Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Проблема катетер-ассоциированных инфекций 15
1.2. Этиология и патогенез катетер-ассоциированных инфекций 15
1.3. Классификация катетер-ассоциированных инфекций 19
1.4. Значение материал катетера и его обработки в развитии катетер-ассоциированных инфекций 20
1.5. Проблема моделирование патологических процессов и возможности моделирования катетер-ассоциированной инфекции .. 22
1.6. Моделирование катетер-ассоциированной инфекции 23
1.7. Реакция окружающих тканей на повреждение при моделировании катетер-ассоциированных инфекций 27
1.8. Антибактериальные пептиды 31
1.9. Механизм действия антибактериальных пептидов на бактерии 33
1.10. Воздействие антибактериальных пептидов на бактериальные пленки 34
1.11. Возможности применения антибактериальных пептидов 35
1.12. Низкомолекулярный катионный пептид варнерин 37
1.13. Заключение 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1. Лабораторные животные 41
2.2. Изучение процесса образования биопленок на венозных катетерах.. 41
2.3. Моделирование катетер-ассоциированной инфекции в эксперименте 42
2.3.1. Определение дозы циклофосфамида, вызывающего иммуносупрессию 43
2.3.2. Моделирование катетер-ассоциированной инфекции на иммуносупрессированных животных 44
2.3.3. Моделирование катетер-ассоциированной инфекции у иммуносупрессированных животных на фоне действия низкомолекулярного катионного пептида варнерина 44
2.4. Морфологические методы исследования 47
2.5. Морфометрическое исследование 50
2.6. Статистический анализ 50
ГЛАВА 3. Морфологическая характеристика модели катетер-ассоциированной инфекции без иммуносупрессии и на фоне иммуносупрессии 52
3.1. Первая группа: морфологическая характеристика модели катетер ассоциированной инфекции у белых мышей с интактной иммунной системой 52
3.1.1. Первая подгруппа: имплантация животным отрезков стерильных катетеров 52
3.1.2. Вторая подгруппа: имплантация животным отрезков катетеров с предварительно выращенными на них биопленками стафилококков 54
3.1.3. Третья подгруппа: имплантация животным отрезков стерильных катетеров с однократным введением взвеси стафилококков в зону имплантации 57
3.1.4. Четвертая подгруппа: имплантация животным отрезков стерильных катетеров с ежесуточным введением взвесей стафилококков в зону имплантации 59
3.2. Вторая группа: морфологическая характеристика модели катетер ассоциированной инфекции белых мышей с иммуносупрессией 63
3.2.1. Первая подгруппа: имплантация животным отрезков стерильных
катетеров 63
3.2.2. Вторая подгруппа: имплантация животным отрезков катетеров с предварительно выращенными на них биопленками стафилококков 67
3.2.3. Третья подгруппа: имплантация животным отрезков стерильных катетеров с однократным введением взвеси стафилококков в зону имплантации 71
3.2.4. Четвертая подгруппа: имплантация животным отрезков стерильных катетеров с ежесуточным введением взвесей стафилококков в зону имплантации 74
ГЛАВА 4. Морфологическая характеристика модели катетер-ассоциированной инфекции на фоне иммуносупрессии при введении животным низкомолекулярного катионного пептида варнерина ... 82
4.1. Первая подгруппа: имплантация стерильных отрезков катетеров предварительно обработанных варнерином 82
4.2. Вторая подгруппа: имплантация отрезков катетеров с предварительно выращенными на них двухсуточными биопленками стафилококков и с ежесуточным введением варнерина 85
4.3. Третья подгруппа: имплантация предварительно обработанных варнерином отрезков катетеров и однократное введение взвеси стафилококков 89
4.4. Четвертая подгруппа: имплантация отрезков стерильных катетеров с ежесуточным введением взвесей стафилококков и варнерина 92
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 101
Выводы 118
Практические рекомендации 119
Список литературы
- Проблема моделирование патологических процессов и возможности моделирования катетер-ассоциированной инфекции
- Определение дозы циклофосфамида, вызывающего иммуносупрессию
- Первая подгруппа: имплантация животным отрезков стерильных катетеров
- Вторая подгруппа: имплантация отрезков катетеров с предварительно выращенными на них двухсуточными биопленками стафилококков и с ежесуточным введением варнерина
Введение к работе
Актуальность проблемы
Катетер-ассоциированные инфекции (КАИ) являются причиной более 60% госпитальных бактериемий и до 37% всех нозокомиальных инфекций в европейских странах (Mermel L. et al., 2001; Safdar N., Fine J., Maki D., 2005). Важнейшим следствием бактериального обсеменения установленных пациентам катетеров и имплантов является развитие сепсиса, частота которого по разным источникам достигает 20-55% (Mermel L. et al., 2001; Warren D. et al., 2001; Bouza E., 2004; Матвеева Е.Ю. и соавт., 2011; Бережанский Б.В., 2012).
В последнее время интерес исследователей к изучению проблем инфицирования имплантатов и катетеров связан с концепцией формирования биопленок бактерий на искусственных поверхностях (Costerton et al., 1978, 1999), как своего рода защитного механизма, обеспечивающего оптимальные возможности развития при прикреплении их к поверхностям различных материалов (Carper, H. T., et al., 1987; Knudsen, J. D., et al., 2000; Tsuji, M., M., et al., 2003; Li, D., et al., 2008).
Моделирование КАИ чаще всего осуществляется на лабораторных мышах.
При этом работы, целью которых являлась морфологическая оценка окружающих
катетер тканей – немногочисленны (Rupp M.E., et al., 1999; Tsuji, M.M., et al.,
2003; Hanke M.L., et al. 2012). Учитывая выраженное повышение устойчивости
бактерий в биопленках к антибиотикам, для предупреждения образования таких
структур и их расщепления в последние годы интенсивно исследуются
возможности применения новых химических препаратов (Грузина В.Д., 2003;
Похиленко В.Д., Перелыгин В.В., 2011; Hancock R.E., et al. 1998).
В лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и
генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН из сред культивирования
бактерий S. warneri IEGM KL-1 был выделен низкомолекулярный
антибактериальный катионный пептид варнерин. Молекулярная масса пептида
составляет 2999 Da, а в его составе обнаружено значительное количество остатков
лизина, что определяет выраженную катионную природу этого соединения и
высокое сродство к отрицательно заряженным поверхностям бактериальных клеток.
In vitro установлено, что бактерицидный эффект варнерина во многом,
обусловлен – диссипацией мембранного потенциала клеток различных родов
грамположительных бактерий, которая проявляется с первых минут его
взаимодействия с бактериальной клеткой (Коробов В.П. и соавт., 2010, 2011).
Однако до сих пор практически не исследованы особенности морфологических
проявлений местных воспалительных реакций при КАИ с экспериментальной
оценкой возможности применения низкомолекулярных катионных
антибактериальных пептидов природного происхождения, для подавления развития и функционирования биопленок на поверхностях имплантируемых медицинских устройств.
Цель исследования - морфологическая характеристика модели катетер-ассоциированной инфекции у лабораторных мышей с оценкой эффективности использования низкомолекулярного катионного антибактериального пептида варнерина.
Задачи исследования:
-
Создать модель катетер-ассоциированной стафилококковой инфекции у лабораторных мышей.
-
Изучить особенности местных воспалительных реакций на имплантацию катетеров, покрытых биопленками стафилококков, и при введении взвесей стафилококков в область имплантации отрезков стерильных катетеров.
-
Оценить влияние обусловленной циклофосфамидом иммуносупрессии на проявления местной воспалительной реакции окружающих отрезки катетеров тканей при различных условиях моделирования катетер-ассоциированной инфекции.
-
Провести морфологическую оценку эффективности использования
антибактериального пептида варнерина при различных видах
моделирования катетер-ассоциированной инфекции у лабораторных
мышей.
Научная новизна исследования
Разработана новая модель катетер-ассоциированной инфекции лабораторных мышей при различных условиях инфицирования отрезков сосудистых катетеров -с предварительно выращенными на фрагментах катетеров двухсуточными биопленками стафилококков и при введении взвесей стафилококков в области имплантации катетеров.
Проведена сравнительная морфологическая оценка характерных
воспалительных реакций тканей окружающих отрезки катетеров с биопленками стафилококков, а также при однократном и многократном введениях взвесей стафилококков в зону имплантации отрезков стерильных катетеров.
Установлены морфологические особенности воспалительной реакции в виде
низкого содержания основных клеточных элементов в тканях, окружающих
отрезки стерильных катетеров, и интенсивного роста скоплений
микроорганизмов при моделировании катетер-ассоциированной инфекции в условиях иммуносупрессии циклофосфамидом.
Впервые проведено изучение местной воспалительной реакции тканей мышей в области имплантации отрезков стерильных катетеров до и после применения низкомолекулярного катионного пептида варнерина. Доказана эффективность использования варнерина для подавления как предварительно сформированных на отрезках катетеров биопленок стафилококков, так и в условиях in vivo при введении бактериальных взвесей в области имплантации стерильных отрезков катетеров.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанная модель катетер-ассоциированной инфекции может быть
использована для изучения эффективности использования различных
антибактериальных препаратов для предупреждения формирования, подавления развития и функционирования биопленок коагулазонегативных стафилококков. Важным элементом моделирования катетер-ассоциированной инфекции у лабораторных мышей являлась необходимость супрессии их иммунной системы.
На лабораторных моделях выявлена эффективность использования низкомолекулярного катионного пептида варнерина как для предупреждения образования, так и для ингибирования развития на сосудистых катетерах биопленок коагулазонегативных стафилококков.
Положения диссертации, выносимые на защиту
-
Исследованиями морфологических проявлений воспалительных реакций лабораторных животных (белые мыши) на имплантацию стерильных отрезков сосудистых тефлоновых катетеров, а также со сформированными на них биопленками бактерий S.epidermidis 33, и при введении взвесей этих бактерий непосредственно в зону локализации отрезков стерильных катетеров установлено, что экссудативная фаза воспаления наиболее выражена при введении бактериальных суспензий непосредственно в ткани, окружающие импланты.
-
Формирование скоплений бактерий непосредственно на поверхностях отрезков катетеров наиболее выражено при иммуносупрессивном действии циклофосфамида.
-
Подавление иммунных реакций циклофосфамидом приводит к отчетливым различиям морфологических проявлений воспалительных реакций в разные сроки моделирования катетер-ассоциированной инфекции. Разработанная экспериментальная модель может быть полезной при исследовании антибактериальных свойств различных препаратов.
-
Использование низкомолекулярного катионного пептида варнерина при моделировании катетер-ассоциированной инфекции мышей ведет к уменьшению, вплоть до исчезновения, скоплений стафилококков в тканях, окружающих катетер, что свидетельствует о проявлении выраженных антибактериальных свойств этого низкомолекулярного катионного пептида in vivo.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Достоверность и обоснованность результатов и выводов диссертационной
работы подтверждается их репрезентативностью за счет изучения материалов
эксперимента от достаточного количества объектов исследования (88) с использованием адекватных методов статистического анализа.
Апробация работы проведена на расширенном заседании кафедр морфологического профиля ГБОУ ВПО «ПГМУ им. ак. Е.А. Вагнера» Минздрава России 02.12.15 г. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Санкт-Петербург, 2011), XXVII международной научно-практической конференции «Современная медицина: актуальные вопросы» (Новосибирск, 2014); Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России «Современные проблемы иммунофармакологии, биотехнологии и цитокиновой регуляции» (Санкт-Петербург, 2014), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 80-летию кафедр патологической анатомии и патофизиологии БГМУ (Уфа, 2014), ежегодных научных сессиях ПГМУ им. ак. Е.А.Вагнера (Пермь, 2012, 2013, 2014).
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А.Вагнера» Минздрава России (номер государственной регистрации – 0120.0800814). Автор лично участвовал в проведении экспериментов по созданию и использованию модели катетер-ассоциированной инфекции у мышей. Весь представленный в диссертации материал собран, обработан и проанализирован лично автором.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, из них в рецензируемых научных изданиях – 4, в других специализированных журналах и изданиях – 1, в материалах международных конгрессов – 2, в сборниках российских научных конференций – 5.
Объем и структура диссертации
Проблема моделирование патологических процессов и возможности моделирования катетер-ассоциированной инфекции
Спектр возбудителей катетер-ассоциированных инфекций довольно широк и зависит от таких факторов, как степень тяжести заболевания пациента, типов используемых катетеров, путей их инфицирования, санитарно эпидемиологическое состояние лечебных стационаров. Наиболее частой причиной бактериальной колонизации катетеров (до 90% случаев) является распространение микроорганизмов кожных покровов по каналам установленных катетеров на их наружной поверхности. В этом случае преобладающие в составе микрофлоры кожи коагулазонегативные стафилококки имеют преимущество в качестве инфицирующих агентов перед другими микроорганизмами [189, 210].
Ряд микроорганизмов способен прикрепляться к поверхностям катетеров за счет неспецифических механизмов адгезии. Отмечено также, что некоторые бактерии отличаются выраженными адгезивными свойствами, обусловленными наличием особых специфических рецепторов к белкам макроорганизмов, покрывающих поверхность введенных катетеров. Так, бактерии вида S.aureus и грибы рода Candida spp. обладают рецепторами к фибронектину, фибриногену и ламинину, а некоторые виды коагулазонегативных стафилококков обладают повышенной способностью связываться с фибронектином [5, 43]. Бактериальные пленки и биопленкообразование
Бактериальной пленкой или биопленкой называют тонкий слой микроорганизмов, импрегнированный секретированными ими полимерами, и адгезированный к органической или неорганической поверхностям [45, 46, 90, 129]. Биопленки представляют собой основной фенотип почти всех микроорганизмов в естественных условиях, обеспечивающий им лучшие условия защиты от неблагоприятных факторов внешней среды. Важно отметить, что биопленки могут быть образованы представителями разных видов и даже царств, включая грибы [45, 46, 72].
Способность болезнетворных бактерий формировать биопленки является одним из важнейших факторов патогенности, при реализации которого многократно повышается устойчивость микроорганизмов к действию факторов внешней среды, в том числе антибактериальных препаратов. Образование бактериальных биопленок на имплантируемых устройствах - катетерах, линзах, искусственных клапанах сердца и других является одной из главных причин развития бактериемии и сепсиса [13,72, 76, 90].
Начальным этапом колонизации имплантируемых устройств является неспецифическая адгезия микроорганизмов на поверхностях имплантата за счет, электростатических взаимодействий, сил Ван дер Ваальса, гидрофобных и водородных связей [72, 170]. Этот процесс носит обратимый характер и зависит от поверхностных характеристик материала имплантируемого устройства, свойств микроорганизмов и времени взаимодействия между ними. Например, катетеры, изготовленные из поливинилхлорида или полиэтилена менее устойчивы к микробной адгезии, чем изготовленные из тефлона, силикона или полиуретана [117]. Последующие пролиферация и созревание, приводят к формированию биопленки с 3D структурой, часто характеризующейся агломерацией бактерий в виде «гриба», окруженного внеклеточными компонентами и наполненными жидкостью каналами [45, 166]. Сформированная биопленка состоит из двух фаз: сессильной или неподвижной, состоящей из делящихся бактериальных клеток и межклеточного матрикса, и планктонной, или свободно взвешенной, которая собственно, ответственна за развитие клинических проявлений инфекции. Позднее кластеры бактерий могут отделяться от биопленки и диссеминировать в доступные части макроорганизма [43, 45].
Структура образованных на поверхностях катетеров биопленок обычно включает в себя многослойные скопления бактерий, представленных неподвижными и медленно делящимися в межклеточном матриксе клетками, а также свободными планктоннымибактериями, по-видимому, ответственными за диссеминацию и освоение новых пространств с развитием клинических симптомов катетер-ассоциированных инфекций. Межклеточный матрикс защищает бактерии в биопленках от гуморальных и клеточных факторов организма хозяина и значительно снижает диффузию внутрь биопленок антимикробных препаратов. Это резко повышает устойчивость бактерий в биопленках к другим лечебным препаратам, значительно снижая эффективность проявления их антибактериальных эффектов по сравнению с действием на планктонные бактерии [45, 46, 72, 210]. Важно отметить, что инфицированные биопленками катетеры часто являются источником стафилококкового сепсиса у новорожденных и иммуннокомпроментированных больных [46, 197].
Особое внимание привлекает способность бактерий в составе биопленок, проявлять чувство кворума или quorum sensing. Это понятие, впервые предложенное в 1994 году раскрывает восприятие бактериальными клетками оптимальных условий среды, наступающих при достижении микробной популяцией некоторой пороговой численности стимулирующей ускорение деления клеток и увеличения их численности, а также реакцию на эти изменения [13, 45, 72, 99, 145]. Quorum sensing представляет собой механизм, посредством которого осуществляются межклеточные взаимодействия и регулируются различные процессы, включая формирование биопленок, повышение устойчивости к антибактериальным агентам, контроль продукции внеклеточных факторов патогенности бактерий и обеспечение резистентности к факторам антиинфекционной защиты макроорганизма [72, 78, 104, 108, 170]. Механизмы кворума позволяют бактериям коллективно, на популяционном уровне регулировать экспрессию генов и синхронизировать поведение сообщества этих клеток, являясь своего рода их «нейронной» сетью. Ощущение кворума относят к общему регуляторному механизму, используемому многими бактериями для контроля плотности их популяции. Считается, что чувство кворума, во многом, позволяет сообществам бактерий функционировать подобно многоклеточному организму [13, 59, 78, 84, 184].
В литературе имеется ряд доказательств наличия бактериальных пленок на установленных катетерах, как на их внешней стороне, так и на внутренних поверхностях [98, 167]. При этом показано, что формирование пленок на катетерах, установленных на сроки менее 10 дней, наблюдается, в основном, на их наружных поверхностях [19, 117].
При непродолжительных сроках катетеризации наиболее частой причиной колонизации (70–90% случаев) является экстралюминарное распространение микроорганизмов кожных покровов через канал постановки катетера по его наружной поверхности. В этом случае преобладающие среди обитателей кожи коагулазонегативные стафилококки имеют некоторое преимущество перед другими микроорганизмами [117, 210].
Интралюминарному инфицированию способствует попадание микробов в просвет катетера, что обусловлено чаще всего нарушением асептики ухода за ним (в 10 – 50% случаев) [11, 168]. Более редко, в 3-10% происходит гематогенное обсеменение из отдаленных очагов инфекции [96, 119]. Этот путь инфицирования и микробной колонизации сосудистых устройств наиболее характерен для кандидемии у онкологических больных, получавших химиотерапию [55, 170]. Необходимо отметить, что бактериальное заселение катетеров возможно и как вследствие контаминации с инфицированными инфузионными растворами (менее 3% случаев) [18, 96].
При установке катетеров на более длительные сроки (10-30 дней) чаще всего происходит их тотальное интра- и экстралюминальное инфицирование с формированием биопленок как на наружных, так и на внутренних поверхностях установленных катетеров [19, 132, 171].
В ряде исследований показано, что лекарственные соединения, вводимые через центральный венозный катетер, могут способствовать образованию биопленок. Так, введение в катетер катехоламинов стимулирует рост коагулазонегативных стафилококков, который имеет дозозависимый характер [150].
Определение дозы циклофосфамида, вызывающего иммуносупрессию
Животные были разделены на три группы: мыши без иммуносупрессии (первая группа), мыши с иммуносупрессией циклофосфамидом (вторая группа) и иммуносупрессированные мыши с изучением антибактериальных эффектов варнерина (третья группа).
Наркотизированным животным (20% раствор Ксилазина «Interchemie» Нидерланды 0,15 мл/кг веса) сбривали шерсть на участке спины и глазным скальпелем делали прокол кожи. В образовавшийся раневой канал под кожу имплантировали фрагменты пластиковых катетеров длиной 1.0 см и кожные дефекты заклеивали медицинским клеем БФ-2. В зависимости от вида предварительной обработки фрагментов катетеров животных в каждой группе делили на подгруппы.
Первой подгруппе животных имплантировали отрезки стерильных катетеров. Второй подгруппе мышей - вводили отрезки катетеров с предварительно сформированными на них биопленками Staphylococcus epidermidis 33, полученными инкубацией катетеров в суспензиях этих бактерий (109 КОЕ/мл) в течение 48 ч при 37C. Третьей подгруппе животных вводили отрезки стерильных катетеров с последующим однократным подкожным инокулированием в операционную рану 0,5 мл суспензии бактерий Staphylococcus epidermidis 33, содержащей 109 КОЕ/мл. Четвертой подгруппе мышей - отрезки стерильных катетеров с последующим ежесуточным в течение трех дней введением в операционную рану 0,5 мл бактериальной суспензии той же концентрации.
Объектами морфологических исследований являлись участки мягких тканей в области имплантации отрезков катетеров. Забор материала для гистологического исследования производили в конце первых, вторых и третьих суток экспериментов.
Подбор дозы циклофосфамида для формирования иммуносупрессивного состояния у животных осуществляли на 8 мышах. В качестве источника циклофосфамида был использован препарат «Циклофосфан-ЛЭНС» быстрорастворимый («Veropharm», Россия). Содержимое ампулы – 200 мг лиофилизированного порошка циклофосфамида растворяли в 0,9% растворе натрия хлорида в концентрации 20 мг/1 мл и вводили мышам внутримышечно в дозах 100, 150 и 200 мг/кг. На шестые сутки после начала введения животных выводили из эксперимента и проводили измерение соотношения веса тимуса и веса самого животного. Исходя из полученных данных, наибольшее изменение веса вилочковой железы регистрировалось при введении максимальной из использованных доз иммунодепрессанта.
Анализ патоморфологических реакций тканей при катетер-ассоциированной инфекции на фоне развития иммуносупрессии проводили после 5 суточного введения иммунодепрессанта животным (27 мышей) в дозе 200 мг/кг, а затем проводили манипуляции аналогичные описанным выше с разделением на такие же группы.
Объектами морфологических исследований являлись участки мягких тканей вобласти имплантации отрезков катетеров. Забор материала для гистологического исследования производили в конце первых, вторых и третьих суток экспериментов.
В специальной серии экспериментов (24 мыши) морфологическую картину модели катетер-ассоциированной инфекции изучали в условиях иммуносупрессии на фоне введения животным низкомолекулярного катионного пептида варнерина. С этой целью использовали препарат пептида варнерина серии 54 (лаборатория биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УроРАН) с активностью 512 тысяч условных единиц (128 мг/мл). Часть катетеров подвергали предварительной обработке варнерином путем их помещения в раствор пептида на 60 минут, а затем катетеры переносили в стерильную чашку Петри и высушивали под ультрафиолетом (Микроцид, Россия). Указанную процедуру повторяли 5 раз, после чего отрезки катетеров имплантировали животным под кожу спины в той же зоне. В зависимости от особенностей предварительной обработки отрезков катетеров и способа применения варнерина животные были разделены на четыре подгруппы.
Части животных первой подгруппы имплантировали стерильные отрезки катетеров, предварительно обработанные варнерином, а остальным животным – отрезки стерильных катетеров с введением в зону имплантации 1 мл стерильного водного раствора препарата пептида. Животным второй подгруппы подкожно вводили отрезки катетеров со сформированными на них in vitro биопленками S. epidermidis 33 и в те же зоны ежесуточно вводили стерильный водный раствор варнерина в количестве 1 мл. В третьей подгруппе животным вводили предварительно обработанные пептидом отрезки стерильных катетеров, с последующим однократным инокулированием в операционную рану бактериальных суспензий в количестве – 0.5 мл (109 КОЕ/мл). Животным четвертой подгруппы вводили отрезки стерильных катетеров с последующим ежесуточным инъекцированием в операционные раны суспензий бактерий S. epidermidis 33 в количестве 0.5 мл и одновременно в эту же зону ежесуточно вводили раствор варнерина в количестве 1 мл. Объектами морфологических исследований являлись участки мягких тканей в области имплантации отрезков катетеров. Забор материала для гистологического исследования производили в конце первых, вторых и третьих суток экспериментов.
Первая подгруппа: имплантация животным отрезков стерильных катетеров
Макрофагально-гранулоцитарный коэффициент на первые сутки характеризовался величиной 0,87. При иммуногистохимической окраске лимфоцитов была получена отрицательная реакция на CD3 при положительной на CD20 (CD3-, CD20+). В клеточном инфильтрате также встречались единичные фибробласты. Окраска основным коричневым по Шубичу при изучении 20 полей зрения тканевых структур по периферии катетера всего выявила 10±2,4 негранулирующих тучных клеток, дающих характерное окрашивание, что свидетельствовало о начале воспалительного процесса. Иммуногистохимическим исследованием окружающих катетер тканей были выявлены положительные реакции на виментин и CD34 (Vimentin+, CD34+), свидетельствующие об индукции и высокой скорости регенераторных процессов у мышей (табл. 5).
На вторые и третьи сутки после оперативного вмешательства наблюдалось дальнейшее повышение количества макрофагов среди нейтрофилов и лимфоцитов (макрофагальная фаза). Макрофагально-гранулоцитарный коэффициент к третьим суткам становился равным 1,01. При этом также отмечалось абсолютное увеличение количества фибробластов более чем в 10 раз уже на вторые сутки, по сравнению с первыми сутками (p=0,005). Изменения количества лимфоцитов были разнонаправленными, как в абсолютных, так и в относительных значениях. На третьи сутки в зоне катетера выявлялось образование значительного количества грануляционной ткани, состоящей из тонких коллагеновых волокон, а также незначительного количества фибрина, тонкостенных сосудов и фибробластов, на долю которых приходилось 24±2,84% от состава клеточного инфильтрата. Все это свидетельствовало о наступлении фибропластической фазы воспаления (табл. 6,7).
Введение животным отрезков катетеров приводило к образованию вокруг него ограничительного вала, состоящего на первые сутки из слоя фибрина и клеток воспалительного инфильтрата, а на вторые-третьи сутки представленного грануляционной тканью с включениями лимфоцитов, макрофагов, фибробластов и нейтрофилов примерно в одинаковом процентном соотношении. Между клеточными элементами располагалась нежная сеть коллагеновых волокон. В первой подгруппе на первые сутки средняя толщина ограничительного вала вокруг катетера составляла - 27,0±1,13 мкм, на вторые сутки - 36,6±4,0 мкм, а на третьи сутки - 22,5±1,65 мкм (табл. 8). Увеличение толщины ограничительного вала на вторые сутки можно объяснить появлением в этот период богатой тонкостенными сосудами грануляционной ткани.
Данная патогистологическая картина и сроки смены фаз воспаления характерные для развития воспалительных реакций в близлежащих тканях на инородное тело в мягких тканях мышей, примерно соответствует описанной в работах других авторов [33, 42]. Отличия заключались в неравномерном распределении элементов клеточного состава в зависимости от развития фаз воспаления, что может быть объяснено характером физико-химических свойств инородного материала, высоким уровнем метаболических процессов в тканях мышей, и особенностями постановки эксперимента.
Во второй подгруппе при имплантации отрезков катетеров с предварительно выращенными на них двухсуточными биопленками бактерий S.epidermidis 33 обнаруживались характерные особенности состава клеточных инфильтратов окружающих имплантированный материал в различные сроки исследования.
Так, первые сутки зона воспалительного инфильтрата была довольно ярко выражена с преобладанием в нем нейтрофильных гранулоцитов, на долю которых приходилось 43±5,13%. Макрофагально-гранулоцитарный коэффициент на первые сутки был равен 0,34. В клеточном инфильтрате выявлялись также лимфоциты - 30±1,73%, макрофаги – 14,67±7,88%, фибробласты – 12,33±6,22% и значительное количество нитей фибрина.
На вторые сутки (в макрофагальную фазу) на поверхности отрезков катетеров отмечалось наличие небольших скоплений микроорганизмов, подтвержденное окраской по Броун-Хоппс. В клеточном инфильтрате определялись макрофаги (CD 68+) – 25,2±6,36%, нейтрофилы – 30,8±10,01%, лимфоциты (CD20+) – 27,8±10,97%, а также единичные плазматические клетки и небольшое количество фибробластов (Vimentin+) – 16,2±5,06%. При этом макрофагально-гранулоцитарный коэффициент на вторые сутки увеличивался до 0,81. При окраске основным коричневым по Шубичу в тканях вокруг катетера просмотром 20 полей зрения было выявлено 20±4,1 негранулирующих тучных клеток, дающих характерное окрашивание и расположенных диффузно, что свидетельствовало о выраженной тучноклеточной реакции, по сравнению с первой подгруппой. При иммуногистохимическом исследовании на CD34 окружающих отрезок катетера тканей была выявлена положительная реакция (CD34+) (рис. 2-5).
На третьи сутки в составе клеточного инфильтрата отмечалось достоверное возрастание содержания нейтрофилов и фибробластов по сравнению с первой подгруппой (p=0,042 и p=0,016 соответственно). Макрофагально гранулоцитарный коэффициент в результате увеличения количества нейтрофилов уменьшился до 0,28. Размеры скоплений микроорганизмов при окраске по Броун-Хоппс оставались прежними. При этом, ограничительный вал состоял из фибрина, грануляционной ткани (CD34+) и клеточных элементов, включающих фибробласты - 32,1±7,79%, нейтрофилы - 44,4±5,55%, макрофаги (CD 68+) – 12,7±3,81% и лимфоциты (CD20+) - 10,7±2,69% (рис. 6-7).
Толщина ограничительного вала вокруг отрезков катетеров достоверно увеличивалась при имплантации катетеров с предварительно выращенными на них двухсуточными биопленками S.epidermidis 33, в сравнении с первой подгруппой стерильных катетеров. Так, в первой подгруппе на первые сутки средняя толщина ограничительного вала составляла - 61,3±2,04 мкм, на вторые сутки - 49,6±2,98 мкм, на третьи сутки - 43,3±1,72 мкм (табл. 8).
Вторая подгруппа: имплантация отрезков катетеров с предварительно выращенными на них двухсуточными биопленками стафилококков и с ежесуточным введением варнерина
В первой подгруппе при имплантации мышами отерзков стерильных катетеров, предварительно обработанных варнерином, ответная реакция тканей животных характеризовалась последовательной сменой фаз воспаления вокруг отрезков катетеров в течение всего периода исследования. В первые сутки преобладала лейкоцитарная фаза с фибринозно—лейкоцитарной инфильтрацией и преобладанием в клеточном инфильтрате нейтрофилов – 60,7±5,45%, которых было достоверно больше по сравнению с контрольной подгруппой животных без введения пептида (p=0,008). При этом, в инфильтрате обнаруживались макрофаги, доля которых составляла 9,7±3,71% состава всего клеточного инфильтрата со значением макрофагально-гранулоцитарного коэффициента 0,15. Количество фибробластов в инфильтрате было крайне незначительно, достигая 3,0±3,0%. Содержание лимфоцитов в клеточном инфильтрате составляло 26,7±4,84%. Результаты иммуногистохимической окраски лимфоцитов на CD3 и CD20 были отрицательные (табл. 9-11, рис. 38-41).
На вторые сутки содержание нейтрофилов в инфильтрате снижалось до 30,7±10,82% с возрастанием макрофагально-гранулоцитарного коэффициента до 0,7. Данные изменения свидетельствовали о наступлении макрофагальной фазы воспалительного процесса. При иммуногистохимическом анализе окружающих катетер тканей на виментин и CD34 выявлялась отрицательная реакция в течение первых и вторых суток, в отличие от аналогичной подгруппы без применения варнерина, где первые двое суток она была положительная На третьи сутки регистрировалось большое количество элементов грануляционной ткани, представленных тонкими коллагенновыми волокнами, остатками фибрина, тонкостенными сосудами (CD34+), единичными плазматическими клетками и фибробластами (Vimentin +). Часть фибробластов была CD68+ и, возможно, мигрировала из дермы, что, в общем, свидетельствовало о наступлении фибропластической фазы, хотя количество самих фибробластов составляло всего 8,6±642% от всего состава клеточного инфильтрата. Среди лимфоцитов на вторые и третьи сутки была выявлена положительная реакция на CD3 и CD20, а количество самих лимфоцитов в течение всего срока эксперимента составляло, с небольшими колебаниями около 25% от состава клеточного инфильтрата (рис. 42-44).
При однократном введении антибактериального пептида варнерина в область имплантации стерильного катетера морфологическая картина соответствовала подгруппе с предварительной обработкой варнерином катетера. Вторая подгруппа: имплантация отрезков катетеров с предварительно выращенными на них двухсуточными биопленками стафилококков и с ежесуточным введением варнерина
Во второй подгруппе мышей после имплантации им катетеров с предварительно выращенными в течение двух суток бактериальных пленок, и ежесуточного введения варнерина в операционную зону в течение трех суток в протекании воспалительного процесса были выявлены следующие особенности.
В первые сутки после имплантации в операционной зоне отмечали отек и повышенное кровенаполнение окружающих отрезок катетера тканей с выпадением фибрина. Клеточный инфильтрат был представлен, в основном, нейтрофилами, содержание которых достигало 38,56±4,54% всего клеточного инфильтрата. В инфильтрате также определялось большое количество дегранулирующих тучных клеток и единичные плазматические клетки (рис. 45). При этом количество макрофагов было достоверно ниже, чем в препаратах аналогичной подгруппы животных без введения варнерина (p=0,024), составляя 21,9±3,88% от клеточного состава инфильтрата со значением макрофагально 86 гранулоцитарного коэффициента 0,56. В небольшом количестве также обнаруживались и фибробласты, составляя 16,7±3,3% клеток инфильтрата.
. Дегранулирующие тучные клетки в тканях окружающих отрезок катетера с предварительно выращенными биопленками и ежесуточным введением варнерина. 1 сутки (окраска гематоксилином и эозином, x 1000) На вторые сутки фибрин обнаруживался не только снаружи, но и в просвете катетера. При этом выявлялось очаговое скопление клеток – лимфоцитов (CD3-, CD20-), распадающихся с образованием «гнойных телец» нейтрофилов и скоплений микроорганизмов (рис. 46). По периферии отрезка катетера обнаруживались макрофаги (CD68+), фибробласты (Vimentin+) и единичные плазматические клетки (CD20-). При этом макрофагально гранулоцитарный коэффициент уменьшался до 0,39, за счет увеличения процентного содержания нейтрофильных гранулоцитов в инфильтрате (50,73±6,93%). Следует также отметить, что по сравнению с группой животных, которым пептид не вводился, количество фибробластов достоверно снижалось (p=0,002). При иммуногистохимическом исследовании окружающих отрезок катетера тканей выявлена положительная реакция на CD34. На третьи сутки экспериментов воспалительный инфильтрат был представлен лимфоцитами, макрофагами, нейтрофилами, единичными плазматическими клетками, а фибробласты, часть из которых была CD68+, формировали ограничительный вал вокруг отрезка катетера. При этом, их количество было достоверно ниже, чем в подгруппе без использования варнерина (p=0,033). Обращало на себя внимание отсутствие скоплений стафилококка (рис. 47). Иммуногистохимическое исследование инфильтрата выявило положительную реакцию на CD20 у части лимфоцитов, что позволило отнести их к B-лимфоцитам. Реакция на CD3 и CD34 была во всех случаях отрицательная, а реакция на виментин слабоположительная (Vimentin +/-). Макрофагально гранулоцитарный коэффициент в этих условиях снижался до 0,28, за счет уменьшения количества макрофагов в клеточном инфильтрате до 13,7±6,24% (рис. 48-49). Количество лимфоцитов (CD3-, CD20-) в течение трех суток, как и в предыдущей экспериментальной подгруппе мышей, составляло, с небольшими изменениями, около 20% от состава всего клеточного инфильтрата.