Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
2. Клиническая характеристика воспалительных изменений подвздошной кишки при ВЗК 15
2.1. Частота встречаемости илеитов при язвенном колите и болезни Крона 17
3. Морфологическая характеристика и клеточный состав кишечной стенки в норме и их патологические изменения при воспалительных заболеваниях кишечника 20
3.1. Гистологическая картина илеита при болезни Крона. Описание гранулематозного воспаления подвздошной кишки. Строение гранулем 21
3.2. Энтеральная нервная система и ее связь с гранулематозным воспалением при болезни Крона 22
3.3. Иммуногистохимическая характеристика кишечной стенки при болезни Крона 26
4. Патогенетические основы иммунного воспаления при болезни Крона 29
4.1. Иммунный ответ кишечной стенки - макрофагальное звено, участие Т-клеток (Т-хелперов 1 и 2 типа), продукция цитокинов, их роль в формирующемся воспалении тонкой кишки 29
4.2. Роль гормонов и нейропептидов в регуляции иммунного ответа при воспалительных заболевания кишечника 33
5. Заключение 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 38
Глава 3. Морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки подвздошной кишки 48
Глава 4. Изучение экспрессии хромогранина а и cd3 в слизистой оболочке подвздошной кишки 75
Глава 5. Экспрессия рецепторов к соматостатину в слизистой оболочке подвздошной кишки у больных с воспалительными заболеваниями кишечника 88
Заключение 115
Выводы 119
Практические рекомендации 120
Список литературы
- Частота встречаемости илеитов при язвенном колите и болезни Крона
- Энтеральная нервная система и ее связь с гранулематозным воспалением при болезни Крона
- Роль гормонов и нейропептидов в регуляции иммунного ответа при воспалительных заболевания кишечника
- Экспрессия рецепторов к соматостатину в слизистой оболочке подвздошной кишки у больных с воспалительными заболеваниями кишечника
Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), включающие в себя две нозологические формы с неизвестной этиологией и схожим патогенезом (язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК)), являются одной из самых изучаемых, и в то же время малоизученных проблем современной гастроэнтерологии. ВЗК отличаются хроническим рецидивирующим течением, быстрым развитием осложнений и высокой частотой внекишечных проявлений, что часто приводит к нетрудоспособности и инвалидизации больных и обуславливает социально-экономическую значимость этой группы заболеваний (В.Т. Ивашкин, О.С. Шифрин 2016). Большое значение имеет углубленное понимание патогенетических звеньев формирования иммунного воспаления как зоны приоритетного терапевтического воздействия. (D.C. Baumgart 2009; N.A. Molodecky и др. 2012, . Hovde, B.A. Moum 2012). Установлено, что ВЗК возникают в результате неадекватного иммунного ответа на кишечные антигены у генетически восприимчивых лиц. (D.C. Baumgart 2009; А.В. Ткачев, Л.С. Мкртчян 2011).
Важным аспектом в формировании ВЗК является нейроэндокринная регуляция пищеварительного тракта и функционирование энтеральной нервной системы (ЭНС). Эти механизмы в настоящее время малоизучены и перспективны с точки зрения определения ключевого звена патологического процесса (W.P. ter Beek 2008; С.Б. Александрова 2014).
При ВЗК наблюдается существенное нарушение иммунной системы кишки и
резкое изменение в экспрессии нейространсмиттеров, причем как со стороны ЭНС, так и
иммунных клеток – макрофагов и лимфоцитов. Увеличивается функциональная
активность нейроэндокринных клеток кишечника, наблюдается нарушение
про/противовоспалительного баланса, проявляясь в повышении высвобождения нейропептидов с провоспалительной активностью. Нейропептиды при ВЗК влияют на секрецию иммуноглобулинов, хемотаксис, фагоцитарную активность макрофагов и другие иммунные реакции эффекторных клеток. Тем не менее, несмотря на проведенные многочисленные исследования, область нейро-иммунных взаимодействий является перспективным направлением исследований, понимание которого имеет большое значение в разработке новых терапевтических методик при ВЗК (K.J. Gross, C. Pothoulakis 2007; D.L. Sigalet и др. 2007; L.M.M. Costes и др. 2013; С.Б. Александрова 2014).
В последнее время активно начала обсуждаться патогенетическая роль гормонов при ВЗК. Внимание исследователей привлекает соматостатин (СМС), показано, что СМС обладает массой биологических эффектов (модуляция синаптической передачи импульса, ингибирование эндокринной секреции, ингибирование пролиферации клеток и сократимости гладких мышц), обусловленных способностью непосредственного
взаимодействия со специфическими рецепторами, в том числе экспрессируемыми эпителиальными клетками кишечника. (Y. Chowers и др. 2000, N. Bronstein-Sitton 2006). В желудочно-кишечном тракте СМС характеризуется широким спектром влияний, среди которых ингибирование желудочной секреции соляной кислоты, абсорбция жидкости в кишечнике, секреция поджелудочной железы. (J. Van Bergeijk, J. Wilson 1997, G. Van Assche и др. 2012)
Исходя их вышеизложенного следует заключить, что понимание нейро-эндокринно-иммунных взаимодействий при БК может обеспечить новый взгляд на воспалительный процесс и расширить имеющиеся терапевтические подходы к ВЗК.
Цель исследования. Изучить морфологические проявления поражения
подвздошной кишки при болезни Крона с позиции нейроэндокринных и иммунных взаимодействий для улучшения понимания пато- и морфогенеза болезни Крона.
Задачи исследования:
-
Оценить диагностическую значимость морфологических критериев хронического илеита при болезни Крона.
-
Провести оценку макрофагально-гистиоцитарного звена иммунной системы слизистой оболочки подвздошной кишки.
-
Изучить количественные изменения состава межэпителиальных лимфоцитов слизистой оболочки подвздошной кишки при болезни Крона.
-
Представить количественную характеристику распределения нейроэндокринных клеток в эпителии слизистой оболочки подвздошной кишки при болезни Крона.
-
Изучить особенности клеток слизистой оболочки подвздошной кишки, экспрессирующих рецепторы соматостатина 2 типа.
Научная новизна
Впервые на материале илеобиопсий была показана патогенетическая роль при болезни Крона иммунологического (Т-клеточного) и нейроэндокринного факторов. Установлен однонаправленный характер изменений иммунной и эндокринной систем: увеличение в илеобиоптатах числа нейроэндокринных клеток и интраэпителиальных лимфоцитов при неклассифицированном колите и болезни Крона по сравнению с нормальной слизистой оболочкой. Обнаружена статистически значимая взаимосвязь между повышением нейроэндокринных клеток и CD3+ клеток в подвздошной кишке при хроническом илеите.
Впервые выявлены три варианта экспрессии рецепторов соматостатина 2-го типа: – преимущественно мембранная, цитоплазматическая и мембранно-цитоплазматическая.
Показано, что патогенез болезни Крона связан с нарушением нейро-эндокринно-иммунного взаимодействия. Начальные изменения нейропептидной регуляции могут представлять защитную реакцию на повреждение, а длительно существующие нарушения - способствовать возникновению и поддержанию хронического воспалительного процесса.
Практическая и теоретическая значимость
Признаками хронического илеита при болезни Крона являются структурная деформация ворсин и крипт, а также изменение состава и распределения воспалительного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки.
Наличие саркоидоподобных гранулем является наиболее характерной
отличительной чертой болезни Крона.
Повышение числа нейроэндокринных клеток и интраэпителиальных лимфоцитов можно использовать в качестве дополнительных диагностических критериев илеита при болезни Крона.
Положения, выносимые на защиту
1. Морфологические проявления хронического илеита при болезни Крона
характеризуются комплексными изменениями структуры слизистой оболочки в сочетании
с хроническим продуктивным воспалением.
2. Изменения в количественных характеристиках Т-клеточного звена иммунного
ответа и нейроэндокринных клеток подтверждают их роль при болезни Крона и носят
однонаправленный характер.
3. Характер экспрессии и повышение количества клеток, имеющих РС 2 типа при
болезни Крона, свидетельствуют о нарушении межклеточных нейроэндокринных и
иммунных взаимодействий в слизистой оболочке подвздошной кишки.
4. Начальные изменения нейропептидной регуляции при мембранном характере
экспрессии РС 2 типа представляют собой защитный механизм в ответ на повреждение.
Однако дальнейшие изменения в виде мембранно-цитоплазматической экспрессии РС 2
типа могут способствовать поддержанию хронического воспалительного процесса.
Личный вклад автора
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в получении исходных данных и научных экспериментах, разработке подходов к проведению иммуногистохимических реакций и выполнению морфометрических подсчетов. Автор непосредственно участвовал на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-морфологической реализации до обсуждения результатов. Автором лично
выполнена обработка и интерпретация полученных данных, подготовка основных публикаций по выполненной работе.
Внедрение результатов диссертации в практику
Результаты исследований используются при диагностике болезни Крона в центральном патологоанатомическом отделении Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре патологической анатомии имени академика А.И. Струкова.
Степень достоверности и апробация работы
Работа выполнена на высоком научно-методическом уровне с использованием современных морфологических и морфометрических методов исследования, адекватных поставленным задачам.
Результаты исследования докладывались и обсуждались на Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием, посвящённой 80-летию кафедр
патологической анатомии и патофизиологии БГМУ (Белгород, 2013), на 39 научной
сессии ЦНИИГ (Москва, 2013), на 40 научной сессии ЦНИИГ «Дискуссионные вопросы в
гастроэнтерологии» (Москва, 2014), на XXV Европейском патологическом конгрессе
(Лондон, 2014), на Всероссийской конференции, посвященной 155-летию кафедры
патологической анатомии Военно-медицинской академии им С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2014), на 20 Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2014), на Международном объединенном конгрессе ассоциации колопроктологов России (Москва, 2015), на 41 научной сессии ЦНИИГ «Расширяя границы» (Москва, 2014) на XXVI Европейском конгрессе патологов (Белград, 2015), на Всероссийской конференции с международным участием «Современные подходы в клинико-морфологической диагностике и лечении заболеваний человека» (Санкт-Петербург, 2015). В 2016 году на Пленуме российского общества патологоанатомов работа награждена дипломом. Апробация диссертации состоялась на научной конференции кафедры патологической анатомии им. акад. А.И. Струкова Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 21 сентября 2016 года.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертация соответствует паспорту научной специальности 14.03.02– патологическая анатомия, а также области исследования согласно пунктам 1, 2, 3 и 4.
Публикации результатов работы
По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 6 работ (5 статей и 1 тезис) в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 публикации в зарубежных изданиях.
Структура и объем диссертации
Частота встречаемости илеитов при язвенном колите и болезни Крона
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) аутоиммунного характера, к которым относится язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), занимают среди болезней желудочно-кишечного тракта особое место, находясь под пристальным вниманием ученых всего мира. В первую очередь, их исключительная значимость связана с неуклонным ростом заболеваемости и распространенности, тяжестью поражения, широтой внекишечных клинических проявлений, а также недостаточным, несмотря на ногочисленные исследования, пониманием этиологических и патогенетических механизмов, что влияет на эффективность разработки адекватных лечебных стратегий (D.C. Baumgart 2009; N.A. Molodecky и др. 2012, . Hovde, B.A. Moum 2012).
Эпидемиологические данные ВЗК характеризуются широкой географической изменчивостью. Происходящие изменения в экологической обстановке, воздействие факторов внешней среды, в том числе инфекций, характера питания, использования медикаментов, способствуют сдвигам в глобальной распространенности заболевания. Общемировая заболеваемость ВЗК в целом постепенно увеличивается, при этом ее наибольший рост наблюдается, первую очередь, западных развитых странах, то поддерживает гипотезу о взаимосвязи заболеваемости с «вестернизацией» образа жизни. Высокие показатели заболеваемости ВЗК отмечаются Великобритании, Европе, Канаде и Соединенных Штатах Америки, самые высокая распространенность ЯК и БК наблюдается в Европе и составляет 505 и 322 на 100 тысяч населения соответственно. Ежегодная заболеваемость БК наивысшая в Северной Америке (20,2 на 100 тысяч человек), а ЯК - в Европе (24,3 на 100 тысяч). Заболеваемость ВЗК в целом в Западной Европе в два раза выше, чем в Восточной. Отмечено, что в последние годы заболеваемость значительно увеличилась в странах Азии и на Ближнем Востоке (6,3 на 100 тысяч) (N.A. Molodecky и др. 2012, J. Burisch, P. Munkholm 2013, A. Ponder, M.D. Long 2013, S.C. Ng 2014).
В Российской Федерации в настоящее время единые данные о распространенности и заболеваемости ВЗК отсутствуют. По результатам немногочисленных эпидемиологических исследований, проведенных в регионах РФ, распространенность в европейской части России составляла в конце прошлого века 3,7 и 20,4 случаев на 100 тысяч для БК и ЯК соответственно. Заболеваемость БК при этом 0,3 на 100 тысяч, ЯК - 1,7 на 100 тысяч населения. В настоящее время ситуация в целом аналогична. Среди больных в РФ преобладают жители индустриально развитых населенных пунктов (городские жители), что соответствует общемировым данным. Особенностью нашей страны является значительное преобладание среди впервые выявленных ЯК и БК тяжелых форм заболевания, что обусловлено поздней диагностикой. Это приводит к значительным сложностям в лечении и, как следствие, высокой летальности среди таких пациентов (И.В. Никулина, А.Р. Златкина, Е.А. Белоусова 1997, Ю.М. Степанов, Н.С. Фёдорова 2010; А.В. Ткачев, Л.С. Мкртчян, К .Е. Никитина 2011, А.Ю. Барановский, Э.А. Кондрашина, А.М. Сегаль 2013; Е .С. Бодрягина, Д .И. Абдулганиева, А.Х. Одинцова 2013).
Установлено, что ВЗК возникают в результате неадекватного иммунного ответа на кишечные антигены у генетически восприимчивых лиц . При этом поражение преимущественно локализуется в желудочно-кишечном тракте , но может захватывать и другие системы и органы. Иммунологические нарушения затрагивают практически все ступени деятельности иммунной системы кишечника, от повреждения эпителия и его барьерной функции до патологии макрофагов, Т - и В -лимфоцитов (D.C. Baumgart 2009; А.В. Ткачев, Л .С. Мкртчян 2011). Важными факторами, способствующими формированию патологического иммунного ответа, являются раса и этнические особенности индивидуума, среда проживания (географическая характеристика), образ жизни, наличие инфекций (D.C. Baumgart 2009). Значимую роль играют генетические факторы (идентифицировано 163 гена/локуса, ассоциированных с высоким риском ВЗК). Интересно, что большая часть локусов риска ВЗК связана также с другими иммуно-опосредованными заболеваниями (W.E. Ек, М. D Amato, J. Halfvarson 2014). Другим доказанным патогенетическим механизмом ЯК и БК является формирование иммунного ответа на компоненты нормальной кишечной микрофлоры, то есть на микробные антигены. Влияние кишечных бактерий на развитие и проявления ВЗК является одним из важных направлений изучения патогенеза этих заболеваний (C.G. Yu, Q. Huang 2013,1. Koboziev и др. 2014). Еще одним немаловажным аспектом в формировании ВЗК является нейроэндокринная регуляция желудочно-кишечного та и функционирование энтеральной нервной системы. Эти механизмы в настоящее время малоизучены и перспективны с точки зрения определения ключевого звена патологического процесса (W.P. ter Веек 2008; СБ. Александрова 2014).
Патогенез ВЗК представляет собой сложный и многофакторный процесс, основанный на взаимодействии иммунных, генетических, нейроэндокринных механизмах регуляции, лучшее понимание которых может стать основной для определения точки приложения лечебного воздействия.
Энтеральная нервная система и ее связь с гранулематозным воспалением при болезни Крона
Морфологические методы
Материал, полученный от пациентов фиксировали в 10% забуференном формалине, обрабатывали в аппарате гистологической проводки фирмы «Leica» и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала не превышало, как правило, 48 часов. Затем готовили серийные срезы (не менее 10) толщиной 3-4 мкм, которые помещали на полилизиновые стекла (Leica, Германия) и инкубировали в термостате при температуре 370C в течении 12 часов . Далее срезы депарафинировали последовательно в ряде растворов, состоящим из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 80% и 70% спирта и дистиллированной воды. Затем препараты окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике.
Иммуногистохимические методы
Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах, изготовленных из биопсийного материала, взятого из подвздошной кишки. Иммуногистохимическое исследование проводилось на срезах толщиной 3 мкм, расположенных на стеклах с полилизиновым слоем (Leica, Германия). Исследование проводили на полностью автоматизированном иммуногистостейнере Leica Bond max (Германия), позволяющим депарафинизировать срезы, проводить инкубацию с антителами при постоянной заданной температуре, проводить энзиматическую демаскировку антигенов, высокотемпературную демаскировку антигенов в буферах pH 6,0 и 8,8, подкрашивать препараты гематоксилином. Исследование проводилось по стандартным протоколам, рекомендованным фирмой-производителем с антителами, представленными в таблице 4. Таблица 4. Список антител, использованных в работе. Антитело Источник получения Фирма- Разведение Положительный производи контроль тель Хромогранин А Мышиное/моноклональное Leica 1:100 Мозговой слой (маркер (Германия) надпочечника нейроэндокрин ных клеток) РС2 (антитело к Кроличье/моноклональное Еpitomics 1:200 Островковые рецепторам (США) клетки соматостатина 2 поджелудочной типа) железы CD3 (пан-Т- Мышиное/моноклональное Dako 1:100 Тимус клеточный (США) маркер) CD68 (маркер Мышиное/моноклональное Dako 1:200 Миндалина макрофагов- (США) гистиоцитов) Для иммуногистохимических реакций ставили положительные контроли, которые выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы производителя.
Экспрессия цитоплазматических маркеров Хромогранин А, CD3 проводилась путем подсчета позитивно окрашенных клеток. Учитывая особенности окрашивания цитоплазмы маркером CD68 (гранулярный характер окрашивания) оценка проводилась полуколичественно.
Экспрессия РС2 в клетках оценивалась следующим образом: мембранное, мембранно-цитоплазматическое и цитоплазматическое окрашивание. Морфометрические методы Все препараты были отсканированы на сканирующей системе Aperio фирмы Leica - уникальной системе получения высокоточных изображений гистологических препаратов, позволяющей создавать полноценное изображение, которое можно многократно увеличивать, просматривая отдельные фрагменты в в ысоком качестве максимально приближенному к тому, которое традиционно получают с помощью обычного микроскопа. Программная обработка изображения позволяет проводить качественный и количественный анализ препарата. Рисунок 1. Система сканирования гистологических препаратов Aperio (Leica, Германия). Подсчет CD3 позитивных окрашенных клеток (интраэпительных лимфоцитов) производился на поверхности слизистой одной ворсины (в среднем на 100 клеток), однако, учитывая вариабельность размера ворсин, все ворсины были разделены на две группы. В первую вошли крупные ворсины, поверхность которых насчитывала приблизительно 100 и более эпителиальных клеток (размер от 401 m и более) во вторую группу вошли ворсины среднего и маленького размера, эпителий которых насчитывал менее 100 клеток (от 400 m и менее). В результате было получено 2 цифровых показателя для каждой группы (БК, НК и контрольная группа), благодаря чему было проведено сравнение содержания Т-лимфоцитов в сравниваемых группах. Учитывая вариабельность расположения крипт в илеобиоптатах, подсчет количества хромогранин А позитивных нейроэндокринных клеток был проведен исходя из расчета на одну крипту и на ворсину подвздошной кишки, срезанных продольно. В результате было получено два цифровых показателя по каждому изучаемому случаю (для нормальной слизистой, в случае БК и НК), что позволило провести сравнение содержания НЭК в разных группах.
При подсчете РС2 позитивных клеток каждом из биоптатов было выбрано не менее 10 участков для подсчета позитивно окрашенных клеток. В связи с полиморфной картиной окрашиваемых позитивно структур, помимо общего числа РС2 позитивных клеток, был произведен так же подсчет клеток в зависимости от особенностей окрашивания. Так были выделены три группы: мембранный, цитоплазматический и мембранно-цитоплазматический типы окрашивания. Подсчет производился в среднем на 100 клеток слизистой, покрывающей поверхность ворсин.
Статистические методы
Статистическая обработка полученных результатов выполнена с помощью программы Microsoft Office Exсel 2006, STATISTICA for Windows v.6.0. Для полученных переменных при помощи построения гистограмм с расчетом среднего значения проверялось, подчиняю тся ли значения нормальному распределению. Поскольку полученные распределения значительно отличались от нормальных при анализе применялись непараметрические методы. Описание количественных данных представлено в виде медианы (Ме) и квартилей (25 и 75 процентили, Q25–75). Представление качественных признаков выполнено в виде долей. Сравнительный анализ двух независимых групп проведен по количественному признаку с помощью критерия Манна-Уитни.
Роль гормонов и нейропептидов в регуляции иммунного ответа при воспалительных заболевания кишечника
Результаты гистологического исследования биопсий подвздошной кишки не всегда позволяют установить диагноз БК, однако, по данным, полученным в ходе нашего исследования, в большинстве случаев они играют ключевую роль в диагностике БК - диагноз может быть поставлен на основе олько гистологических характеристик, даже лучае отсутствия обнаружения макроскопических изменений при эндоскопическом исследовании.
Для морфологической верификации необходимо проводить исследование т.н. «лестничных» биопсий подвздошной толстой кишки. При изучении биоптатов следует обращать особое внимание на обнаружение эпителиоидно-клеточных (саркоидных) гранулем, очаговых скоплений гистиоцитов (микрогранулем), одиночных гигантских клеток, повышение плотности лимфо-плазмоцитарного инфильтрата, структурную перестройку слизистой оболочки, повреждение и воспалительную инфильтрацию клеток покровного эпителия и эпителия крипт, появление слизистых желез в биоптатах подвздошной кишки (слизистая метаплазия) и появление клеток Панета в основании крипт в биоптатах толстой кишки (панетовская метаплазия), очаговый арактер обнаруживаемых изменений при сохранении ии повышении количества бокаловидных клеток (гиперкриния).
В 18 случаях обнаруживалась псевдопилорическая железистая метаплазия. Она заключалась в появлении в собственной пластинке слизистой оболочки желез, содержащих слизистые клетки и структурно напоминающие пилорические железы антрального отдела желудка. В связи с этим они получили название псевдопилорической метаплазии. Важным гистологическим критерием илеита при болезни Крона считается обнаружение псевдопилорической метаплазии, которая по данным литературы возникает на месте заживших эрозий и язв, в связи с чем одним из синонимов ее является «ульцерогенная» метаплазия. Тем самым можно предположить об имевшем место у больного ранее перенесенном эрозивно-язвенном илеите.
Исходя из принятых на сегодняшний день морфологических критериев, обнаружение гранулем гистологических срезах является ключевым гистологической диагностике БК, поэтому мы решили представить обнаруженные нами особенности гистологического строения гранулем пациентов с болезнью Крона.
Согласно определению гранулема - это скопление клеток моноцитарно-макрофагальной природы в сочетании с другими клетками воспаления (Freeman HJ., 2007). Макрофаги представлены крупными клетками с обильной эозинофильной цитоплазмой и крупным овальной формы ядром. Они образуют скопления - кластеры. Из-за их схожести с эпителиальными клетками они получили название эпителиоидных клеток. Согласно некоторым авторам классическая гранулема при БК содержит 5 или более эпителиоидных клеток в сочетании или без гигантских клеток. Клетки гранулемы могут иметь плотное компактное расположение и напоминать саркоидную гранулему, но чаще при БК отмечается более «свободное» рыхлое расположение клеток в гранулеме. Некроз в центре и казефикация гранулемы встречаются при БК крайне редко и заставляют заподозрить туберкулез. Гигантские клетки могут содержать кальцифицированные астероидные тельца (Rubio С.А., Orrego А., 2007). Другими клетками, выявляемыми в гранулеме являются лимфоциты. Обычно это CD4+ T клетки, экспрессирующие на своей поверхности рецептор CD28, который в свою очередь является лигандом для относящихся к семейству B7-связанных поверхностных белков-рецепторов CD80 (B7-1) и CD86 (B7-2) (Geboes K., 2000). Результаты иммуногистохимических исследований показали, что эпителиоидные летки могут кспрессировать антигены лавного комплекса гистосовместимости 2 касса (МНС II) (Pierik M. et al, 2005).
Необходимо отличать истинную гранулему при БК от микрогранулемы. Микрогранулема меньше по размерам и состоит из гистиоцитов, которые также как и эпителиоидные клетки, имеют моноцитарно-макрофагальное происхождение. Однако гистиоциты меньше х морфологические характеристики отличаются от таковых у эпителиоидных клеток типичной гранулемы при БК. В микрогранулеме также отмечается уменьшение количества гистиоцитов по сравнению с истинной гранулемой, в тоже же время число лимфоцитов оих образованиях иблизительно равно. Микрогранулема обычно локализуется в верхних отделах собственной пластинки слизистой оболочки (Капуллер Л.Л., Конович Е.А, 2012). Частота обнаружения микрогранулем при БК точно не определена, но скорее всего варьирует пределах 12-24%. Знчение микрогранулем и их подробное изучение пока еще не проводились. Чаще микрогранулемы обнаруживают в неактивную стадию болезни (Pierik M. et al, 2005). Гранулемы необходимо также дифференцировать гранулематозными крипт-абсцессами (крипт-абсцессы, содержащие гигантские клетки вместе с гистиоцитами или без них) и с криптолитическими гранулемами. Последние образуются в результате разрыва стенки крипты и характеризуются скоплением гистиоцитов в месте разрыва с наличием гигантских клеток или без них. Хотя криптолитические гранулемы чаще наблюдаются у больных БК, они были описаны и при ЯК.
Гранулемы могут обнаруживаться в неизмененной слизистой оболочке или на фоне воспалительных изменений последней. Они могут локализоваться о всех слоях стенки кишки, о аиболее часто - в подслизистой основе. Их можно обнаружить в регионарных лимфатических узлах приблизительно 20-50% случаев. Частота обнаружения гранулем при БК в нашей работе составила 30%, по данным литературы этот показатель варьирует в широких пределах от 3 до 85%, но крайне редко превышает 50-60%. Получаемые результаты во многом зависят от исследуемого материала (количество биоптатов, количество исследуемых срезов, биопсийный или хирургически удаленный материал). Для хирургически удаленного материала частота обнаружения гранулем варьирует в пределах 15-82%, а для эндоскопических биопсий этот показатель составляет 3-56%.
Экспрессия рецепторов к соматостатину в слизистой оболочке подвздошной кишки у больных с воспалительными заболеваниями кишечника
Таким образом, в результате проведенного исследования удалось установить достоверные различия между числом НЭК и интраэпителиальных лимфоцитов при ВЗК и в норме и получить статистически достоверную взаимосвязь между повышением НЭК и CD3+ клеток в подвздошной кишке и наличием воспалительного процесса. Таким образом, подтверждены существующие на сегодняшний день гипотезы о роли в возникновении и развитии ВЗК иммунологического (в частности -клеточного) и нейроэндокринного факторов. Помимо этого, проведенное исследование наглядно демонстрирует однонаправленный характер процессов, происходящих при ВЗК в иммунной и нейрогуморальной системах кишечника (увеличение как числа НЭК, так и количества интраэпителиальных лимфоцитов при ВЗК по сравнению с нормой). Результаты, полученные при оценке изменений числа НЭК, могут быть объяснены с позиций повышения регенераторной активности и пролиферации НЭК воспаленной подвздошной кишке. Повышенное количество НЭК может также отражать нарушения при воспалительных заболеваниях кишечника в нейроэндокринной системе кишечника.
Данные о количественной оценке числа интраэпителиальных лимфоцитов встречаются крайне редко. По результатам немногочисленных исследований, посвященных количественной оценке числа Т-клеток в подвздошной кишке, было установлено, что при лимфоцитарном и коллагенозном колитах число интраэпителиальных лимфоцитов составляет от 0 до 4 (H. Sapp и др. 2002, V. Padmanabhan и др. 2003) клеток. Количественные данные, касающиеся изменений в местном Т-клеточном иммунитете при ВЗК отсутствуют.
В результате проведенного исследования, при подсчете интраэпителиальных Т-лимфоцитов на поверхности ворсин было отмечено, что их число значительно выше при БК и НК, по сравнению с нормой, что подтверждает роль Т-клеточного звена в возникновении и развитии БК. При сравнении числа интраэпителиальных лимфоцитов на 100 и более эпителиальных клеток ворсины в контрольной группе, с результатами ранее проведенного исследования по изучению CD3+ клеток у здоровых людей в илеобиоптатах (Y.Zhang, и др. 2014) количество Т-лимфоцитов, обнаруженных в норме в проведенном исследовании, оказалось значительно выше. Столь существенные различия могут быть связаны различными подходами к подсчету CD3 позитивно окрашенных клеток, а так же с разницей в выборе ворсин для подсчета.
Исследование показало, что изучаемые маркеры можно использовать в качестве дополнительных признаков для морфологической диагностики БК в илеобиоптатах. Одновременное увеличение НЭК и Т-клеток при проведении ИГХ исследования илеобиоптатов с антителами к Хромогранину А и к CD3 свидетельствует о развитии воспалительной реакции. При количественной оценке данных критериев целесообразно использовать следующие реверсные значения: при подсчете НЭК среди эпителия одной ворсины или крипты, срезанной продольно, число окрашенных антителом к Хромогранину А клеток 10 следует рассматривать, как подозрительный в отношении возникновения ВЗК критерий, и должно насторожить морфолога. Количество НЭК в илеобиоптатах 20 можно считать диагностическим критерием, и в случае сомнений в диагнозе, склоняться в пользу ВЗК. Повышение числа Хромогранин А позитивно окрашенных клеток должно сочетаться с увеличением интраэпителиальных Т-лимфоцитов. Однако, как показывают полученные данные, различия при подсчете числа интраэпителиальных Т-лимфоцитов при ВЗК и у здоровых пациентов более очевидны при подсчете СОЗ+клеток на 100 и более энтероцитов одной ворсины (при размере ворсины от 401 т и более). В этом случае число положительно окрашенных при ИГХ исследовании клеток 30 следует считать подозрительным отношении ВЗК, а количество интраэпителиальных Т-лимфоцитов 40 - можно считать диагностическим.
В результате проведенного исследования не удалось установить достоверных различий между числом исследуемых маркеров при БК и НК. Этот факт можно объяснить тем, что при изучении илеобиоптатов в случае, когда диагноз не совсем ясен, многие морфологи ставят диагноз НК при малейшем сомнении по поводу наличия у пациента БК. То есть можно предположить, что основная масса случаев, обозначенных, как НК, на самом деле являются БК. Помимо этого , полученные результаты еще раз подтверждают общность данных заболеваний и, возможно, ставит под вопрос правомерность использования диагноза НК. Однако как при расчете НЭК, так и интраэпителиальных Т -лимфоцитов, при НК было выявлено незначительное превышение обоих показателей по сравнению с БК. Данные изменения могут быть объяснены тем, что случаи, при которых диагностируется НК, являются первой манифестацией аутоиммунного воспалительного процесса при БК. То есть к моменту получения илеобиоптатов, выраженные морфологические изменения, характерные для классической картины БК, еще не успели развиться, а острота воспаления, напротив, находится на своем пике. Таким образом, можно предположить, что Н К является первым проявлением ВЗК и в случае поражения подвздошной кишки, можно с большой вероятностью говорить о диагнозе БК.