Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Дисплазия соединительной ткани 13
1.2 Актуальность дисплазии соединительной ткани в акушерстве 19
1.3 Варикозное расширение вен как проявление дисплазии соединительной ткани 21
1.4 Пролапс органов таза 24
1.5 Ремоделирование стромы миометрия (возрастное и при беременности) 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1 Характеристика исследуемого материала 39
2.2 Морфологическое исследование 50
2.2.1 Гистологическое и гистохимическое исследование 50
2.2.2 Иммуногистохимическое исследование и морфометрия 50
2.2.3 Электронная микроскопия и электронная иммуноцитохимия 54
2.3 Статистическая обработка данных 56
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 57
3.1 Морфологическое исследование стромы тела матки у женщин без ДСТ и гинекологической патологии во время родов, репродуктивном и постменопаузальном возрасте (подгруппы 16, Пб, Шб) 57
3.2 Морфологическое исследование вен миометрия у женщин репродуктивного и постменопаузального возраста без патологии матки (подгруппы Пб и Шб) 68
3.3 Сравнительное морфологическое исследование стромы нижнего сегмента матки при дисплазии соединительной ткани 70
3.4 Сравнительное морфологическое исследование вен миометрия тела матки у женщин репродуктивного возраста с варикозным расширением вен матки 81
3.5 Сравнительное морфологическое исследование стромы миометрия тела матки при пролапсе органов таза 90
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 103
Выводы 112
Практические рекомендации 113
Список использованной литературы
- Актуальность дисплазии соединительной ткани в акушерстве
- Варикозное расширение вен как проявление дисплазии соединительной ткани
- Иммуногистохимическое исследование и морфометрия
- Сравнительное морфологическое исследование стромы нижнего сегмента матки при дисплазии соединительной ткани
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Наследственные нарушения соединительной ткани - гетерогенная группа заболеваний, обусловленных мутациями генов белков внеклеточного матрикса или ферментов их биосинтеза, а также генов белков, участвующих в её морфогенезе (Российские рекомендации, 2012г). Термин «дисплазия соединительной ткани» (ДСТ) может быть использован как синоним наследственных нарушений. Частота встречаемости ДСТ составляет 30-80% в популяции (Кадурина Т.И. с соавт., 2012). В последние годы интерес к заболеванию неуклонно растет, т.к. качественные и количественные изменения компонентов стромы отражаются на функции многих органов и систем (Земцовский Э.В., 2000). В литературе спектр висцеральных поражений при ДСТ освещен достаточно хорошо, однако нет четкого представления о поражении матки у женщин с данной патологией. Генерализованный характер поражения с вовлечением в патологический процесс репродуктивной системы при ДСТ отрицательно сказывается на течении беременности, родов и послеродового периода (Lind J. et al., 2002). К наиболее частым осложнениям беременности и родов относятся преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, слабость родовой деятельности, гипотонические кровотечения в послеродовом периоде (Pyeritz R. et al., 1980; Rahman J. et al., 2003). Заслуживают серьезного внимания вопросы прогноза течения беременности, возможных осложнений во время родов и их профилактики.
В современной практике врача-гинеколога у женщин различного возраста достаточно часто встречается варикозное расширение вен матки и опущение внутренних половых органов. По разным литературным источникам частота встречаемости варикозного расширения вен матки и малого таза колеблется от 5,4 до 80% в популяции (Стрижаков А.Н. с соавт., 1997). Большой разброс связан с тем, что в начальных стадиях заболевание никак себя не проявляет и нередко является случайной находкой. Согласно современным представлениям, варикозное расширение вен относится к группе наследственных заболеваний соединительной ткани (Российские рекомендации, 2012). При этом четких патоморфологических изменений интраорганных вен матки при ДСТ практически не представлено.
Нередко заболевание может сопровождаться развитием пролапса органов таза (Смольнова Т.Ю. с соавт., 2003; Kerkhof МН. et al., 2009). При этом особое значение придается нарушению коллагенового каркаса. В современных исследованиях большое внимание уделяется изменениям соединительной ткани стенок влагалища, связочного аппарата и шейки матки (Zhou L. et al., 2012, Han L. et al., 2014; Yucel N. et al, 2013). Однако остается невыясненным вопрос вовлечения в процесс стромы тела матки.
Степень разработанности темы исследования
В отечественной и зарубежной литературе насчитывается большое количество работ, посвященных изучению ДСТ в различных органах и
системах организма (Земцовский Э.В., 2010; Кадурина Т.Н. с соавт., 2009; Митрофанова Л.Б., 2007; Нечаева Г.И. с соавт., 2007). Несмотря на широкий спектр висцеральных проявлений данной патологии, практически нет работ о поражении матки. Вместе с тем, большое число клинических исследований описывают у женщин с данной патологией слабость родовой деятельности, варикозное расширение вен матки, пролапс органов таза (Клеменов А.В. с соавт., 2005; Шарова Л.Е. с соавт., 2004; Смольнова Т.Ю. с соавт., 2003; Kerkhof М.Н. et al, 2009; Rahman J. et al, 2003). При этом морфологически значимые вопросы требуют уточнения и научного обоснования. Наиболее важными из них являются:
- изучение миометрия при слабости родовой деятельности у рожениц,
страдающих ДСТ;
исследование миометрия у женщин с варикозным расширением вен матки;
изучение миометрия у женщин с пролапсом органов таза;
выявление основных морфологических признаков ДСТ в матке.
Цель исследования
Оценить морфологическое состояние миометрия при ДСТ у женщин со слабостью родовой деятельности, варикозным расширением вен матки и пролапсом органов таза.
Задачи исследования
-
Определить основные морфологические критерии диагностики ДСТ в матке.
-
Провести сравнительный ультраструктурный и иммуногистохимический анализ нижнего сегмента миометрия после кесарева сечения у женщин с ДСТ.
-
Оценить состояние стромы и вен миометрия у женщин репродуктивного возраста с варикозным расширением вен матки.
-
Изучить особенности соединительной ткани миометрия тела матки у женщин постменопаузы с пролапсом органов таза.
-
Изучить состояние соединительной ткани и сосудов миометрия в репродуктивном возрасте, постменопаузе и родах у женщин без патологии матки.
Научная новизна исследования
Получены новые данные о морфологии стромы миометрия женщин репродуктивного возраста, постменопаузы и нижнего сегмента матки в родах без патологии. Впервые показано, что с возрастом средняя относительная площадь внутреннего просвета вен матки не изменяется, но стенки вен утолщаются за счет фиброза, что коррелирует со снижением эластогенеза не только в венах, но и в строме миометрия. При этом относительная площадь стромы субмукозного слоя миометрия и соотношение коллагенов I, III и V типов не изменяются. Впервые выявлено, что в родах отмечается увеличение плотности сосудов миометрия без увеличения относительной площади фиброзной ткани с преобладанием коллагена I типа и максимальным уровнем экспрессии матричных металлопротеиназ 1 и 9 типов, а также их тканевых
ингибиторов 1 и 2 типов. Впервые показано, что ДСТ в матке проявляется изменением соотношения коллагенов I и III типов за счет уменьшения коллагена I типа, снижением фибулина-5 и тканевых ингибиторов матричных металлопротеиназ 1 и 2 типов. Впервые показано, что в нижнем сегменте матки в родах у женщин с ДСТ со слабостью родовой деятельности выявляется не только патологическое ремоделирование соединительной ткани, но и снижение количества межклеточных контактов между гладкомышечными клетками с резким уменьшением коннексина-43 на них и телоцитах.
Теоретическая и практическая значимость работы
В результате проведенного исследования миометрия женщин, страдающих ДСТ, показана диагностическая значимость комплексного морфологического изучения в оценке патологических изменений в строме и интраорганных венах матки. Разработан алгоритм комплексного морфологического исследования ДСТ в матке, который может применяться для диагностики данной патологии и в других органах. Полученные данные могут быть использованы в практическом здравоохранении для определения риска развития акушерско-гинекологических осложнений, для выбора тактики ведения пациенток со слабостью родовой деятельности. Полученные результаты о варикозном расширении интраорганных вен матки, в том числе при пролапсе, будут способствовать объективизации диагноза ДСТ при магнитно-резонансной томографии и ультразвуковом исследовании. На основании проведенного комплексного морфологического исследования установлены возрастные особенности миометрия, которые имеют практическую значимость в качестве показателей нормы, при сравнительном морфологическом анализе.
Методология и методы исследования
В качестве методологической и теоретической основы диссертационного
исследования использовались труды отечественных и зарубежных ученых по
патологической анатомии, посвященные проявлению ДСТ в клапанах сердца,
восходящем отделе аорты, венах нижних конечностей (Митрофанова Л.Б.,
2007; Серов В.В. с соавт., 1981; Benke К. et al, 2013; El-Hamsay Н. et al, 2009;
Chien-Min F. et al., 2005); акушерству и гинекологии, лучевой диагностике,
посвященные идентификации и лечению пролапса органов таза, варикозного
расширения вен матки и малого таза (Айламазян Э.К., 2010; Шарова Л.Е. с
соавт., 2004; Смольнова Т.Ю. с соавт., 2003). В проведенном исследовании в
качестве базисного использовалось комплексное морфологическое
исследование, включающее: гистологическое, гистохимическое,
иммуногистохимическое, электронно-микроскопическое, электронно-
иммуноцитохимическое. Объектом исследования явились женщины, страдающие ДСТ со слабостью родовой деятельности, варикозным расширением интраорганных вен матки, пролапсом органов таза, а также женщины без патологии матки и ДСТ. Предмет исследования: миометрий. Выявление признаков ДСТ осуществлялось по данным медицинской документации и результатам аутопсийного исследования согласно Российским
рекомендациям I пересмотра (2013г). На проведение диссертационной работы получено разрешение Комитета по вопросам этики при ФГБУ «Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр» (протокол № 77 от 14 апреля 2014г).
Положения, выносимые на защиту
-
Для диагностики ДСТ необходимо выполнять комплекс морфологических исследований, включающий: гистологическое исследование с окраской на эластические волокна, иммуногистохимический анализ с оценкой экспрессии коллагенов I и III типов, фибулина-5, матричной металлопротеиназы-9, тканевых ингибиторов матричных металлопротеиназ 1 и 2 типов.
-
Слабость родовой деятельности женщин, страдающих ДСТ, сопровождается не только изменением стромы миометрия, но и снижением количества функционирующих межклеточных контактов.
-
ДСТ в матке проявляется нарушением эластогенеза и деградацией коллагена, что приводит к варикозному расширению интраорганных вен матки, пролапсу и слабости родовой деятельности.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты диссертационного исследования достоверны и обоснованны, что обеспечивается репрезентативностью и достаточным объемом изученного материала, использованием широкого спектра традиционных методов исследования, адекватных решению поставленных задач, корректным применением современных статистических методов обработки полученных данных.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XIV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Санкт-Петербург, ноябрь 2013), на XXIV Европейском конгрессе перинатальной медицины во Флоренции (Италия, июль 2014), на Общероссийской конференции с международным участием «Перинатальная медицина: от прегравидарной подготовки к здоровому материнству и детству» (Санкт-Петербург, декабрь 2014), на пленарном заседании Научной ассоциации патологоанатомов Санкт-Петербурга (декабрь 2014). По теме диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, из них 4 - в рецензируемых журналах, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Актуальность дисплазии соединительной ткани в акушерстве
Наследственные нарушения соединительной ткани (ННСТ) - гетерогенная группа заболеваний, обусловленных мутациями генов белков внеклеточного матрикса или генов белков, участвующих в ее морфогенезе. Дисплазии соединительной ткани разделяются на дифференцированные и недифференцированные формы [18]. Дифференцированные дисплазии характеризуются определенным типом наследования, четкой клинической картиной, а, в ряде случаев, и доказанным генетическим или биохимическим дефектом, тогда как недифференцированные дисплазии диагностируются в случае, когда набор клинических признаков не укладывается ни в одно наследственное моногенное заболевание, и установленная генетическая мутация не выявляется. Термин ННСТ, как и ДСТ не могут использоваться в качестве самостоятельного диагноза, а предполагают необходимость определения конкретного синдрома [10].
В основе развития заболевания лежат мутации генов, ответственных за синтез или распад компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Сегодня известно более 250 моногенных форм заболевания, сопряженных с мутацией генов белков внеклеточного матрикса (коллагенов различных типов, фибриллина, тенасцина и многих других), генов рецепторов ростовых факторов, в частности TGF-P, и матричных металлопротеиназ. В частности, к ним относятся синдромы Марфана, Элерса-Данло, несовершенный остеогенез, наследуемые преимущественно по аутосомно-доминантному или аутосомно-рецессивному типам. Генетический дефект может проявляться в различные возрастные периоды и, чем раньше возникают клинические симптомы такого дефекта, тем более выражена клиническая картина заболевания и тяжелее прогноз [10]. В процессе роста и развития организма происходит накопление дефектов в системе соединительной ткани. И многие признаки, обычно ассоциирующиеся с ННСТ, могут быть связаны с процессами старения (сколиотическая деформация позвоночника, плоскостопие, варикозная болезнь, пролапс органов таза) [10].
Повсеместное присутствие соединительной ткани делает понятным разнообразие проявлений, связанных с ее дефектами, и повышенный интерес к этой проблеме специалистов, работающих в самых разных областях медицины. Диагностика большинства наследуемых синдромов сопряжена с трудностями, которые возникают из-за сходства их симптомов и клинических проявлений. К примеру, признаки гипермобильности суставов являются общими для таких различных классифицируемых наследуемых заболеваний, как синдром Марфана, синдром Элерса-Данло и несовершенный остеогенез [31]. Точно так же первичный пролапс митрального клапана может встречаться при всех перечисленных наследуемых синдромах, но еще чаще является самостоятельным заболеванием. Напротив, чрезвычайно велико число состояний, группирующихся в сходные по внешним и/или висцеральным признакам фенотипы, идентифицировать которые из-за трудностей проведения молекулярно - генетических исследований зачастую не представляется возможным. Именно такие формы заболевания допустимо называть «дисплазиями соединительной ткани».
Согласно Российским рекомендациям I пересмотра 2013г. термин «дисплазия соединительной ткани» может быть использован как синоним наследственных нарушений соединительной ткани. В ряде случаев набор фенотипических признаков у пациентов с ДСТ напоминает одну из синдромальных патологий, которую следует расценивать как фенокопию дифференцированных ДСТ. Синонимами термина ДСТ являются «соединительнотканные дисплазии со смешанным фенотипом», «синдром мезенхимальной недостаточности», «малые формы дисплазии», «легкая генерализованнная патология», «генерализованная ДСТ, включающая MASS -фенотип». Название «MASS-фенотип» исторически происходит от акронима латинских терминов, обозначающих миопию (Myopia), пролапс митрального клапана (Mitral valve prolapse), расширения аорты (Aortic dilatation) изменения кожи (Skin) и костей скелета (Skeleton). Сегодня для постановки диагноза нет необходимости выявлять весь набор перечисленных в акрониме признаков [10]. Пациенты с MASS-фенотипом будут нуждаться в динамическом наблюдении для своевременного выявления аневризмы аорты. В работе Кадуриной Т.И. и соавт. [5] ДСТ разделяют на 3 варианта: элерсоподобный, марфаноидный и MASS-фенотипы. Выделяют внешние и внутренние признаки ДСТ. Внешние признаки подразделяются на костно-скелетные, кожные, суставные и малые аномалии развития. К внутренним признакам относятся диспластические изменения со стороны нервной системы, зрительного анализатора, сердечнососудистой системы, органов дыхания и брюшной полости. При выявлении не менее шести малых внешних и/или висцеральных признаков ДСТ, при условии исключения всех вышеназванных синдромов и фенотипов диагностируется неклассифицируемый фенотип с «неспецифическими нарушениями соединительной ткани» [10].
В клинической практике постоянно разрабатываются подходы диагностики ДСТ. Несмотря на это наиболее актуальной остается бальная оценка, предложенная Кадуриной Т.П. и соавт. [5, 6]. В представленной классификации каждому признаку определены баллы, по результатам суммирования которых выставляется степень ДСТ. Наиболее значимые клинические признаки и данные лабораторных и инструментальных исследований приведены в таблицах 1 и 2 [5, 6].
Варикозное расширение вен как проявление дисплазии соединительной ткани
Основной тип клеток соединительной ткани - фибробласты. Их главная функция - поддержание структурной целостности межклеточного пространства [12]. Клетки так же способны влиять на синтез цитокинов, матричных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов [76]. Фибробласты играют важную роль в ремоделировании внеклеточного матрикса при многих процессах, в том числе и при беременности. При этом в миометрии при беременности отмечаются веретеновидные клетки - миофибробласты, происхождение которых до конца неизвестно [57].
Некоторые авторы описывают резкое увеличение компонентов базальной мембраны в конце беременности. Это же подтверждают наблюдения Nishinaka К. и Fukuda Y., которые на основе гистологической картины выявили развитие эластичных волокон и утолщение базальной мембраны в гипертрофированной ГМК, а также частичную деградацию коллагена в конце беременности [88].
Таким образом, в обеспечении оптимальной эластичности матки и подготовке ее к родам межклеточный матрикс играет важную роль. Интересно, отметить, что исследования Shynlova О. et al. отражают изменения уровня экспрессии коллагена I и III типов в ответ на колебания плазменной концентрации эстрогена и прогестерона [106]. В поддержку наблюдения проводилось изучение ГМК аорты с последующим воздействием 17В -эстрадиола, которое показало уменьшение образования коллагенов, а так же изменение их соотношения [24].
Shynlova О. et al. отмечают, что в начале беременности ГМК миометрия под влиянием высокого уровня прогестерона максимально синтезирует белки [106]. Тем самым поддерживается состояние межклеточного пространства. К концу беременности в результате снижения уровня прогестерона ГМК меняет свой фенотип на сократительный. Это проявляется резким увеличением ламинина и коллагена IV типа, прекращением гипертрофии ГМК и синтеза внеклеточного матрикса, в частности коллагена I и коллагена III типов, и вероятно, отмечается увеличение образования сократительных белков. Повышенная экспрессия белков базальной мембраны ГМК к концу беременности объясняется потребностью в ее зрелом фенотипе для сокращения. Внеклеточный матрикс во время беременности претерпевает постоянные изменения. Происходит деградация матрикса и синтез нового, организованного, который полностью соответствует необходимым функциям. Изменение внутриклеточного матрикса является биологически сложным процессом, так как коллагены, которые составляют большую часть внеклеточного матрикса, обладают высокой устойчивостью к протеолитическим ферментам. Наибольшего внимания заслуживают две группы ферментов - матричные металлопротеиназы (ММР) и их тканевые ингибиторы (TIMP). ММР представляют собой большое семейство цинк - и кальций - зависимых эндопептидаз. На сегодняшний день в организме человека выделены и описаны 23 группы. Условно ММР можно разделить на 4 подкласса - коллагеназы, желатиназы, стромлизины и мембранные ММР. Коллагеназы способны разрушать фибриллярные коллагены на отдельные фрагменты. Основными коллагеназами являются ММР-1 , ММР-8 , ММР-13 и ММР-18, ММР-14. Желатиназы (ММР-2 и ММР-9) в основном лизируют IV и V коллагены, эластин и желатин. Стромлизины (ММР-3, ММР-10, ММР-11) участвуют в деградации протеогликанов, ламинина и фибронектина. TIMP контролируют активность ММР, способны связываться с активной и неактивной формой ММР. Баланс между ММР и TIMP имеет важное значение в тканевом гомеостазе [86]. По мнению Roh С. et al. [100] ММР-9 имеет важное значение в ремоделировании миометрия во время родов. В своем исследовании они отмечают повышенную экспрессию ММР-9 на ГМК, фибробластах и клетках воспаления, а во время родов наиболее выражена экспрессия про-ММР-9. Авторы отмечают, что IL-ip и TNF-альфа - более эффективные регуляторы синтеза про-ММР-9 гладкомышечными клетками миометрия во время родов по сравнению с эстрогеном и прогестероном. ГМК миометрия так же способны образовывать ММР-1,3, а регулятором их экспрессии является TGF-p, который ингибирует экспрессию металлопротеиназ не только на ГМК, но и на фибробластах, эпителиальных клетках эндометрия, макрофагах [58,79]. По мнению Brunera G.et al. [ЗО] ингибирование TGF-p металлопротеиназ является прогестерон - индуцированным процессом, как было продемонстрировано на клетках стромы эндометрия.
В свою очередь ГМК миометрия способны экспрессировать и тканевые ингибиторы матричных металлопротеиназ ТГМР-1,2. При этом TIMP-1 экспрессируется значительно больше. Некоторые авторы отмечают важную роль TGF-p в регуляции экспрессии TIMP-1. Так же ими отмечается, что при слабости родовой деятельности повышается экспрессия TGF-p 1 и TGF-P2 рецепторов. Эти данные являются еще одним свидетельством, что экспрессия ММР и TIMP регулируется TGF-p и имеет важное значение в ремоделировании миометрия [75]. Группа исследователей [120, 54] выявила участие матричных металлопротеиназ в сократительной деятельности миометрия при родах. Они отмечают, что при уменьшении активности сокращения миометрия отмечается повышение экспрессии ММР-2 и ММР-9, на основание чего предполагается способность этих ММР ингибировать сокращение миометрия.
Во время беременности диаметр маточных артерий увеличивается примерно в 2 раза, сопровождаясь незначительным утолщением стенки сосудов [93, 89]. По мнению некоторых авторов [35, 56] расширение просвета так же может быть достигнуто гипертрофией ГМК медии. Это было подтверждено на крысах и на морских свинках: исследователями отмечалось увеличение длины клетки до 80 % с равномерным увеличением ее толщины. Cipolla М. et al. отмечают, что наряду с гипертрофией медии происходит и гиперплазия клеток эндотелия [35]. Биомеханические свойства сосудов матки также значительно изменяются во время беременности в сторону повышения растяжимости. В первую очередь, это связанно с изменением объема межклеточного маткрикса сосудов, состава коллагена, ориентации волокон, уменьшения эластина. Важную роль в ремоделировании межклеточного пространства сосудов играют матричные металлопротеиназы, что проявляется повышенной экспрессией ММР-2, 9 [78, 92]. Mandala М. et al. отмечают, что при некоторых патологических состояниях, таких как эклампсия, происходит снижение экспрессии ММР [77]. Еще одним ключевым механизмом ремоделирования сосудов матки, предложенным авторами, является ренин-ангиотензиновая система. В исследованиях на мышах при выраженной ее активности отмечается замедление увеличения диаметра артерий [ПО]. У женщин с преэклампсией описывают выраженную экспрессию ангиотензина 1 типа на артериях, что считается важным в генезе гипертонии, однако влияние ангиотензина на ремоделирование сосудов миометрия до конца не известно.
Во время родов расстояние между ГМК увеличивается, и межклеточный обмен происходит за счет коннексонов, а именно коннексина-43 [53]. Эта межклеточная связь позволяет передавать измененный мембранный потенциал клетки, тем самым захватывая большие площади миометрия. Данная передача потенциала способствует скоординированным сокращениям миометрия, что необходимо для успешных родов. Коннексоны являются «неспецифически-управляемыми» каналами. Их состояние регулируется рН, электрическим потенциалом, ионами Са2+, фосфорилированием и другими факторами. Так, каналы коннексонов перекрываются при попадании в клетку Са2+ при повреждении. Коннексин-43 является основным компонентом коннексонов миометрия. Экспрессия этого антигена значительно увеличивается во время родов, и есть предположение, что коннексины регулируют координацию сокращений всего миометрия [49]. Hutchings G. et al. [60] отмечают высокую экспрессию коннексина-43 на ГМК во время беременности, тем не менее, на границах пучков ГМК исследователи находили клетки с более равномерным окрашиванием. Вне беременности эти клетки имели такое же окрашивание, в то время как на ГМК экспрессии не наблюдалось. Использование специфических маркеров показало, что это интерстициальные клетки миометрия. Они имеют удлиненные отростки и располагаются главным образом на поверхности пучков ГМК.
Иммуногистохимическое исследование и морфометрия
Морфометрический анализ осуществлялся с помощью анализаторов изображения Leica Application Suite V 4.5.0 и Image J 1.48v. Выполнялось морфометрическое исследование миометрия с вычислением: 1) средней относительной площади стромы миометрия (процентное соотношение средней площади стромы к средней площади препарата; рисунок 5), 2) средней плотности сосудов (процентное соотношение средней суммарной площади сосудов, включая их просвет и стенку, к средней площади препарата), 3) средней площади внутреннего просвета вен, 4) средней толщины их стенок, 5) средней относительной площади экспрессии (процентное соотношение средней площади экспрессии антигенов к средней площади препаратов) коллагенов I, III и V, фибулина-5, фибронектина, коннексина-43. Распространенность экспрессии матричных металлопротеиназ-1,9, тканевых ингибиторов матричных металлопротеиназ-1,2 оценивалась полуколичественным методом в баллах (1 - в единичных клетках, 2 - в небольших группах клеток, 3 - в больших группах клеток). Осуществлялся подсчет среднего количества CD3+ Т-лимфоцитов на 1 мм .
Электронная микроскопия и электронная иммуноцитохимия проводились в НИЛ структурной и функциональной протеоники ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава РФ ст. науч. сотрудником, к.б.н. Горшковым А.Н. на 6 биопсиях нижнего сегмента матки, полученных от 6 рожениц, вошедших в I группу: 3 биопсии от 3 рожениц из подгруппы 1а, и 3 биопсии из подгруппы 16.
Для электронной микроскопии образцы фиксировались в 2,5%-м растворе глютарового альдегида на 0,1М фосфатном буфере в течение 1ч при комнатной температуре, после чего промывались в 3-х сменах фосфатного буфера. Далее выполнялась пост-фиксация кусочков в 1%-м растворе тетроксида осмия на том же буфере, при той же температуре в течение 1ч. После фиксации объекты были дегидратированы в серии растворов этанола возрастающей концентрации (30%, 50%, 70%, 96%, 100%), пропитаны ацетоном и заключены в эпоксидную смолу Эпон. На ультрамикротоме Leica UC7 были получены ультратонкие срезы толщиной 50-70 нм. Срезы были собраны на медные сетки для электронной микроскопии. Сетки со срезами были отконтрастированы в спиртовом растворе уранил-ацетата и водном растворе цитрата свинца. Электронномикроскопическое исследование срезов было выполнено на микроскопе JEOL JEM 1011. Электронные микрофотографии были получены с использованием камеры Morada (Digital Imaging Solutions Inc.).
Для электронной иммуноцитохимии фрагменты нижнего сегмента матки фиксировались в 4%-ном растворе параформальдегида в фосфатном буфере с добавлением 0,2 % глютаральдегида в течение 1 часа. Далее объекты дегидратировали в серии растворов этанола возрастающей концентрации и заключали в акриловую смолу LRWhite (Sigma inc.). Полимеризация смолы проходила в закрытых желатиновых капсулах при температуре +52С. На ультрамикротоме Leica UC7 были получены ультратонкие срезы изучаемого материала толщиной 50-70 нм. Срезы были собраны на никелевые сетки для электронной микроскопии. С целью блокирования неспецифического связывания антител срезы на сетках обрабатывали 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (Sigma inc.) в фосфатном буфере в течение 15 мин при комнатной температуре. Коннексин-43 на ультратонких срезах выявлялся непрямым методом. В качестве первичных антител были использованы те же поликлональные кроличьи антитела против коннексина-43 (Diagnostic BioSystems), что и при иммуногистохимическом исследовании. Сеточки со срезами инкубировали в растворе указанных антител на фосфатном буфере (1:100) в течение 1 часа и отмывали в 0,05%-ном растворе Твина-20 в фосфатном буфере. В качестве вторичных антител использовали антитела козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с коллоидным золотом диаметром 10 нм (Sigma; разведение 1:100, инкубация в течение 1 часа). После проведения иммунной реакции сетки со срезами были отконтрастированы в спиртовом растворе уранил-ацетата и водном растворе цитрата свинца. Электронно-микроскопическое исследование срезов выполнялось на микроскопе JEOL JEM 1011. Цифровые электронные микрофотографии были получены с использованием камеры Morada (Digital Imaging Solutions Inc.).
Статистическая обработка проводилась автором диссертации с применением программы «Statistica 10» (StatSoft, USA). Для оценки количественных параметров с нормальным распределением вычислялись следующие показатели: среднее арифметическое (М), ошибка среднего арифметического (т), среднее квадратичное отклонение (5). Для сравнения нескольких независимых групп по качественным признакам использовался непараметрический критерий Краскила-Уоллиса. Выполнялся корреляционный анализ. Зависимость признаков в корреляционных парах оценивалась по степеням: 1) сильная связь - при г 0,7; р 0,05, 2) умеренная связь - при 0,5 г 0,69, р 0,05, 3) слабая связь - при г 0,5; р 0,05. В случае малого числа наблюдений в ячейках таблицы использовался точный критерий Фишера, в противных случаях - критерий Пирсона. Достоверными считались различия, когда вероятность справедливости нулевой гипотезы (р) не превышала 0,05.
Автор выражает благодарность научному сотруднику НИЛ патоморфологии О.В. Бещук в проведении иммуногистохимического окрашивания, ст. науч. сотруднику, к.б.н. А.Н. Горшкову в проведении электронной микроскопии и электронной иммуноцитохимии, врачу патологоанатому, к.м.н. Е.Ф Горбунову в предоставлении аутопсийного материала маток, акушеру-гинекологу, к.м.н. Ф.А. Овсянникову в предоставлении операционного материала нижнего сегмента матки после КС.
Сравнительное морфологическое исследование стромы нижнего сегмента матки при дисплазии соединительной ткани
При ИГХИ с морфометрией было установлено, что в венах Па подгруппы площадь экспрессии коллагена I - 1,8 ± 0,4%, что достоверно меньше, чем в подгруппе Пб (р 0,01), а площадь экспрессии коллагена III - 67 ± 3,4%, что больше, чем в подгруппе Пб (р 0,01, рисунок 36, таблица 12). Площадь экспрессии фибронектина в подгруппе Па - 9,7 ± 7%, что было меньше, чем в подгруппе Пб (р 0,01). Площадь экспрессии фибулина-5 в подгруппе Па
При гистологическом исследовании стромы миометрия перивенулярно определялся отек, фрагментация коллагеновых волокон и незначительный смешанноклеточный воспалительный инфильтрат (рисунок 36).
Миометрий тела матки. В строме отмечается отек, небольшая полиморфноклеточная воспалительная инфильтрация. Гематоксилин-эозин, увеличение 200 ИГХИ стромы миометрия выявило снижение коллагена I типа, при этом отмечалось увеличение коллагена III типа (р 0,01, таблица 13). Площадь экспрессии фибронектина в подгруппе Па составила - 21 ± 3,4% и не отличалась от подгруппы Пб (р=0,2). В подгруппе Па средняя относительная площадь экспрессии фибулина-5 составила 12,8 ± 3,3% и была меньше, чем в Пб подгруппе (р=0,01; рисунок 37).
В подгруппе Па отмечалась более выраженная экспрессия ММР-9 в строме и в стенках вен (рисунок 38). При этом в строме не экспрессировались TIMP-1 и ТГМР-2. Воспалительный инфильтрат стромы Па подгруппы содержал в среднем 7-12CD3 Т-лимфоцитов на 1 мм .
Экспрессия фибулина-5 (коричневое окрашивание): а - в строме миометрия; б - в интраорганной вене. Варикозное расширение интраорганных вен тела матки. Иммуногистохимическая реакция, увеличение 400 Рисунок 38. Экспрессия ММР-9: а - на эндотелии и ГМК стенки интраорганной вены; б - на ГМК миометрия. Варикозное расширение интраорганных вен тела матки. Иммуногистохимическая реакция, увеличение 400 Заключение
Таким образом, при варикозном расширении интраорганных вен матки отмечается увеличение площади внутреннего просвета вен более чем в 100 раз с нарушением гистоархитектоники стенки за счет замещения ГМК фиброзной тканью с фрагментацией и лизисом эластических волокон, что приводит к утолщению стенок в 5 раз. При этом отмечается снижение количества коллагена I типа, фибронектина, фибулина-5, ТГМР-1 и TIMP-2, а экспрессия коллагена III типа и ММР-9 увеличивается. В строме миометрия уровень коллагена I типа и фибулина-5 так же снижается, но их больше, чем в венах, а количество коллагена III типа увеличивается, как и в этих сосудах. Уровень фибронектина, в отличие от такового в венах, не изменяется.
По данным органометрии, средние размеры и масса матки в Ша и Шб подгруппах достоверно не различались и составили соответственно 3,6±1,1 х 3,1± 0,8см и 38±12г. На разрезе миометрий имел однородное строение. В субсерозном слое в матках Ша подгруппы сосуды были более выражены, с уплотненными стенками, имели извилистое строение, выступали над поверхностью среза.
При гистологическом исследовании в миометрий тела матки в Ша и Шб подгруппах общим было неравномерное уменьшение пучков ГМК, замещающихся периваскулярной и перимускулярной соединительной тканью (рисунок 39). Рисунок 39. Миометрий тела матки. Отмечается периваскулярный и перимускулярный фиброз. Пролапс органов таза. Гематоксилин-эозин, увеличение 100
В Ша подгруппе при окрашивании гематоксилином и эозином в большом количестве определялись бледные, голубовато-розовые белковые массы, которые располагались периваскулярно и в строме миометрия (рисунок 40). Эти белки не окрашивались в кирпично-красный цвет конго красным, а при окраске резорцин-фуксином Вейгерта с подкрашиванием по ван Гизону они представляли собой фрагментированные темно-синие «эластические» волокна с небольшой примесью коллагеновых (рисунок 41). При этом в Шб подгруппе так же отмечались очаговые скопления «комковатых» темно-синих эластических волокон, но их количество было значительно меньше, и они не определялись при окраске гематоксилином и эозином (рисунок 42
Миометрий тела матки. Стрелкой показаны бледные голубовато-розовые белковые массы: а - в строме миометрия (увеличение 400); б -периваскулярно (увеличение 200). Пролапс органов таза. Гематоксилин-эозин Рисунок 41. Миометрий тела матки. Стрелкой показаны скопления фрагментированных, набухших и деформированных темно-синих «эластических» волокон: а - в строме миометрия; б - периваскулярно. Пролапс органов таза. Окраска резорцин-фуксином Вейгерта с подкрашиванием по ван Гизону, увеличение 200 Рисунок 42. Миометрий тела матки. Стрелкой показано очаговое скопление в строме темно-синих «эластических» волокон. Тело матки женщины подгруппы Шб. Окраска резорцин-фуксином Вейгерта с подкрашиванием по ван Гизону, увеличение 200
При ИГХИ с морфометрией было выявлено, что в Ша подгруппе средняя относительная площадь экспрессии коллагена I - 4,6 ± 4%, что меньше, чем в Шб подгруппе (р 0,01, рисунок 43). Экспрессия коллагена III была в виде периваскулярных и перимускулярных скоплений, а также равномерно распределялась в строме и в стенках сосудах, где насчитывала 29 ± 2% и не отличалась от подгруппы Шб (р=0,5). Относительная площадь экспрессии коллагена V составила 14 ± 2%, что достоверно меньше, чем в подгруппе Шб (р=0,02, рисунок 44). Соотношение коллагена I и III типов в подгруппе Ша было 1:6,3 (в подгруппе Шб - 1,8:1).В подгруппе Ша экспрессия фибронектина была 10,9 ± 8%, что меньше, чем в подгруппе Шб (р=0,03, таблица 14). Средняя относительная площадь экспрессии фибулина-5 составила 0,6 ± 0,2% и оказалась меньше, чем в подгруппе Шб (р 0,01).