Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .13
1.1 Особенности беременностей, наступивших при применении вспомогательных репродуктивных технологий 13
1.2 Структурно-функциональная организация плаценты 16
1.3 Плацентарная недостаточность 23
1.4 Молекулярные маркеры функционального состояния плаценты 30
1.5 Состояние здоровья детей, родившихся при применении вспомогательных репродуктивных технологий 35
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 40
2.1 Характеристика исследуемого материала 40
2.2 Гистологический метод 41
2.3 Иммуногистохимический метод 42
2.4 Количественная оценка результатов исследования .45
2.5 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 46
2.6 Статистическая обработка результатов исследования .47
ГЛАВА 3. Результаты собственного исследования 48
3.1 Анализ анамнестических данных основной группы и группы сравнения 48
3.2 Гистологическое исследование последа .57
3.3 Иммуногистохимическое исследование экспрессии эндотелиального маркера CD34 в клетках ворсинчатого хориона 73
3.4 Иммуногистохимическое исследование экспрессии NOS-3 в ворсинчатом хорионе .77
3.5 Иммуногистохимическое исследование экспрессии HIF-1 в ворсинчатом хорионе 81 3.6 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия виллезного дерева .85
3.6.1 Экспрессия NOS-3 в ворсинчатом хорионе .85
3.6.2 Экспрессия CD 34 в ворсинчатом хорионе .87
3.6.3 Экспрессия HIF- 1 в ворсинчатом хорионе 89
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 91
Выводы 104
Практические рекомендации .106
Список литературы .
- Структурно-функциональная организация плаценты
- Иммуногистохимический метод
- Иммуногистохимическое исследование экспрессии эндотелиального маркера CD34 в клетках ворсинчатого хориона
- Экспрессия NOS-3 в ворсинчатом хорионе
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Бесплодный брак остается одной из важных медицинских, социальных, экономических и общегосударственных проблем. По данным Всемирной организации здравоохранения, его частота в разных регионах Российской
Федерации достигает 10-15,0% (2011г) (Кулаков В.И. с соавт. 2011). Поэтому
в современном обществе для решения проблемы бесплодия широко используются методы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в частности экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и перенос эмбриона (ПЭ) (Кулаков В.И. и соавт., 2001; Леваков С.А. и соавт., 2010; Овсянникова
Т. В.,2008).
Беременности, наступившие в результате ВРТ, имеют более высокий риск невынашивания, многоводия, формирования пороков развития плода, повышенный инфекционный индекс (Анохин Л. В. и соавт., 1998; Бессмертная B.C. и соавт., 2007) и, самое главное, формирование плацентарной недостаточности, влияющей на перинатальное благополучие (Цыганенко С. В. 2012, Буранова, Ф.Б. 2011). Это связано не только с исходным высоким уровнем экстрагенитальной патологии в этой группе пациенток, но и с нарушениями генеративной функции, значительную долю которой занимает патология эндометрия (Серова О.Ф. и соавт., 2008;
Battistelli, M. Et al., 2004).
Центральное место в формировании будущего здоровья и физического
развития ребенка играет плацента. Она представляет собой временный
многофункциональный орган, обеспечивающий нормальную
внутриутробную жизнь плода. Это достигается уникальной структурной
особенностью плаценты, важнейшими частями которой являются
ворсинчатый хорион, базальная и хориальная пластины.
Ключевым звеном в развитии плацентарной недостаточности является
нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного
кровообращения, в основе которого заложены патологические
морфофункциональные изменения сосудистой системы и отдельных ее компонентов. Дисфункция плаценты при плацентарной недостаточности приводит к нарушению нормального функционирования системы мать-плацента-плод со значительными изменениями в ней основных видов обмена веществ (Милованов, А.П. 1999; Сидорова, И.С. 2005) Это проявляется в снижении защитно-приспособительных возможностей организма плода и развитии гипоксии. В ответ на гипоксию в организме плода происходит компенсаторное перераспределение кровотока, приводящее в свою очередь к повреждениям микроциркуляторного русла различных органов и систем. В органах плода наблюдаются дистрофические изменения, приводящие к нарушению их развитии (Айламазян, Э. К. и соавт. 2009; Стрижков, А.Н. и соавт., 2013). В дальнейшем у таких детей повышается риск развития хронических заболеваний. Анализ литературы показал, что дети, рожденные
от матерей с плацентарной недостаточностью, имеют высокий риск развития неврологических и психических заболеваний. Плацентарная недостаточность способствует повышению перинатальной заболеваемости, смертности и инвалидизации детей. При этом известно, что в 70% причина детской инвалидизации связана с перинатальной патологией, в том числе до 36% - с перинатальной энцефалопатией (Кравченко, Е.Н. и соавт., 2009).
Степень разработанности темы исследования
Изучению плаценты посвящено огромное количество публикаций, проводится большое число исследований на всех уровнях её организации и при различных патологических состояниях (хроническая плацентарная недостаточность, преэклампсия, инфекционная патология, плацента при сахарном диабете, при бронхиальной астме и др.).
В настоящее время изучение плацент при беременности, наступившей после применения методов ВРТ, проводится в основном в зарубежных лабораториях. Авторы обнаруживают изменения на ультраструктурном уровне, патологические изменения в функциях плацентарных генов, особое внимание уделяется исследованиям процесса имплантации и раннего
эмбрионального периода (Abby C. et al., 2009; Choux C. et al., 2015; Zhang, Y. et
al., 2010). Однако данных о структурно-функциональной организации плаценты после ВРТ на доношенном сроке очень немного.
В связи с широким применением методов ВРТ для лечения бесплодия возникает вопрос о полноценности плацентарного комплекса при индуцированных беременностях. Так как плацента представляет собой важный орган, обеспечивающий полноценную жизнедеятельность плода во время внутриутробной жизни, формирующий основу его будущего здоровья, возникает закономерный вопрос о полноценности детей, рожденных после применения методов ВРТ. В литературе по этому вопросу существуют крайне разноречивые данные (Корсак, В.С., 2014; Мансимова, В.О., 2011; Рищук, С.В. и сооавт., 2014).
Развитие и мировое внедрение в повседневную практику методов иммуногистохимии открывает возможности для углубленного понимания структурно-функциональной организации плаценты с позиций экспрессии в ней многочисленных сигнальных молекул, регулирующих ее различные функции. В связи с этим представляет большой интерес изучение плаценты после индуцированных беременностей с целью сравнительной оценки её полноценности по сравнению с плацентами при естественно наступившей беременности.
Цель исследования: провести комплексное исследование
морфологических и иммуногистохимических особенностей плаценты при использовании ВРТ.
Задачи исследования
1. Провести сравнительную оценку особенностей гистологического
строения плацент при беременности после ВРТ и при естественно наступившей беременности.
2. Изучить особенности экспрессии маркера эндотелиальных клеток
CD34 в сосудистом русле виллезного дерева плаценты при беременности
после ВРТ.
-
Верифицировать экспрессию эндотелиальной NO-синтазы в ворсинчатом хорионе плацент после.
-
Исследовать экспрессию маркера гипоксии HIF-1а, в ворсинчатом хорионе плацент после ВРТ.
-
Оценить морфофункциональные особенности плаценты и провести ретроспективное изучение массо-метрических показателей плацент и детей при беременности, наступившей с помощью методов ВРТ.
Научная новизна исследования
Впервые проведено комплексное гистологическое и
иммуногистохимическое исследование плацент при беременности,
наступившей после применения методов ВРТ, а также для более подробного послойного изучения материала применена конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
Впервые проведено иммуногистохимическое исследование плацент при беременности после ВРТ с оценкой экспрессии эндотелиального маркера CD 34 и экспрессии эндотелиальной NO-синтазы. При этом установлено снижение экспрессии данных маркеров по сравнению с плацентами при естественно наступившей беременности.
Впервые выполнено иммуногистохимическое исследование с оценкой экспрессии гипоксия-индуцибельного фактора (HIF-1) в плацентах от беременности после ВРТ и установлено его повышение по сравнению с беременностями, наступившими естественным путем.
Полученные данные позволили впервые установить морфо-функциональную неполноценность плацент при применении ВРТ.
Теоретическая и практическая значимость
В результате проведенного исследования плацент при беременности после ВРТ, показана высокая информативная значимость комплексного подхода к изучению гистологических и иммуногистохимических показателей при оценке патологических изменений в ворсинчатом хорионе.
Полученные при этом данные иммуногистохимического исследования о снижении экспрессии эндотелиального маркера CD 34 и эндотелиальной NO-синтазы в ворсинчатом хорионе плацент после применения методов ВРТ, позволяют предположить их ведущую роль в отражении механизмов нарушения функциональной активности сосудистого русла и повышении сосудистого сопротивления в системе плацентарного кровообращения.
Повышение экспрессии HIF-1 в плацентах после применения методов ВРТ по сравнению с плацентами при естественно наступившей беременности, свидетельствует о кислородной недостаточности плаценты и, следовательно, развитии гипоксии плода.
Оценка изменений экспрессии ключевых сигнальных молекул в
плаценте позволяет прогнозировать возможное развитие функциональных и
патологических процессов в постнатальном периоде ребенка. Кроме того,
проведенные исследования позволяют рекомендовать проведение
профилактических и лечебных мероприятий направленных на
предотвращение формирования плацентарной недостаточности и другой
патологии, связанной с нарушением функциональной активности
сосудистого русла в плацентах во время беременности после
вспомогательных репродуктивных технологий.
Методология и методы исследования
Методология диссертационного исследования была основана на
использовании основных методов научного познания (обобщение, логика,
анализ-синтез и др.). Методологическая и теоретическая основа
исследования была основана на использовании трудов отечественных и зарубежных авторов по патологической анатомии, молекулярной биологии, гинекологии и репродуктологии.
В исследовательской работе были использованы клинические, гистологические, иммуногистохимические, молекулярно-морфологические, морфометрические методы исследования, а также методы статистического анализа данных.
Объектом исследования послужили плаценты от беременности доношенного срока после применения методов ВРТ, разделенные на подгруппы с выделением первичного и вторичного бесплодия, а также плаценты от беременности, наступившей естественным путем. Предмет исследования - ворсинчатый хорион плаценты.
Положения, выносимые на защиту
1. При морфологическом исследовании плацент от женщин,
страдающих вторичным бесплодием, при беременности, наступившей с
помощью ВРТ, отмечается повышение частоты встречаемости ХПН. В
плацентах у женщин с первичным бесплодием при беременности после ВРТ
и спонтанной беременности, морфологических различий выявлено не было.
2. При иммуногистохимическом исследовании плацент после ВРТ,
отмечается достоверное снижение экспрессии маркеров CD34 и NOS-3 в
ворсинчатом хорионе, что свидетельствует о нарушении функциональной
активности сосудистого русла и повышении сосудистого сопротивления в
системе плацентарного кровообращения. Подобные нарушения синтеза
указанных сигнальных молекул могут привести к осложнениям течения
беременности с высоким риском развития ХПН.
3. Повышение экспрессии маркера HIF-1 в плацентах после ВРТ по
сравнению с плацентами при спонтанной беременности свидетельствует о
кислородной недостаточности в плацентарной системе, что может стать
причиной развития гипоксии, а в дальнейшем и ЗВУР плода.
4. Выявленные нарушения экспрессии ключевых сигнальных молекул свидетельствуют о возможности возникновения патологических процессов в перинатальном и постнатальном периодах развития ребенка, даже при отсутствии достоверных отличий в массах плацент, детей и их состояния на момент рождения.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Результаты диссертационного исследования достоверны и обоснованы,
что обеспечивается репрезентативностью и достаточным объемом
изученного материала (n=98) и использованием адекватных решению
поставленных задач методов: анамнестического, гистологического,
иммуногистохимического; корректным применением современных
статистических методов обработки полученных результатов с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.
Материалы диссертационного исследования доложены на VI ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых – 2015» (Санкт-Петербург,
2015).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Личный вклад автора в проведенном исследовании
Лично автором проанализированы и обобщены данные литературы по изучаемой теме. Самостоятельно обработаны истории родов пациенток. Проведены гистологические, иммуногистохимические и морфометрические исследования плацент с описанием и обобщением результатов. Личный вклад автора составляет выполнено 90% работы.
Объем и структура диссертации.
Структурно-функциональная организация плаценты
Проблема бесплодия в современном обществе с каждым годом становится все более актуальной. Бесплодие в России по данным эпидемиологических исследований колеблется от 8,0 до 17,8% в разных регионах [31,54].
Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) в настоящее время единственный способ медицинской помощи при неизлечимых формах бесплодия у супружеских пар [8,41,79].
К методам ВРТ относятся: экстракoрпоральное оплодотворение (ЭКО) и перенoс эмбриона (ПЭ) в полость матки, инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ), криоконсервация спермы, ооцитов, эмбрионов, ткани яичника, донорство спермы, ооцитов и эмбрионов, суррогатное материнство, предимплантационная диагностика, получение сперматозоидов для ИКСИ, искусственная инсеминация обогащенной спермой мужа (ИОСМ) или донора (ИОСД) [41,79].
Среди видов бесплодия выделяют женское (на него приходится около 50%), мужское (35%), а также общие факторы бесплодия в браке (15%). [67] У каждого их супругов бесплодие может быть первичным, если беременность никогда не наступала, и вторичным, если была хотя бы одна беременность вне зависимости от её исхода (роды, выкидыш, внематочная беременность, аборт) [81,102,112].
По данным Сухаревой И. А. и Фаритовой А. В. женское бесплодие обусловлено такими заболеваниями как: эндокринные нарушения, эндометриоз, воспалительные изменения во внутренних половых органах, склерокистоз яичников, аномалии матки и маточных труб, тубоовариальные образования, фибромиома матки, спайки в малом тазу и аномалии кариотипа. Причины мужского бесплодия связаны с воспалительными заболеваниями, передающиеся половым путем, развитием идиопатической олигозоопермии и астенозооспермии, варикоцеле, первичные тестикулярные нарушения, крипторхизм, обтурация семявыносящих путей, гонадотропная недостаточность, аномалии кариотипа, системные болезни, а также различные иммунные и ятрогенные причины. При общем бесплодии в браке, одной из главных причин становятся воспалительные изменения в половой системе. [56,102].
Бесплодие, обусловленное трубно-перитонеальным фактором, занимает лидирующие позиции в структуре бесплодного брака, составляя 35-60% от всех форм бесплодия. При этом на долю трубного фактора приходится 35-40%, а частота встречаемости перитонеальной формы колеблется в пределах 9-34,0% случаев [103]. Частота патологических изменений маточных труб среди первичного бесплодия (29,7-70,0%) несколько ниже, чем при вторичном бесплодии (42,4 -83,1%). [41,50,53].
Ведущей причиной, приводящей к повреждению маточных труб в первую очередь, является перенесенные заболевания воспалительного генеза в органах малого таза, приводящие к спаечным процессам в малом тазу и возникновению трубно-перитoнеального бесплодия [46]. Проводимые различные внутриматочные манипуляции (аборты, выскабливания эндометрия и т.д.) на органах малого таза и брюшнoй полости, также могут привести к воспалительным процессам [52,56,103].
У женщин при трубнo-перитонеальной форме бесплодия в 35,5% случаев выявляется хронический эндометрит [46]. При этом возникают характерные изменения в эндометрии: нарушение взаимодействий между клетками, повреждение экстрацеллюлярного матрикса, периваскулярное склерозирование стромы, нарушение ангиоахитектоники ткани, дисфункция стероидных рецепторов, появление противовоспалительных цитокинов, ишемия ткани, что способствует снижению рецептивности эндометрия и нарушению процессов имплантации и плацентации [50, 104]. Частота встречаемости эндометриоза при бесплодии может достигать 59,0% [97,137,168,190]. Эндометриоз представляет собой генетически детерминированное, дисгормональное заболевание, которое характеризуется развитием эктопического эндометрия с пролиферативной и клеточной активностью [51]. При данной патологии, основным фактором, играющим роль в снижении фертильности, является нарушение процессов созревания ооцита и имплантации.
Другой частой причиной бесплодия являются доброкачественные гиперпластические процессы в эндометрии, такие как полипы и гиперплазия эндометрия, а также синехии полости матки и миоматозные узлы [50].
По данным литературы эффективность программы ЭКО находится в пределах 20-40%, чаще всего для ее оценки используют показатели количества выписанных из родильного дома детей, рожденных при помощи ВРТ. Этот показатель в среднем составляет от 6 до 19% из расчета на перенос эмбрионов и 55–79,0% — на число клинически наступивших беременностей [31, 64]. Таким образом, при лечении мужского и женского бесплодия главным показателем успешного применения ВРТ является состояние здоровья рожденных детей.
Внутриутробное развитие плода при применении ВРТ происходит в условиях имеющие отличия от физиологической нормы. Это связано с воздействием на плод множественных патологических факторов: со стороны материнского организма - поздний репродуктивный возраст, отягченный акушерско-гинекологический анамнез, наличие соматических заболеваний, воздействие больших доз гормонов и развитие многоплодия [64].
По данным разных авторов, угроза прерывания индуцированной беременности достигает 50% [30,31], а частота преждевременных род колеблется от 30 до 60% случаев, что намного выше данного показателя в популяции (6%) [7, 64].
Иммуногистохимический метод
Нельзя не отметить большого количества исследований, проводимых для определения влияния интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), применяемого в ВРТ при мужском бесплодии. При этом в литературе отмечается большое количество негативных отзывов о последствиях данного метода и его отрицательном влиянии на здоровье детей [43,64]. Это связано с инвазивностью метода и использования сперматозоидов «низкого качества». Также были получены данные, указывающие на то, что более длительная культивация эмбриона может привести к возникновению осложнений беременности [43,167], а криоконсервация гамет и эмбрионов может оказывать негативное воздействие на эпигенетическую регуляцию при процедурах замораживания и размораживания [43, 135.162].
Проведенные исследования по применению метода ИКСИ демонстрируют достаточно противоречивые данные. Одни данные не подтверждают негативного влияния ИКСИ [127,161,162], другие же отражают высокую частоту развития врожденных аномалий развития, аномалий транслокаций, возникших впервые у плодов после применения данного метода [43,64,73,127,162]. Высокая частота хромосомных, в частности половых, аномалий у новорождённых вероятнее всего передается от отца, что по данным D. Meschede, является признаком, который наследуется, мужское бесплодие передается потомству, и повышает риск развития бесплодия [64, 167]. В настоящее время уделяется внимание таким исследованиям как изучение частоты возникновения онкологических заболеваний у детей после ВРТ. Проводились масштабные исследования этого вопроса в разных странах и получены противоречащие результаты. Так в Великобритании были проанализированы данные о детях с первого января 1992 года по тридцать первое декабря 2008 года. Оценка полученных результатов показала, что общий риск развития нейробластомы, лейкемии, опухолей центральной нервной системы, ретинобластомы и герминогенных опухолей статистически не имела отличий среди детей, рожденных с применением ЭКО и детей из популяции. Отмечалось возрастание числа случаев гепатобластомы у детей с низким весом при рождении. Так же отмечался риск развития рабдомиосарком, повышающийся при многоплодной беременности. [39].
Исследователи из университета Лунда изучили данные о детях после ВРТ с 1982 по 2005 год. Экстракорпоральное оплодотворение повышает риск раннего развития опухолей у детей на 42%. Было также установлено, что у 7 из 53 детей с диагнозом злокачественных заболеваний также наблюдались пороки внутриутробного развития и синдром Дауна. [39,138, 183].
Данные отечественных исследований не отличаются такой масштабной выборкой по сравнению с зарубежными коллегами. Исследования 529 беременностей после ЭКО, где живыми родилось 335 детей, проводимое с 1995 по 1999 годы, показало увеличение доли маловесных детей при многоплодных беременностях (двойни и тройни), повышение показателей перинатальной смертности при преждевременных родах в сравнении со срочными родами и высокую частоту внутриутробной гипоксии при преждевременных родах [39,42]
Таким образом, для здоровья детей, после ВРТ, негативные воздействия данного метода связаны, прежде всего, с бесплодием, возрастом, сопутствующим комплексом метаболических, генетических и эпигенетических нарушений, влияющих на качество гамет и течение беременности. Кроме того, важным доказанным патологическим фактором, связанным с самой процедурой, ЭКО является многоплодие, а среди технологических аспектов – состав питательных сред для эмбрионов и яйцеклеток, выбор стадии имплантации и другие факторы, которые оказывают негативное влияние на исходы беременностей и здоровье детей.
Исходя из вышеизложенного, большой интерес представляет проведение комплексного исследования плацент после беременности, индуцированной методами ВРТ. Несмотря на активное развитие плацентологии работ, посвященных структурной и функциональной организации плаценты после ВРТ, очень мало. Данная проблема становится все более актуальной в связи с широким применением методов ВРТ для решения проблем бесплодия. При этом, несомненно, важным является вопрос о полноценности таких детей, по сравнению с детьми от самостоятельной беременности. Поэтому необходимо всесторонне оценить морфофункциональные особенности плацент при индуцированных беременностях, по сравнению с естественно наступившими беременностями, так как именно плацента является системой внутриутробного жизнеобеспечения плода и её адекватное функционирование лежит в основе постнатального здоровья ребенка.
Иммуногистохимическое исследование экспрессии эндотелиального маркера CD34 в клетках ворсинчатого хориона
Во всех группах большее число новорожденных были в группе ППК в пределах 0,12-0,15 и составило в основной группе 63,3% и 53,3% при первичном и вторичном бесплодии и в группе сравнения 65,8%.
ППК 0,12 в большем проценте случаев встречался при вторичном бесплодии 26,7% и при первичном бесплодии 20,0%, а в группе сравнения данный показатель составил 18,4%, что свидетельствует об уменьшении массы плаценты и возможном развитии плацентарной недостаточности.
Увеличение ППК более 0,15 максимально наблюдалось в группе с вторичным бесплодием, что составило 20,0% и в группе сравнения 15,8%, наименьшее число наблюдалось в основной группе с первичным бесплодием 13,3%. Повышение ППК свидетельствует об увеличении массы плаценты, что также может явиться причиной развития плацентарной недостаточности (рис. 5).
Проведенное анамнестическое исследование женщин с первичным и вторичным бесплодием показало, что у женщин с первичным бесплодием отмечалась равная частота встречаемости наружного генитального эндометриоза и ВЗОМТ, а среди женщин с вторичным бесплодием преобладающими были ВЗОМТ с наличием трубно-перитонеального фактора почти в 50,0% случаев.
Среди массо-метрических показателей плацент, детей и их состояния на первой минуте после рождения различий не было. Однако, нельзя не отметить, что в подгруппе с вторичным бесплодием показатели масс плацент и ППК имели большее отклонение от средних величин, чем в подгруппе с первичным бесплодием и в группе сравнения.
Гистологическое исследование последа включало в себя изучение: - плаценты (амниотическая оболочка, хориальная и базальные пластины, состояние краевой зоны, ворсинчатого хориона, межворсинчатого пространства); - плодных оболочек (амниотический слой, спонгиозное пространство, трофобластический и децидуальные слои); - пуповины (амниотическая оболочка, состояние стромы и сосудистый компонент).
Одним из важных критериев полноценности плаценты является состояние её виллезного дерева, в частности терминальных ворсин хориона, которые являются определяющим компонентом при оценке соответствия срока беременности и гистологической структуры плаценты. При нормально протекающей беременности в зрелой плаценте на долю терминальных ворсин хориона приходится 40-50,0% от общего объема ворсин, зрелые промежуточные ворсины хориона, составляют около 30,0%, стволовые формы ворсин до 20,0%, промежуточные незрелые формы ворсин могут встречаться до 5,0% (рис. 6а). Изменение в соотношения видов ворсин хориона и появления генераций ворсин характерных для более ранних сроков (промежуточных зрелых и незрелых форм) нередко обуславливает развитие плацентарной недостаточности (рис. 6б).
Строение виллезного дерева плаценты при доношенном сроке гестации. а – терминальный тип развития виллезного дерева, Г-Э, 100; б – хроническая плацентарная недостаточность с персистенцией промежуточных незрелых ворсин хориона, Г-Э, 100.
Не менее важна оценка состояния микроциркуляторного русла виллезного дерева. Степень кровенаполнения зависит от многих причин, в частности от способа и длительности родоразрешения, компенсаторных реакции гемоциркуляторной системы плода, например, на фоне хронической плацентарной недостаточности или при развитии острой плацентарной недостаточности. Изменения в микроциркуляторном русле ворсин хориона могут иметь различную степень выраженности от слабой и умеренной, что характерно для нормального течения родового акта (рис. 7а), до выраженных изменений, которые могут сопровождать различные виды патологических изменений в ходе родов или зависеть от компенсаторно-приспособительных возможностей последа (рис. 76). Рисунок 7. Циркуляторные изменения в ворсинчатом хорионе при доношенном сроке гестации. а – умеренно выраженная степень циркуляторных изменений, Г-Э, 100; б- выраженная степень циркуляторных изменений, Г-Э, 100.
Помимо виллезного дерева и состояния сосудистого русла в зрелой плаценте большое значение имеет оценка и других гистологических параметров в последе, характерных для доношенного срока гестации. К ним относятся синцитио-капиллярные мембраны в терминальных ворсинах хориона (в виде истонченных участков хориального синцития) (рис. 8 а); синцитиальные узелки и почки, в виде скопления ядер хориального синцития с образованием выбухающих структур имеющие вид узелков (рис. 8 б); а также локализация и количество отложений фибриноида в интервиллезном пространстве, содержащего иммунные комплексы и отложение солей кальция находящиеся в массах фибриноида, чаще всего определяющиеся в краевое зоне, также с возможным формированием инфарктов (рис. 8 б, в, г).
Экспрессия NOS-3 в ворсинчатом хорионе
Степень васкуляризации ворсинчатого хориона является важным параметром функциональной активности плаценты. Для оценки этого в нашем исследовании использован эндотелиальный маркер CD34, который экспрессирует в эндотелиальных клетках [38,75].
Результаты наших исследований показали, что при бесплодии в ворсинах хориона площадь экспрессии CD34 была достоверно ниже при сопоставлении с группой сравнения. При этом минимальные значения наблюдались при вторичном бесплодии (р 0,01), при первичном бесплодии отмечалось некоторое повышение данного показателя (р 0,05).
При оценке оптической плотности экспрессии маркера CD34 в ворсинах хориона было выявлено достоверное повышение данного показателя при первичном бесплодии в сопоставлении с группой сравнения (р 0,05).
Полученные нами данные можно сопоставить с другими проводимыми исследованиями. Снижение экспрессии маркера CD34 наблюдалось в плацентах при пролонгированной и истинно переношенной беременности, что свидетельствовало о выраженных патоморфологических нарушениях в плацентарном комплексе [110]. Согласно другим проводимым исследованиям [38,76], что при переношенной беременности уровень CD34 и других маркеров (пролактин, мелатонин, NO-синтазы, CD35 и др.) оставался на таком же уровне, что и при доношенной беременности, что могло рассматриваться как показатели сохраняющейся ростовой и функциональной активности.
В других исследованиях, было показано влияние возраста женщины на степень васкуляризации ворсинчатого хориона. Так наименьшая площадь экспрессии наблюдалась у женщин старше 40 лет, а наибольшая у женщин нормального репродуктивного возраста (18-28 лет). Кроме того, имелись статистически значимые отличия в площади экспрессии CD34 в возрастных группах 29-35 лет и 36-40 лет. При оценке оптической площади в данном исследовании было выявлено достоверное снижение данного показателя с увеличением возраста женщин [38,76]. В нашем исследовании мы наблюдали достоверное повышение оптической плотности экспрессии маркера CD34 при первичном бесплодии, при этом больший процент женщин в данной группе был в возрасте 36-40 лет.
Проведенные нами иммуногистохимические исследования экспрессии NOS-3 показали, что максимальная экспрессия наблюдалась и в синцитиотрофобласте, что отражает его участие в регуляции и сохранении низкого сосудистого сопротивления в системе плацентарно-плодового кровообращения [38].
Площадь экспрессии NOS-3 при бесплодии была достоверно ниже, чем в группе сравнения (р 0,001). При оценке экспрессии NOS-3 внутри основной группы наблюдалось снижение экспрессии данного маркера в подгруппе с вторичным бесплодием (2,60±0,90 у.е.) при сравнении с подгруппой с первичным бесплодием (3,72±0,57 у.е.). Показатели оптической плотности были достоверно выше при первичном бесплодии (р 0,05).
Таким образом, в плацентах основной группы наблюдалось снижение функциональной активности NO-синтазы в ворсинчатом хорионе, что может явиться причиной нарушения эндотелиальной функции и повышения сосудистого сопротивления в системе плацентарного кровообращения. При сопоставлении подгрупп основной группы, было выявлено снижение экспрессии NOS-3 при вторичном бесплодии по сравнению с первичным.
При сравнении полученных результатов с данными других авторов, были получены достаточно противоречивые сведения. При оценке площади экспрессии маркера eNOS в плацентах разных возрастных групп, наблюдалось снижение функциональной активности NO-синтазы у юных первородящих и у женщин старше 29 лет, что сопоставимо с данными нашего исследования [38,76]
В исследованиях L.Myatt различий в иммуногистохимическом окрашивании синцитиотрофобласта в плацентах при преэклампсии с/без ЗВРП обнаружено не было [171,175,179]. В исследованиях Rajagopal M. и соавторов достоверных отличий в иммуногистохимическом исследовании антител к NO-синтазе у женщин с гипертензией и нормально протекающей беременностью также выявлено не было [38,105]. Другими авторами отмечаются однонаправленные нарушения в NO-системе – снижение активности e-NOS при возрастающей экспрессии NO, i-NOS ONO- в плацентах и сыворотке пуповинной крови при беременности, осложненной гестозом и гипохромной анемией [35].
Таким образом, полученные нами данные при гистологическом и иммуногистохимическом исследовании свидетельствуют о том, в плацентах после ВРТ возникает нарушение функциональной активности сосудистого русла и повышение сосудистого сопротивления в системе плацентарного кровообращения. Полученные результаты свидетельствуют о возможном осложнении течения беременности после ВРТ с высоким риском развития ПН, гестозов и преэклампсии. Повышение экспрессии HIF-1 в плацентах при бесплодии свидетельствует о состоянии хронической гипоксии, что приводит к увеличению продукции факторов, вызывающих вазоконстрикцию и снижению продукции вазодилятирующих факторов. Кроме того, активация HIF-1 может привести к усилению эритропоэза, что приводит к увеличению вязкости крови, замедлению кровотока и нарушению микроциркуляции [61]
Морфологические изменения и изменения в экспрессии изучаемых маркеров наиболее были выражены в плацентах при вторичном бесплодии. Такие результаты вполне обоснованы, поскольку у пациенток с вторичным бесплодием в анамнезе присутствовала высокая частота встречаемости воспалительных заболеваний органов малого таза, а также высокий процент внутриматочных манипуляций, что может явиться причиной нарушения морфофункционального состояния эндометрия. Это негативно отражается на процессах имплантации, плацентации, а в дальнейшем приводит к уменьшению кровоснабжения плаценты и развитию плацентарной недостаточности, что подтверждается в нашем исследовании более частой встречаемостью ХПН при вторичном бесплодии.