Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
Морфологические критерии и подтипы вПИН 12
Дифференциальный диагноз вПИН 13
Рутинные маркеры для дифференциальной диагностики вПИН, доброкачественных состояний и рака, их недостатки .17
Молекулярные и генетические характеристики вПИН. Эпигенетические изменения 18
Роль базальных клеток. Концепция раковых стволовых клеток 23
Новые потенциальные маркеры для дифференциальной диагностики вПИН, доброкачественных состояний и рака .27
Заключение .30
Глава 2. Материал и методы 31
Материал исследования 31
Иммуногистохимическое исследование 33
Молекулярно-генетическое исследование 34
Статистическая обработка данных 35
Глава 3. Анализ морфологических особенностей ВПИН 36
Глава 4. Анализ иммуногистохимических и молекулярно-генетических особенностей ВПИН .70
Глава 5. Обсуждение результатов 90
Заключение 99
Выводы 100
Практические рекомендации 102
Перспективы дальнейшей разработки темы 103
Список сокращений 104
Литература 105
- Молекулярные и генетические характеристики вПИН. Эпигенетические изменения
- Анализ морфологических особенностей ВПИН
- Анализ иммуногистохимических и молекулярно-генетических особенностей ВПИН
- Обсуждение результатов
Молекулярные и генетические характеристики вПИН. Эпигенетические изменения
Количественные и качественные хромосомные аномалии при помощи метода FISH [103] были обнаружены в половине фокусов вПИН, 51% фокусов аденокарцином и в 100% метастазов рака простаты. Наиболее часто в вПИН выявляются структурные перестройки в 8 хромосоме (32% фокусов), 10 хромосоме (13%), 7 (10%), 12 (4%) и Y (4%). Наиболее частыми в фокусах рака являются перестройки в 7 и 8 хромосомах (28% и 30% фокусов соответственно), 10 (23%), 12 (9%) и Y (9%). В метастазах аденокарцином обнаруживают высокий процент аномалий во всех хромосомах (более 63% фокусов). Кроме того, отмечается вариабельность хромосомных аномалий в различных фокусах вПИН. В 48% случаев с мультифокусными вПИН, хромосомные аномалии наблюдаются в одном или более фокусов, но не во всех, что доказывает генетическую гетерогенность.
Таким образом, среднее число хромосомных аномалий возрастает от вПИН к карциноме, кроме того, в пределах одного случая фокусы аденокарциномы имеют большее число хромосомных аномалий, нежели соседние очаги вПИН, что является очередным доказательством предраковой природы вПИН. Однако в некоторых случаях очаги вПИН содержат большее число аномалий, чем соседствующие карциномы, либо отличаются от неё по структуре хромосомных перестроек.
Эти результаты подтверждаются и с помощью лазерной микродиссекции с последующей сравнительной геномной гибридизацией. Согласно исследованиям Hughes S. et al., наиболее часто встречающейся аномалией в вПИН является дисбаланс в 8 хромосоме, а в карциноме простаты – изменения в 6, 10, 13 и 16 хромосомах [64] .
Особенностью канцерогенеза в предстательной железе является также образование химерных онкогенов, приводящих к активации факторов транскрипции семейства ETS [36]. Простатспецифические промоторные элементы химерных генов TMPRSS2/ETS обеспечивают высокую стойкую экспрессию онкогенов, запуская процессы пролиферации и трансформации клеток в предстательной железе [142]. Конечным результатом всех перестроек ETS является аномальная гиперэкспрессия измененных вариантов транскрипционных факторов. Наиболее частым вариантом, до 50-60% является слияние TMPRSS2 с расположенным рядом геном ERG [90, 143]. Исследования Tomlins с соавт. показали, что в 95% случаев гиперэкспрессия ERG ассоциирована с наличием химерного гена TMPRSS2/ERG [133]. В результате слияния 1 экзона TMPRSS2 и 3 -конца ERG образуется химерный ген, который после альтернативного сплайсинга дает 8 вариантов химерных транскриптов, наиболее частым (86%) является вариант 1 экзон TMPRSS2 - 4 экзон ERG. Показана корреляция наличия TMPRSS2/ERG с более поздними стадиями заболевания [9, 22] и возможность использования его обнаружения для дифференциальной диагностики высокой ПИН и внутрипротоковой карциномы [61, 89].
Комплексные молекулярно-биологические исследования показали, что процессы миграции, пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели не объясняются лишь списком мутаций, а регулируются клеточными сигнальными белками, структура которых так же способна изменяться в следствие посттрансляционных эпигенетических модификаций.
Применение методов лазерной микродиссекции и гибридизации на микрочипах позволило провести анализ профилей экспрессии генов в аденокарциноме предстательной железы и вПИН. Согласно данным Ashida S. et al., карцинома простаты и вПИН обнаруживают сходства в профилях экспрессии в виде общих генов с повышенной экспрессией (21, включая AMACR, OR51E2, RODH, SMS) и с пониженной (63, среди которых гены протеиназ SERPINB1, SERPING1 и MMP7). Изменения в профиле экспрессии генов при переходе вПИН в рак заключаются в повышении экспрессии ещё 41 гена и понижении 98. Список с повышенным профилем экспрессии включает в себя PTOV1, CDKN2C, EPHA4, APOD, FASN и VWF, с пониженным – ITGB2, LAMB2, PLAU и TIMP1 которые, вероятно, вовлечены в регуляцию процессов клеточной адгезии и инвазивного роста аденокарциномы [18].
В вПИН отмечается пониженная экспрессия глутатион-S трансферазы (GSTP1) -класса – фермента, отвечающего за детоксикацию электрофильных и кислых ксенобиотиков. Снижение экспрессии фермента является результатом гиперметилирования промотера кодирующего его гена. Метилирование промотера GSTP1 – наиболее часто встречающееся изменение и в аденокарциноме предстательной железы, и считается наиболее ранним событием канцерогенеза [33, 42]. Также гиперметилирование промотера гена 15-липооксигеназы-1 приводит к выраженной экспрессии этого фермента в вПИН и аденокарциноме [68].
Сравнительно недавно были разработаны методы количественной и качественной полимеразной цепной реакции, основанные на определении метилирования одиночных генов – GSTP1 [35], совокупности генов (CDKN2A/MGMT/GSTP1) [62] и комплексный тест мочи на метилирование трех маркеров - GSTP1, RARB, APC [136]. Тем не менее, данные методы детекции не являются достаточно эффективными в диагностике ранних стадий рака простаты, поэтому до сих пор идет поиск эффективных маркеров [132].
Кроме изучения генетических и эпигенетических изменений, важную роль в понимании процессов канцерогенеза и в практических целях играет изучение фенотипических проявлений измененных генов на уровне синтеза белков, в частности, молекул клеточной адгезии. Молекулы клеточной адгезии состоят из пяти важных семейств: суперсемейство иммуноглобулинов, кадгерины, селектины, интегрины и CD44 [70, 100, 126].
CD44 – трансмембранный гликопротеин, играющий важную роль в миграции лимфоцитов, межклеточных взаимодействиях и клеточной адгезии. Кроме того, существует предположение, что популяция CD44+ клеток связана с трансформацией стволовых и прогениторных клеток простаты в опухолевые [97]. Отмечено снижение экспрессии CD44 в вПИН по сравнению с доброкачественными железами и ПИН низкой степени [134], и исчезновение экспрессии в большинстве аденокарцином простаты (95%) [65].
Е-кадгерин – гликопротеин из надсемейства кадгеринов, относящийся к кальций-зависимым белкам клеточной адгезии. Экспрессия снижается в вПИН и аденокарциноме. В аденокарциноме простаты уменьшение экспрессии Е-кадгерина коррелирует со стадией опухоли, степенью злокачественности, плоидностью ДНК и выживаемостью [67].
-катенин играет роль в процессах клеточной дифференцировки и пролиферации. Мутация в гене катенина (CTNNB1) так же связана с опухолевой прогрессией в аденокарциноме простаты [67].
При неопластических процессах (вПИН и аденокарциноме простаты) наблюдается положительная связь между иммуногистохимической реакцией с CD44, -катенином (цитоплазменное и ядерное окрашивание) и Е-кадгерином [74]. Гиперэкспрессия Wnt-1 и -катенина в вПИН, возможно, является ранним событием в развитии аденокарциномы простаты, а сигнальный путь Wnt/-катенин ассоциирован с канцерогенезом в предстательной железе. Более того, определённые мишени -катенина, такие как CD44, uPAR и ламинин- 2 – участники процессов клеточной инвазии и играют важную роль в сигнальном пути Wnt/-катенин [74].
Ранняя стромальная инвазия также ассоциирована с потерей адгезивных элементов, ассоциированных с полудесмосомами (ламинин 5, коллаген VII типа, альфа 6, бета 4 интегрины) [27]. В отечественных исследованиях также показана роль в канцерогенезе матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов [7, 10].
По сравнению с нормальной тканью простаты и доброкачественной гиперплазией, вПИН демонстрирует повышение ангиогенной активности, выражающейся в повышении плотности сосудов [121], что объясняется значительным повышением экспрессии VEGF, IGFBP-2 и IGFBP-3 в фокусах вПИН и раке [81, 130]. Кроме того, эти процессы ассоциированы с транскрипционным фактором – гипоксией-индуцированный фактор 1 (HIF-1) [148]. Сходным образом изменяется уровень апуриновой-апиримидиновой эндонуклеазы (Ape1/ref-1) – низкий в доброкачественной гиперплазии, возрастает в вПИН и карциноме простаты [69].
Так же к ранним событиям в развитии аденокарциномы предстательной железы относят накопление мРНК PSCA (антигена стволовых клеток простаты) в вПИН, предполагая, что экспрессию мРНК PSCA можно считать фактором риска прогрессии изолированной вПИН в рак [104, 147].
В ряде исследований показана роль активации теломеразы и гиперэкспрессии шаперонов hsp90 и p23 в процессе канцерогенеза [46].
Анализ морфологических особенностей ВПИН
В настоящее время вПИН рассматривается как наиболее вероятный предшественник инвазивной аденокарциномы предстательной железы. Как правило, рак развивается у большинства пациентов с вПИН в течение 10 лет [112]. В нашем исследовании очаги вПИН вблизи инвазивной аденокарциномы предстательной железы были выявлены в 100% случаев.
ПИН высокой степени характеризуется пролиферацией внутри предсуществующих протоков и ацинусов клеток с цитологическими характеристиками рака, включая увеличение ядер и появление заметных ядрышек. Часто наблюдается инверсия нормальной ориентации пролиферирующих клеток. Как было сказано ранее, описано четыре основных структурных паттерна: плоское поражение, пролиферация эпителия с образованием микрососочков, криброзных структур или розеток. В настоящее время считается, что клинического значения варианты строения вПИН не имеют. В нашей работе мы наблюдали все основные варианты строения (Рис. 1 – 8), при этом в большинстве случаев (95%) было отмечено сочетание различных вариантов строения вПИН (Рис. 9 – 12).
Очаги вПИН вблизи инвазивного рака наблюдались как при высокодифференцированных аденокарциномах (Глисон 3+2, 3+3, Рис. 13), так и при низкодифференцированных (Глисон 4+5, 5+4, 5+5, Рис. 14, 15). Таким образом, можно предполагать, что аденокарцинома любой степени дифференцировки развивается на фоне уже имеющихся предопухолевых процессов.
Согласно исследованию Bostwick D.G. and Ma J. [30] из доброкачественных процессов наиболее часто за вПИН принимается базальноклеточная гиперплазия, доброкачественный пролиферирующий эпителий, ПИН низкой степени, реактивные изменения, крибриформная гиперплазия, атрофия и постатрофическая гиперплазия.
В нашей работе базальноклеточная гиперплазия была отмечена в 25% случаев (Рис. 16 – 18). Основная трудность в дифференциальной диагностике заключается в том, что для обоих процессов характерны хорошо заметные ядрышки. Однако для всех наблюдений базальноклеточной гиперплазии была характерна округлая форма ядер (25 случаев), в большинстве случаев – небольшой диаметр ацинусов (22 случая) с заметным слоем секреторных клеток (21 случай), редко – солидные гнезда (2 случая) или псевдокрибрифорный характер роста (1 случай). Для вПИН, в свою очередь, была характерна цилиндрическая форма ядер (100 случаев), укрупнение диаметра желез (95 случаев) с формированием истинно крибриформных участков роста (25 случаев), а также сохранение прерывистого базального слоя с отсутствием выраженных ядрышек, и появление видимых ядрышек в диспластичном люминальном эпителии (100 случаев). Частота встречаемости признаков приведена в Таблице 2.
С учетом проведенного анализа, основные критерии дифференциальной диагностики суммированы в Таблице 3.
Структуры ПИН низкой степени в нашей серии наблюдений были выявлены во всех случаях, тем не менее, согласно современным взглядам, данное состояние является доброкачественным и не относится к предраковым. Для ПИН низкой степени, также как и вПИН характерны аналогичные архитектурные особенности, как правило, это структуры по типу розеток, но могут наблюдаться и плоские поражения, микрососочки, в редких случаях – крибриформные структуры (Рис. 19). При обоих процессах люминальный слой представлен цилиндрическим псевдостратифицированным эпителием с амфофильной цитоплазмой, базальный слой при рутиной окраске определяется неотчетливо. Дифференциальную диагностику осложняет ещё и тот факт, что в ПИН низкой степени может отмечаться слабая экспрессия AMACR (1 случай), а в вПИН экспрессия AMACR может значительно снижаться или вовсе отсутствовать (4 случая). Однако в отличие от вПИН, в ПИН низкой степени во всех случаях отмечалось отсутствие выраженных ядрышек.
За вПИН может быть принята и обычная пролиферация люминального эпителия при железистой гиперплазии (Рис. 20). Для данного процесса также характерно отсутствие заметных ядрышек (100 случаев), таким образом, основные дифференциально диагностические критерии – те же, что и для ПИН низкой степени.
Особую сложность для дифференциальной диагностики представляет крибриформная гиперплазия, имитирующая вПИН. В нашем исследовании данный вид гиперплазии выявлен в одном случае (Рис. 21). Для клеток в крибриформной гиперплазии в отличие от вПИН были характерны ядра небольшого размера с незаметными или едва заметными ядрышками, светлая обильная слабоэозинофильная цитоплазма, выявлялся хорошо выраженный слой базальных клеток, окружающий комплексы из крибриформных структур, располагающихся в строме диффузно, местами образующих узелки. В свою очередь, во всех 25 случаях крибриформной вПИН отмечалось укрупнение клеток с наличием видимых ядрышек, скудной эозинофильной или амфофильной цитоплазмой, прерывистость базального слоя, отсутствие узелков или скоплений. Основные дифференциально-диагностические критерии приведены в Таблице 6.
За дисплазию могут быть приняты и реактивные изменения эпителия при воспалительном процессе в предстательной железе. При остром или хроническом простатите может отмечаться увеличение размеров ядер, появление хорошо заметных ядрышек и митотических фигур. В нашем исследовании реактивная атипия была отмечена в 2х случаях (2%) (Рис. 22). Дифференциальная диагностика между вПИН и реактивными изменениями, как правило, основывается только на данных иммуногистохимического исследования. Наличие воспалительных клеток, инфильтрирующих не только строму, но и эпителий (отмечалось в обоих случаях), позволяет заподозрить реактивный характер изменений и провести иммуногистохимическое исследование.
В части случаев приходилось проводить дифференциальный диагноз между вПИН и семявыносящими протоками. Последние характеризуются наличием полиморфных, часто уродливых, клеток, с округлыми или овальными ядрами различного размера (отмечено во всех 100 случаях), однако данные морфологические особенности могут быть приняты за атипию (Рис. 23). Вспомогательным критерием является наличие в семенных пузырьках цитоплазматического пигмента липофусцина (95 случаев, 95%), однако, следует иметь в виду, что липофусцин также не является абсолютным признаком семенных пузырьков и семявыносящих протоков и может встречаться в простатическом эпителии (в данной выборке не отмечалось).
За вПИН может быть принята и уротелиальная метаплазия протоков и ацинусов, поскольку последняя может также характеризоваться в ряде случаев появлением заметных ядрышек. В нашей выборке уротелиальная метаплазия была отмечена в 5% случаев (Рис. 25). Для переходноклеточной метаплазии характерна мономорфность пролиферирующих клеток и небольшой размер ядер, как правило, вытянутых, а также сохранение слоя секреторных клеток. Данные признаки были отмечены во всех 5 случаях.
Анализ иммуногистохимических и молекулярно-генетических особенностей ВПИН
Иммуногистохимическое исследование было проведено для всех 100 пациентов из исследуемой когорты. Наличие в образцах аденокарциномы и вПИН подтверждалось иммуногистохимическими реакциями с антителами к AMACR и цитокератинам высокого молекулярного веса 34betaE12. Один пациент был впоследствии исключен из анализа в связи с отсутствием инвазивной аденокарциномы в выбранном для работы блоке. Стоит также отметить, что два случая характеризовались слабой экспрессией AMACR в раке и вПИН вплоть до полного отсутствия в отдельных структурах и два случая отсутствием экспрессии AMACR в вПИН при умеренной экспрессии в раке.
В ходе настоящей работы были изучены особенности экспрессии белков – потенциальных маркеров для дифференциальной диагностики вПИН, доброкачественных состояний и рака, рассмотренные в первой главе, в частности, был проведен анализ экспрессии PTOV1, APOD, EPHA4, FASN и ERG.
Экспрессия ERG была отмечена в 46% аденокарцином и 26% вПИН, во всех структурах – в ядерном локусе. Следует отметить, что во всех наблюдениях ERG-положительной вПИН, экспрессия белка выявлена в структурах вПИН, расположенных вблизи ERG+ аденокарциномы (Рис. 31). У 8 пациентов (8%) отмечена гетерогенная экспрессия ERG: выраженная экспрессия в одних участках сочеталась с полным её отсутствием в других (Рис. 32). Клинико-морфологические характеристики и экспрессия ERG в новообразованиях представлены в Таблице 10.
При оценке зависимости экспрессии ERG и морфологических факторов прогноза было отмечено равномерное распределение EGR+ и ERG- опухолей по стадии процесса и распространенности первичной опухоли (рТ). По данным некоторых авторов [9, 22, 99, 128, 138], экспрессия опухолью ERG ассоциирована с более агрессивным её течением: большим объемом поражения и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы. В нашей выборке различия между группами по данным признакам оказались статистически незначимыми (p 0,05, критерий 2 и критерий 2 с поправкой Йейтса соответственно), таким образом, прогностическое значение экспрессии ERG выявить не удалось.
Оценка взаимосвязи экспрессии ERG и степени дифференцировки опухоли оказалась невозможной в связи с небольшим количеством наблюдений низкодифференцированной аденокарциномы.
В доброкачественных структурах экспрессия ERG в настоящем исследовании не была отмечена ни в одном из случаев.
Во всех 6 случаях с наличием внутрипротоковой карциномы была выявлена выраженная экспрессия ERG во всех данных структурах (Рис. 33) [1, 13].
Паракринное действие APOD заключается в распределении его лигандов между клетками, поэтому для данного белка характерна цитоплазматическая экспрессия. В настоящем исследовании в большинстве случаев вПИН иммуногистохимическая реакция отмечалась в цитоплазме апикальной части клеток. В раке экспрессия выявлялась также в апикальной части клеток и/или в секрете желез в просвете (Рис. 34, 35). Экспрессия APOD (вне зависимости от интенсивности) в 76% случаев была отмечена и в раке и в вПИН, в 4% – только в раке и в 7% – только в вПИН. В 2% случаев была отмечена гетерогенная экспрессия APOD, сочетавшаяся с гетерогенной экспрессией ERG (Рис. 36). В морфологически нормальной ткани предстательной железы лишь в 2 случаях наблюдалась умеренная экспрессия APOD, при этом в данных структурах отсутствовала экспрессия AMACR, а при реакции с 34betaE12 отмечалась прерывистость слоя базальных клеток (данные структуры были расценены при рутинном гистологическом исследовании как AMACR-негативные очаги вПИН).
Положительная экспрессия APOD была отмечена и во внутрипротоковой карциноме (Рис. 37).
При оценке зависимости экспрессии APOD и морфологических факторов прогноза было отмечено равномерное распределение APOD+ и APOD- опухолей по стадии процесса и распространенности первичной опухоли (рТ). В нашей выборке различия между группами по наличию метастазов в регионарные лимфатические узлы, а также объему поражения оказались статистически незначимыми (p 0,05, метод точного теста Фишера и критерий 2 с поправкой Йейтса соответственно), таким образом, прогностическое значение экспрессии APOD также выявить не удалось. Оценка взаимосвязи экспрессии APOD и степени дифференцировки опухоли оказалась невозможной в связи с небольшим числом наблюдений низкодифференцированной аденокарциномы. Клинико-морфологические характеристики и экспрессия APOD в новообразованиях представлены в Таблице 11.
Также в нашей работе во всех исследованных образцах в раке и вПИН было отмечено значительное снижение цитоплазматической экспрессии PTOV1 (отсутствие экспрессии или слабая интенсивность) по сравнению с морфологически нормальными железами (умеренная интенсивность или выраженная экспрессия) (Рис. 38 – 40). В 3% отмечалось отсутствие экспрессии PTOV1 и в ряде морфологически нормальных желез [2, 15, 52].
Экспрессия FASN была отмечена в аденокарциноме и вПИН во всех исследованных образцах в мембранно-цитоплазматическом локусе (умеренной интенсивности или выраженная), при этом зависимости интенсивности окрашивания от степени дифференцировки опухоли не наблюдалось. В 2 случаях (2%) в аденокарциноме и вПИН была выявлена выраженная экспрессия FASN при отсутствии или слабой экспрессии AMACR (Рис. 41). В 3 наблюдениях (3%) была выявлена слабая экспрессия данного белка в ПИН низкой степени и очагах железистой гиперплазии, в остальных случаях в доброкачественных поражениях и нормальных структурах экспрессия FASN отсутствовала, либо отмечалась на уровне фоновой (Рис. 42 – 44). В связи с описанным характером экспрессии нам представляется целесообразным в дальнейшем умеренно интенсивную и выраженную реакцию считать положительной, а слабой интенсивности, также как и полное её отсутствие – отрицательной [3, 6, 52].
Разница экспрессии EPHA4 в морфологически нормальных железах, вПИН и раке в нашем исследовании была отмечена только в 2 % случаев (Рис. 45). В остальных 98% как в доброкачественных структурах, так и в злокачественных поражениях наблюдалась положительная мембранно-цитоплазматическая реакция одинаковой интенсивности – от слабой до умеренной (Рис. 46) [2].
Обсуждение результатов
ВПИН представляет собой пролиферацию клеток люминального эпителия различного размера с укрупненными ядрами и заметными ядрышками при сохранении слоя базальных клеток, иногда мозаичного. Цитологические характеристики вПИН однотипны и являются критерием постановки диагноза, при этом вПИН различается по своим архитектурным паттернам, среди которых выделяют 4 основных: плоское поражение, пролиферация эпителия с образованием микрососочков, криброзных структур или розеток. В ходе настоящей работы при анализе морфологических вариантов строения вПИН были выявлены все четыре основных архитектурных паттерна, но в большинстве случаев (95%), они встречались не изолированно, а в сочетании, с преобладанием одного или двух вариантов строения или без такового. Кроме того, значимой зависимости преобладания того или иного варианта от степени дифференцировки или стадии аденокарциномы также не обнаружено. Это позволяет сделать вывод об отсутствии клинической значимости в выделении вариантов строения вПИН и отражения этого в морфологическом заключении.
В исследованной группе пациентов очаги вПИН наблюдались как при высокодифференцированных аденокарциномах предстательной железы, так и при низкодифференцированных и были выявлены в 100% случаев. Таким образом, имеется основание предполагать, что инвазивная аденокарцинома вне зависимости от степени дифференцировки развивается не de novo, а на фоне имеющихся предопухолевых процессов. Это важно для биопсийной диагностики вПИН, т.к. выявление изолированной вПИН в биоптатах предстательной железы диктует необходимость повторной биопсии.
Дифференциальную диагностику вПИН необходимо проводить с множеством доброкачественных и злокачественных процессов в предстательной железе. Частота встречаемости в исследуемой когорте доброкачественных состояний, способных имитировать вПИН составила: базальноклеточная гиперплазия – 25% случаев, крибриформная гиперплазия – 1%, реактивная атипия – 2%, уротелиальная метаплазия – 5%, ПИН низкой степени была выявлена во всех исследованных образцах. Кроме того, за вПИН могут быть приняты и нормальные структуры семенных пузырьков и железистая гиперплазия.
Для базальноклеточной гиперплазии характерна округлая форма ядер, небольшой диаметр ацинусов и сохранение слоя люминальных клеток. Последний признак также помогает дифференцировать с вПИН уротелиальную метаплазию. Для переходноклеточной метаплазии, кроме того, характерна мономорфность пролиферирующих клеток и небольшой размер ядер, как правило, вытянутых. Для клеток в крибриформной гиперплазии также характерны ядра небольшого размера с незаметными или едва заметными ядрышками, выявляется хорошо выраженный слой базальных клеток, окружающий комплексы из крибриформных структур. Основными критериями, позволяющими дифференцировать доброкачественную гиперплазию и ПИН низкой степени с ПИН высокой степени, являются слабая выраженность клеточной атипии и отсутствие заметных ядрышек. Ключевой признак, помогающий заподозрить реактивный характер клеточной атипии, - выраженная инфильтрация стромы и эпителия воспалительными элементами. Наличие уродливых полиморфных клеток, а также цитоплазматического пигмента характерно для структур семенных пузырьков и не свойственны вПИН.
Из злокачественных состояний основную трудность в настоящем исследовании вызвал дифференциальный диагноз вПИН и внутрипротоковой карциномы. Ключевым признаком интрадуктальной карциномы является присутствие атипичных эпительных клеток, заполняющих крупные ацинусы и протоки, с сохранением слоя базальных клеток. Кроме того, для постановки диагноза необходимо наличие солидного или плотного крибриформного роста с заполнением более 50% просвета, либо выраженной ядерной атипии с увеличением размеров ядер, не менее чем в 6 раз превосходящими нормальные, а также комендонекроза. Руководствуясь данными критериями, наличие внутрипротоковой карциномы было отмечено в 6 случаях из 99, во всех из них вблизи инвазивной аденокарциномы с градацией по шкале Глисона 4 балла, а в двух случаях – с градацией 5 баллов. Дифференциальный диагноз между вПИН и внутрипротоковой карциномой имеет большое прогностическое значение, поскольку последняя часто ассоциирована с продвинутыми стадиями аденокарциномы и является независимым предиктором клинического исхода заболевания, в связи с чем при обнаружении изолированной внутрипротоковой карциномы в игольных биоптатах может быть рекомендована повторная биопсия в ближайшие сроки. Кроме того, интрадуктальная аденокарцинома может быть принята не только за вПИН, но и за инвазивный рак, что может приводить к ошибочному завышению градации опухоли.
Иммуногистохимические особенности в диагностике вПИН В клинической практике небольшой объем материала, получаемый при пункционных биопсиях, а также различная степень выраженности выше описанных признаков, не всегда позволяют достоверно провести дифференциальную диагностику упомянутых доброкачественных и злокачественных процессов с вПИН, основываясь исключительно на морфологических критериях. Рекомендованный перечень иммуногистохимических маркеров для дифференциальной дигностики вПИН, доброкачественных процессов и рака включает три антитела – AMACR, p63 и 34betaЕ12. Доброкачественные процессы характеризуются отсутствием экспрессии AMACR и сохранением экспрессии маркеров базальных клеток (р63 и 34betaЕ12), вПИН – наличием экспрессии AMACR при сохранении маркеров базальных клеток, а аденокарцинома, в свою очередь, экспрессией AMACR при отсутствии экспрессии маркеров базальных клеток. Однако дааная панель является несовершенной, поскольку все из перечисленных антител могут давать как ложноположительное, так и ложноотрицательное окрашивание. Так в нашем исследовании в двух случаях аденокарцинома и вПИН характеризовались слабой экспрессией AMACR вплоть до полного отсутствия в отдельных структурах, и в двух случаях экспрессия AMACR отсутствовала в вПИН при умеренной экспрессии в раке. Ведущими специалистами было показано, что подобный иммунопрофиль характерен примерно для 18% аденокарцином [32].
В ходе настоящей работы были изучены особенности экспрессии белков – потенциальных новых маркеров для дифференциальной диагностики вПИН, доброкачественных состояний и рака, в частности, был проведен анализ экспрессии PTOV1, APOD, EPHA4, FASN и ERG. Данные белки были выбраны на основе опубликованных данных полногеномного профилирования транскриптома нормальной ткани предстательной железы, вПИН и рака. Оценка диагностической и прогностической ценности настоящей панели антител была проведена впервые.
Экспрессия ERG была отмечена в 46% аденокарцином и 26% вПИН, во всех структурах – в ядерном локусе. На наш взгляд, относительно низкая частота ERG-положительной вПИН свидетельствует в пользу ограниченной роли данного маркера в дифференциальном диагнозе между вПИН и имитирующими ее доброкачественными процессами. Согласно рекомендациям, приведенным в последнем пересмотре ВОЗ классификации новообразований предстательной железы [57], ERG может использоваться как дополнительный маркер при дифференциальном диагнозе между вПИН и внутрипроковой карциномой, однако полученные в ходе настоящего исследования данные показывают, что аномальная гиперэкспрессия данного белка наблюдается при обоих процессах и не является диагностически значимой.
Экспрессия ERG в вПИН вблизи рака служит свидетельством образования химерного гена TMPRSS2/ERG на раннем этапе канцерогенеза и подтверждает теорию опухолевого поля Уиллиса.
Отсутствие статистически значимых различий в нашей выборке между группами EGR+ и ERG- опухолей по стадии процесса и распространенности первичной опухоли не позволяет категорически высказаться о прогностическом значении данного белка, возможно необходимо изучение на большей группе пациентов.
В результате проведенного исследования нами было также отмечено, что высокая частота экспрессии APOD и FASN в вПИН и раке, а также отсутствие их экспрессии в подавляющем большинстве морфологически нормальных желез согласуется с данными транскриптомного анализа [18] и позволяет использовать данные белки в качестве дополнительных маркеров в дифференциальной диагностике новообразований предстательной железы. Кроме того, полученные данные согласуются с данными литературы о гиперэкспрессии APOD и FASN не только на уровне РНК, но и на уровне белков в аденокарциномах, в том числе аденокарциноме предстательной железы [47, 108].
APOD – гликопротеин, ассоциированный с липопротеинами высокой плотности, AMACR – фермент, катализирующий обращение R в S изомеры жирных кислот, что способствует дальнейшему пероксисомальному окислению с образование пероксида водорода, обладающего проканцерогенным эффектом [93, 127], FASN – фермент, также участвующий в жировом обмене, вовлеченный в метаболизм глюкозы до жирных кислот, в частности, необходимый на последнем этапе синтеза эндогенных жирных кислот и образовании пальмитата. И APOD и FASN являются компонентами путей активации LXR/RXR и FXR/RXR. Фарнезоидный X рецептор (FXR), печеночный X рецептор (LXR) и ретиноидный Х рецептор (RXR) относятся к семейству активируемых лигандами факторов транскрипции и играют ключевую роль в большом спектре физиологических процессов [73]. На клеточном уровне данные рецепторы осуществляют свои функции через взаимодействие с другими сигнальными путями, участвуя в контроле роста, дифференцировки, выживаемости и смерти клеток [14]. В свою очередь к активаторам FXR относятся желчные кислоты и их метаболиты, а участником сигнального пути биосинтеза желчных кислот является AMACR. Всё это демонстрирует тесную взаимосвязь AMACR, FASN и APOD в сигнальных и метаболических путях. Таким образом, опубликованные ранее данные совместно с полученными в ходе настоящего исследования результатами позволяют предполагать, что нарушение процессов метаболизма жирных кислот и гиперэкспрессия FASN и APOD в частности играют важную роль в канцерогенезе в предстательной железе. Косвенным доказательством участия данных белков в развитии злокачественных процессов является высокая частота экспрессии в предопухолевых и опухолевых поражениях и отсутствие экспрессии в нормальной ткани железы.