозом – коксартроз III-IV стадии. Объектом морфологического исследования служили 95 головок бедренных костей, удаленных при эндопротезировании тазобедренного сустава у этих пациентов. Головки доставлялись из операционной в гистологическую лабораторию патологоанатомического отделения ГАУЗ КО ОКЦОЗШ. Возрастно-половой состав больных и этиологическая форма остеоартроза тазобедренного сустава представлены в таблице 1.
Медиана возраста больных остеоартрозом тазобедренного сустава составила 56 (49-64) лет. Минимальный возраст составил 27 лет, возраст самого старшего пациента 77 лет. Возраст больных в группе диспластического остеоартроза составил 61 (52-67) год. В случаях коксартроза постишемической и посттравматической этиологии средние значения возраста больных составили 53,3±12,1 года и 54±8,9 года соответственно.
Распределение по полу было следующим 51 (53,7%) мужчина и 44 (46,3%) женщины. По этиологическим формам остеоартроз тазобедренного сустава был распределен примерно равномерно: диспластический – 34 случая, постишемический – 31 случай и посттравматический – 30 случаев.
В исследование включали только случаи коксартроза диспластической, постишемической и посттравматической этиологий. Параметры включения материала в исследование – плановое оперативное вмешательство проживание пациентов на территории Кемеровской области диапазон индекса массы тела от 18,5 до 30 доставка материала из операционной в патологоанатомическое отделение в течение 1 часа после удаления. Параметры исключения материала из исследования – системные заболевания соединительной ткани (системная красная волчанка, ревматоидный артрит) воспалительные заболевания сустава инфекционной патологии заболевания, патогенез или методы лечения которых могут повлиять на процессы ремоделирования костной ткани (сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, туберкулез, ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, онкологические заболевания) остеопороз профессиональные спортсмены наличие остеоартроза у ближайших родственников. Распределение материала в ту или иную группу исследования проводилось по результатам оценки таких клинических данных, как анамнез и данных дополнительных методов исследования (магнитно-резонансная томография и рентгенография тазобедренных суставов).
Для достижения цели и решения поставленных задач применялись такие методы исследования, как гистологический, морфометрический (компьютерный анализ микроскопических фотоснимков), иммуногистохимический и статистическая обработка полученных данных. Гистологический метод Из операционной материал доставлялся в патологоанатомическое отделение в забуференном 10% нейтральном растворе формалина. В лаборатории проводилось макроскопическое описание препарата и забор фрагментов ткани для микроскопического исследования. Из доставленного материала по описанной в литературе методике (Dimenstein I.B., 2008 Buesa R.J., 2010), с применением специального устройства (Давыдов Д.А., Устьянцева И.М. Устройство для фиксации головки бедренной кости в процессе ее распила для подготовки биологического материала к гистологическому исследованию : патент № 2593158 / № 2015115221/05 заявл. 22.04.2015 опубл. 27.07.2016, Бюл. № 21.) в вертикальном направлении из наиболее нагружаемого участка головки выпиливался фрагмент суставной поверхности и субхондральной костной ткани объемом 0,75 см3 (размерами 1,5х1,0х0,5 см). С целью сохранения антигенной структуры клеток костной ткани и возможности в дальнейшем выполнить иммуногистохимическое исследование фиксацию и декальцинацию выпиленных фрагментов проводили в растворе ЭДТА (Lu Y. et al., 2014) (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) согласно инструкции производителя. После декальцинации проводилась гистологическая проводка материала с дальнейшим заключением его в парафин. Серийные гистологические срезы толщиной 3-5 мкм готовили на ротационном микротоме (Accu-Cut SRM 200, Китай) с последующей окраской гематоксилин-эозином и гематоксилин-пикрофуксином. Исследование проводилось на световом микроскопе (Nicon Ci 34 S, Китай объективы 4, 10, 40, 100 окуляры 10) с использованием цифровой фотокамеры (Nicon DS-Fi2, Япония). Морфометрический метод При помощи специализированного программного обеспечения (NIS-Elements BR 4.30.00) проводились морфометрические измерения интересующих нас параметров строения костной и хрящевой ткани (толщина суставной поверхности и костных балок, площадь костных балок, выраженность фиброза в ткани суставной поверхности и в губчатом веществе костной ткани). Такой показатель, как площадь костных балок, измерялся в "мкм2", статистический анализ проводился в этих же единицах. Для большей презентабельности результатов измерения значение площади в "мкм2" делилось на 1000000 и данные представлялись в "мм2". Преобразование единиц измерения на результатах статистической обработки данных не отразилось. Оценку выраженности фиброза проводили путем определения площади фиброзной ткани в 5 случайных полях зрения на срезах, окрашенных гематоксилин-пикрофуксином, при увеличении микроскопа х100 раз (Авдалян А.М. и др., 2010). При площади фиброза до 25% присваивали "1" балл, от 25% до 49% - "2" балла, от 50% до 74% - "3" балла, 75% и более - "4" балла (т.е. непрерывные данные были разбиты точками деления на порядковые категории).
Иммуногистохимический метод
Для постановки иммуногистохимической реакции использовались высокоадгезивные стекла с положительно заряженной поверхностью (Super Frost Plus). Срезы, установленные на стекла, высушивались в течение 12 часов при температуре 37C на термостолике. Все этапы постановки иммуногистохимических реакций проводились в автоматическом режиме на иммуногистостейнере Bench Mark XT (Ventana) с соблюдением протокола исследования к каждому антителу. Для визуализации использовалась универсальная система ultraVIEW Universal DAB (Ventana) - комплекс с вторичными антителами и хромоген DAB. Докрашивание проводили Hematoxylin II (Ventana). После проведения реакции срезы подвергали дегидратации и помещали под покровное стекла. Набор первичных антител (RTU), используемых в исследовательской работе, представлен в таблице 2.
Морфометрические особенности ткани головки бедра при коксартрозе
При остеоартрозе тазобедренного сустава диспластической этиологии среднее значение уровня экспрессии VEGF остеобластами составило 0,65±0,06 у.е., при посттравматической этиологии коксартроза среднее значение уровня экспрессии данного маркера – 0,59±0,12 у.е. В группе коксартроза постишемической этиологии медиана значения уровня экспрессии VEGF остеобластами равна 0,64 (0,5-0,68) у.е.
Медиана уровня экспрессии VEGF остеокластами при остеоартрозе тазобедренного сустава диспластической этиологии составила 0,48 (0,38-0,53) у.е., при постишемическом остеоартрозе – 0,92 (0,63-0,95) у.е. Среднее значение уровня экспрессии VEGF остеокластами в группе остеоартроза тазобедренного сустава посттравматической этиологии равно 0,54±0,16 у.е.
Проведенный статистический анализ уровня экспрессии VEGF остеобластами, остеоцитами и остеокластами субхондральной костной ткани головки бедра при различных этиологических формах остеоартроза тазобедренного сустава показал следующие результаты.
Максимальная экспрессия VEGF остеобластами определяется при диспластическом коксартрозе (р=0,035 по сравнению с постишемическим р=0,017, df=62 по сравнению с посттравматическим остеоартрозом). Статистически достоверных различий в уровне экспрессии VEGF остеобластами при коксартрозе постишемической и посттравматической этиологии получено не было (р=0,734).
Экспрессия VEGF остеокластами при остеоартрозе тазобедренного сустава постишемической этиологии превышает в 1,92 раза аналогичный показатель по сравнению с диспластическим (р 0,0001) и превышает в 1,7 раза по сравнению с посттравматическим коксартрозом (р=0,000007). Так же определяются статистически достоверные различия в уровне экспрессия VEGF остеокластами при диспластическом и посттравматическом коксартрозе. При посттравматическом коксартрозе уровень экспрессии VEGF остеокластами в 1,13 раза выше, чем в группе диспластического коксартроза (р=0,0068). Максимальная экспрессия VEGF остеоцитами определяется при остеоартрозе тазобедренного сустава диспластической этиологии и составляет в 1,14 раза больше по сравнению с постишемическим (р 0,0001) и в 1,21 раза больше по сравнению с посттравматическим коксартрозом (р 0,0001). Статистически достоверных различий в уровне экспрессии VEGF остеоцитами при постишемическом и посттравматическом коксартрозе не определяется (р=0,55).
Кроме того, выявлены характерные особенности экспрессии VEGF клетками костной ткани внутри выделенных этиологических групп остеоартроза тазобедренного сустава. Так, в группе диспластического коксартроза уровень экспрессии VEGF остеобластами в 1,4 раза выше, чем остеокластами (р 0,0001) и в 1,6 раз выше, чем остеоцитами (р 0,0001 df=66). Также отмечено статистически достоверное различие в экспрессии данного белка остеоцитами и остеокластами (р=0,00006).
В группе коксартроза постишемической этиологии уровень экспрессии VEGF остеокластами в 1,4 раза выше, чем остеобластами (р=0,00006) и в 2,6 раза выше, чем остеоцитами (р 0,0001). Также определяется статистически достоверное различие в экспрессии данного белка остеоцитами и остеокластами (р 0,0001).
В группе коксартроза посттравматической этиологии уровень экспрессии VEGF остеоцитами в 1,7 раза ниже, чем остеобластами (р 0,0001) и в 1,6 раза ниже, чем остеокластами (р 0,0001). Статистически достоверных различий в экспрессии данного белка остеобластами и остеокластами получено не было (р=0,176 df=55).
Таким образом, установлено, что при остеоартрозе тазобедренного сустава постишемической этиологии компенсаторно-приспособительный механизм к гипоксии реализуется преимущественно за счет остеокластов, а при диспластическом коксартрозе за счет остеобластов. В равной степени неоваскулогенез при остеоартрозе тазобедренного сустава посттравматического генеза контролируется как остеобластами, так и остеокластами. При всех описанных нозологических формах остеоартроза тазобедренного сустава отмечаются минимальные значения экспрессии VEGF остеоцитами.
Для оценки неоваскулогенеза в ответ на экспрессию VEGF остеобластами и остеокластами субхондральной костной ткани головки бедра при различных этиологических формах остеоартроза тазобедренного сустава необходимо провести измерение площади сосудов микроциркуляторного русла. Для объективной визуализации кровеносных сосудов микроциркуляторного русла использована иммуногистохимическая реакция с антителом анти-CD34. Характерное окрашивание эндотелия позволяет идентифицировать кровеносные сосуды и четко отдифференцировать их от окружающих тканевых компонентов (рисунок 18).
Сосуды микроциркуляторного русла (CD34+ окрашенный эндотелий) костной ткани головки бедра при постишемическом коксартрозе. Ув.100. Выполненное морфометрическое исследование площади сосудов микроциркуляторного русла субхондральных отделов костной ткани головки бедра при остеоартрозе тазобедренного сустава показало следующие результаты.
Медиана площади кровеносных сосудов микроциркуляторного русла в субхондральном отделе костной ткани головки бедра в группе диспластического коксартроза составила 2514 (1397-2809) мкм2, в группе постишемического 2759 (2310-6572) мкм2. При коксартрозе посттравматической этиологии медиана площади кровеносных сосудов микроциркуляторного русла в субхондральном отделе костной ткани головки бедра составила 1539,5 (1104-4242) мкм2.
Сводные данные площади кровеносных сосудов микроциркуляторного русла в костной ткани головки бедра с учетом этиологической формы коксартроза представлены в таблице 7.
Проведенный статистический анализ площади сосудов микроциркуляторного русла в субхондральной костной ткани головки бедра при различных этиологических формах коксартроза показал следующие результаты. Максимальная площадь сосудов микроциркуляторного русла регистрировалась в субхондральном отделе костной ткани головки бедра в группе коксартроза постишемической этиологии и составила в 1,8 раза больше по сравнению с аналогичными показателями при посттравматическом коксартрозе (р=0,001) и в 1,1 раза больше по сравнению с коксартрозом диспластической этиологии (р=0,006). Статистически достоверных различий в размерах сосудов микроциркуляторного русла субхондральных отделов костной ткани в группе диспластического и посттравматического коксартроза не определялось (р=0,84).
Таким образом, в костной ткани головки бедра при остеоартрозе тазобедренного сустава постишемической этиологии регистрируются наиболее крупные сосуды микроциркуляторного русла, что указывает на более активное протекание процессов неоваскулогенеза.
Особенности экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67
Биологические, морфологические и клинические проявлениями различных этиологических форм коксартроза имеют много общего. На поздних стадиях данного заболевания эндопротезирование является наиболее распространенным методом лечения. Однако повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов, перенесших эндопротезирование, различные послеоперационные инфекционные осложнения, перепотезные переломы на данном участке кости, ограниченный срок службы самого протеза заставляют искать альтернативные пути лечения больных остеоартрозом. Направленность такого поиска сосредоточена главным образом на регулировании биологических процессов, участвующих в развитии и прогрессировании остеоартроза.
В литературе имеется большой объем данных гистологического исследования суставной поверхности и костной ткани головки бедра при остеоартрозе, разработаны различные классификации стадийности данного патологического процесса. В последние годы внимание исследователей привлекают механизмы ремоделирования костной ткани и регуляция этих процессов. Большое значение в патогенезе остеоартроза уделяется гипоксии и механизму неоваскулогенеза, реализующемуся по средствам синтеза VEGF клетками костной ткани. Доказано, что низкая экспрессия VEGF в клетках костной ткани при остеоартрозе ведет к ускорению дифференцировки и созреванию остеокластов и ускорению резорбтивных процессов.
В настоящее время особое внимание исследователей привлекает жизненный цикл клеток костной ткани и его влияние на прогрессирование остеоартроза. В условиях выраженной гипоксии при асептическом некрозе головки бедренной кости отмечается повышение экспрессии белка р53 в остеобластах. Кроме того, под действием высоких доз стероидных гормонов аналогичная картина отмечается и в остеоцитах. Исследование процессов ремоделирования костной ткани сопровождается изучением пролиферативной активности ее клеточных компонентов. В различных исследовательских работах указано, что Ki-67 позитивные остеобласты составляют примерно от 4% до 5% пула всех остеобластов, а Ki-67 позитивные остеоциты не определяется вовсе.
В настоящей работе проведено исследование 95 головок бедренных костей, удаленных при эндопротезировании тазобедренного сустава у пациентов с коксартрозом III-IV стадии. Применялись такие современные методы исследования, как гистологический, морфометрический (компьютерный анализ микроскопических фотоснимков), иммуногистохимический и статистическая обработка полученных данных. Проведенный морфометрический и иммуногистохимический анализ ткани головки бедра позволил выявить ряд особенностей, характерных для остеоартроза тазобедренного сустава диспластической, постишемической и посттравматической этиологии.
Для головки бедренной кости при диспластическом остеоартрозе тазобедренного сустава наиболее характерны выраженные фиброзные изменения костной ткани субхондральных отделов и минимальная толщина суставной поверхности. Площадь костных балок и их толщина при данной нозологической форме остеоартроза имеют максимальные значения. При диспластическом остеоартрозе отмечаются максимальные показатели экспрессии VEGF остеобластами и минимальные остеокластами, регистрируется минимальная численность остеокластов. Пролиферативная активность остеобластов и уровень экспрессии белка bcl-2 (ингибитора апоптоза) в остеоцитах имеют максимальную экспрессию.
Минимальные фиброзные изменения суставной поверхности и костной ткани субхондральных отделов головки бедра специфичны для остеоартроза тазобедренного сустава постишемической этиологии. Толщина суставной поверхности головки бедра имеет максимальные показатели, а толщина костных балок и их площадь минимальны. Постишемический остеоартроз характеризуется максимальной экспрессией VEGF остеокластами и минимальной остеобластами. Площадь сосудов микроциркуляторного русла при этом имеет максимальное значение. Также отмечается максимальное количество остеокластов и экспрессии ими TRAcP. Максимальный уровень экспрессии белка bcl-2 характерен для остеобластов.
Головка бедра при остеоартрозе тазобедренного сустава посттравматической этиологии характеризуется максимально выраженными фиброзными изменениями суставной поверхности. Показатель площади костных балок субхондральных отделов головки бедра при данной нозологической форме остеоартроза тазобедренного сустава занимает промежуточное значение между двумя вышеописанными этиологическими формами коксартроза. Для посттравматического остеоартроза тазобедренного сустава характерны минимальные значения экспрессии VEGF остеобластами и их пролиферативная активность. Уровень экспрессии VEGF остеокластами находится на среднем уровне между аналогичными показателями при диспластическом и постишемическом коксартрозе.
Выполненный корреляционный анализ изучаемых характеристик ткани головки бедра при диспластическом, постишемическом и посттравматическом остеоартрозе тазобедренного сустава позволил выявить ряд особенностей. Во всех случаях отмечается отрицательное влияние гипоксии на процессы остеогенеза в ткани головки бедра за счет стимуляции резорбтивной активности остеокластов.
Если при диспластическом коксартрозе площадь сосудов имеет прямую корреляцию высокой тесноты с уровнем экспрессии VEGF остеобластов, а при посттравматическом коксартрозе данная взаимосвязь становится умеренной тесноты, то при остеоартрозе тазобедренного сустава постишемической этиологии корреляция между этими двумя показателями отсутствует совсем.
Взаимосвязь маркеров апоптоза и пролиферации клеток костной ткани достаточно характерна для каждой этиологической формы остеоартроза. При посттравматическом коксартрозе клеточный состав костной ткани поддерживается преимущественно за счет повышения уровня экспрессии антиапоптического белка bcl-2 в остеоцитах и остеобластах. Для остеоартроза тазобедренного сустава диспластической этиологии повышение данного белка в остеоцитах и остеобластах сопровождается снижением уровня экспрессии белка активатора апоптоза р53 в остеоцитах. При постишемическом коксартрозе к вышеописанным корреляциям добавляется повышение пролиферативной активности остеобластов совместно с уровнем экспрессии антиапоптического белка bcl-2 в остеоцитах и остеобластах.