Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль пролиферативных заболеваниях матки в этиологии и патогенезе дисфункции эндометрия (обзор литературы) 13
1.1. Морфологические особенности формирования рецептивности эндометрия 13
1.2. Этиология, патогенез гиперплазии эндометрия, биомолекулярные маркеры 18
1.3. Гормональный и иммуногистохимический профиль эндометрия при миомах матки 24
1.4. Иммуногистохимический профиль эутотопического и эктопического эндометрия при эндометриозе 27
Глава 2. Материалы и методы диссертационного исследования 35
2.1. Материалы и исследования 35
2.2. Методы исследования 37
2.3. Статистическая обработка 46
Глава 3. Клинико-анамнестическая характеристика групп 48
3.1. Соматический и акушерско–гинекологический анамнез 48
3.2. Микробиологические, эндокринологические, общеклинические и биохимические показатели женщин с бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки 59
Глава 4. Сравнительная характеристика морфофункционального состояния эндометрия у женщин с бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки 66
4.1. Макро- и микроскопическая оценка биоптатов эндометрия 66
Глава 5. Морфофункциональная характеристика эндометрия у женщин с бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки 85
5.1. Экспрессия рецепторов стероидных гормонов 85
5.2. Экспрессия факторов ангиогенеза 88
5.3. Характеристика лимфоидной инфильтрации 90
5.4. Экспрессия маркеров апоптоза 93
5.5. Оценка рецептивности эндометрия 96
5.6. Оценка экспрессии к PTEN в образцах эндометрия 99
Глава 6. Способы оценки рецептивности эндометрия у женщин с бесплодием при пролиферативных заболеваниях матки 104
6.1. Способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии 104
6.2. Способ оценки рецептивности эндометрия у женщин с первичным бесплодием и миомой матки 110
6.3. Способ оценки эндометриальной дисфункции у женщин с первичным эндометриоз ассоциированным бесплодием 113
6.4. Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с бесплодием, обусловленной гиперплазией эндометрия 116
Заключение 121
Выводы 132
Практические рекомендации 134
Список сокращений 135
Список литературы 137
- Морфологические особенности формирования рецептивности эндометрия
- Соматический и акушерско–гинекологический анамнез
- Экспрессия рецепторов стероидных гормонов
- Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с бесплодием, обусловленной гиперплазией эндометрия
Морфологические особенности формирования рецептивности эндометрия
Успешная имплантация эмбриона в матку и последующая беременность, зависит от взаимодействия бластоцисты и эндометрия. Чтобы эмбрион успешно имплантировался, эндометрий должен иметь не только подходящую для этого толщину и структуру, но и адекватную восприимчивость в период «окна имплантации», что является отражением его функциональной состоятельности.
Маточные железы играют исключительно важную роль в наступлении и развитии беременности, о чем свидетельствует бесплодие, которое возникает в результате ингибирования развития этих желез, посредством генной мутации или эпигенетических изменений [95]. Отдельные исследователи придерживаются подхода, согласно которому, эндометриальные железы с окружающей стромой и нервно-мышечными элементами можно расссматривать в качестве структурных единиц эндометрия. Эндометрий является многоклеточной системой, жизнедеятельность кооторой зависит от многих факторов. Межклеточные взаимодействия, влияние стероидных гормонов и паракринные компоненты поддерживают жизнедеятельность и функионирование этих систем. На протяжении менструального цикла морфофункциональное состояние эндометриальных субпопуляций клеток меняется, что является основой для поддержания гомеостаза на протяжении менструального цикла [8]. При патологических процессах функционально состояние эндометрия меняется, что находит отражение в изменении эпителиально-стромальных соотношений в структурной единице эндометрия. Особенно это важно при диагностике гиперплазий эндометрия, где это является дифференциально-диагностическим признаком, поскольку нормальное стромально-железистое соотношение было определено для каждой фазы менструального цикла еще в 1990 г Г.Г. Автандиловым [1, 8].
Рецептивность эндометрия у здоровых фертильных женщин, повышается в течение очень короткого времени, во время середины секреторной фазы менструального цикла, которое называется «окно имплантации» [5, 30, 43, 55].
Это период, в течение которого матка, претерпевает изменения, чтобы обеспечить адекватную и восприимчивую среду для эмбриона [185]. Нарушение имплантации, приводит к неблагоприятным перинатальным и репродуктивным исходам [129].
Одной из возможных причин бесплодия и других репродуктивных нарушений таких как невынашивание беременности является изменение взаимодействия эндометрия с оплодотворенной яйцеклеткой вследствие десихронизации нидации или нарушение рецептивности эндометрия в период «окна имплантации». Это не только делает невозможным самостоятельное наступлениебеременности, но и повышает количество неэффективных циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и других методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), увеличивая экономические потери [70]. Г.Х.Толибова и соавт. (2016) рассматривают эндометриальную дисфункцию, как «…обратимые или условно обратимые морфофункциональные изменения эндометрия, в основе которых лежат нарушения молекулярных механизмов, приводящие к нарушению имплантации, плацентации и гибели эмбриона…» [70].
Внедрение новых молекулярных и генетических методов исследования в дополнение к биопсийному исследованию позволило связать эндометриальную дисфункцию с нарушением экспрессии многих факторов, что позволило разработать единый алгоритм иммуногистохимической диагностики данного состояния [70]. Патологические состояния слизистой матки, подразделяются на дисгормональные (сопровождающиеся гиперпластическими, дистрофическими и атрофическими процессами), воспалительные и опухолевые [66]. У женщин, страдающих бесплодием, основное место в структуре патологии эндометрия, занимают дисгормональные и воспалительные заболевания [63, 70, 72]. У фертильных женщин, практически в половине случаев, И.Е.Корнеева (2003) и Е.Г.Беляева (2014), выявили патологические изменения эндометрия в виде хронического эндометрита, внутриматочных сращений, полипов и гиперпластических процессов [9, 37]. Современные исследования показали, что частота хронического эндометрита у бесплодных пациентов, колеблется в пределах 0,2–46% [92, 127]. У женщин с привычным невынашиванием беременности после процедуры ЭКО, он выявлялся в 14% случаев. При этом у женщин с эндометритом, регистрировалась более низкая частота имплантации (11,5%), по сравнению с женщинами, у которых воспалительные изменения слизистой, отсутствовали (32,7%) [123]. Морфологическая диагностика хронического эндометрита, основана на выявлении плазматических клеток в строме. Трансмембранный гепаринсульфат протеогликан синдекан–1 (CD138+), является специфическим маркером плазматических клеток и в современной клинической практике используется для выявления хронического эндометрита, с целью повышения уровня его диагностики. Однако из-за того, что эндометрит обычно упускают из виду в клинической практике, а клиницисты имеют ограниченный доступ к морфологическим исследованиям, этот метод редко используется при обследовании женщин с бесплодием [93].
Считается, что натуральные клетки–киллеры матки (uNK), играют ключевую роль в развитии эндометриоза и бесплодия. Нарушение регуляции числа uNK и / или функции клеток (цитотоксичность, экспрессия рецепторов, секреция цитокинов или экспрессия генов), связаны с репродуктивными неудачами, такими как бесплодие и привычное невынашивание беременности.
Женщины с эндометриозом или без него, имеющие большие популяции цитотоксических клеток CD16+uNK и/или увеличение популяции клеток NKp46+ CD56+, могут подвергаться повышенному риску бесплодия, вследствие воспалительной реакции, возникающей во время имплантации или позже, во время децидуализации [104].
В работе Ашхаб М.Х. и соавт. (2002) при исследовании нормального эндометрия, продемонстрированы взаимосвязи, между стадиями фаз менструального цикла и экспрессией рецепторов, к стероидным гормонам, в ядрах эпителия желез и стромальных клеток. Установлено, что в среднюю и позднюю стадии фазы пролиферации в гландулоцитах желез отмечается наибольшая чувствительность к эстрогенам и прогестерону, что проявляется увеличением экспрессии их рецепторов на ядерной мембране. В раннюю стадию фазы секреции в основном сохраняется чувствительность к прогестерону, которая наиболее выражена в эпителиальных клетках эндометрия. В отличие от гландулоцитов и эпителия, выстилающего просвет матки стромальные клетки сохраняют чувствительность к действию стероидных гормонов, на протяжении более длительного времени: к эстрогенам на протяжении всей фазы пролиферации и до ранней стадии фазы секреции. Их чувствительность к прогестерону сохраняется со средней стадии фазы пролиферации и до окончания фазы секреции, что несомненно играет важную роль в подготовке стромы к беременности, если она наступает [7].
Согласно литературным данным, баланс между пролиферацией клеток эндометрия и апоптозом, имеет решающее значение для поддержания клеточного гомеостаза, во время окна имплантации. Обычно апоптоз клеток эндометрия, значительно выше в течение периода «окна имплантации», что позволяет бластоцисте успешно имплантироваться [83]. Предполагается, что изменения соотношения в про– и антиапоптотических факторах в секреторном эндометрии, нарушают имплантацию и могут быть причиной неудач экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у бесплодных женщин с эндометриозом, трубным бесплодием или синдромом поликистозных яичников [84]. H.S.Vatansever et al. (2005) сообщили, о снижении спонтанного апоптоза, обусловленного изменением соотношения Bcl (B-cell lymphoma): Bax (Bcl-2 Associated X Protein, продукт гена BAX) в эндометрии женщин с неуточненным бесплодием по сравнению с фертильными женщинами [191]. Ю.С.Анциферова и соавт. (2014) отметили, что синтез проапоптотического фактора, PTEN (гомолога фосфатазы и тензина, на 10 хромосоме), значительно увеличился в эндометрии женщин с трубным фактором бесплодия. Авторы, связывают высокий уровень экспрессии мРНК PTEN, с подготовкой эндометрия для имплантации эмбрионов, с успехом лечения ЭКО у этих женщин [84]. Предполагается, что PTEN, проапоптотический фактор и ген супрессор опухолевого роста, является одним из сигнальных белков, через которые эстроген и прогестерон действуют на клетки эндометрия, их пролиферацию и апоптоз. Фосфорилирование PTEN в C–терминальном домене, вызывает его инактивацию. В более ранних исследованиях сообщалось, о роли PTEN в матке млекопитающих и необходимости для правильной инвазии трофобласта и децидуальной регрессии [133].
Соматический и акушерско–гинекологический анамнез
В соответствии с критериями ВОЗ репродуктивный возраст женщин составляет от 15 лет, усредненного времени начала менархе и оценке состояния здоровья женщины органами государственной статистики до 45 лет, когда снижается функция яичников и наступает менопауза. Поскольку на протяжении данного периода функция яичников и репродуктивный потенциал женщин меняется отечественные акушеры гинекологи позразделяют репродуктивный возрастной период женщины на ранний (18–24 года), средний (25–34 года) и поздний (35–44 года). Приводятся данные о том, что уже с 27 лет начинаются процессы старения яичников и уменьшение вероятности рождения здорового ребенка. Проведенное исследование показало, что у женщин с пролиферативными заболеваниями матки и бесплодием средний возраст приближался к 34 годам и составил 35,7 ±4,9 года у женщин с миомами матки, 33,9±4,6 лет у женщин с аденомиозом и 35,4±6,3 года у женщин с гиперпластическими процессами в эндометрии. При этом в первой группе (первичное бесплодие, обусловленное миомой матки) более 50% женщин имели возраст более 35 лет. Во второй группе превалировали более молодые женщины (в 60,6% случаев) не старше 35 лет. Среди женщин с гиперплазией эндометрия одна была в раннем репродуктивном возрасте и более половины женщин имели возраст от 25-34 лет. Поскольку все пациентки имели первичное бесплодие в течение длительного времени нельзя однозначно судить о связи нарушения фертильности женщины с возрастом, тем более что именно женщины третьей группы имели наибольшее количество попыток применения вспомогательных репродуктивных технологий для достижения беременности, а женщины с миомой матки – наименьшее. Тем не менее статистически значимых различий по возрастным категориям среди бесплодных и фертильных женщин не выявлено (таблица 1).
В таблице 2 представлено распределение пациенток в группах, по социальному положению и по месту проживания. Подавляющее число обследованных женщин (более 90%), являлись городскими жительницами. Женщины первой и третьей группы преимущественно имели высшее образование и относились к категории служащих и специалистов высшего уровня квалификации. У женщины с эндометриоз-ассоциированным бесплодием высшее образование регистрировалось в 78,8% случаев, и в большем проценте наблюдений были официально трудоустроены. Эти данные еще раз подтверждают ошибочность бытовавшего ранее мнения о том, что более образованные и социально успешные женщины имеют более высокий риск развития эндометриоза. Mатримониальный статус в группах также не имел статистически значимых различий, несмотря на то что меньше всего женщин с аденомиозом состояли в зарегистрированном браке - 84,8%). Вредные привычки в виде умеренного употребления алкоголя и курения регистрировались как у женщинн основной группы, так и у женщин без репродуктивных нарушений, употребление наркотических и психоактивных веществ при опросе все женщины отрицали. Несмотря на бытующее в общесве мнение о связи эндометриоза с курением именно эта группа женщин отрицала употребление табака, до четверти женщин с вредными привычками наблюдалось в группе с гиперпластическими процессами в эндометрии и около 13% в группе с миомами матки и бесплодием. Однако статистически значимых различий в группах не выявлено (p 0,0001 для всех групп) (таблица 2).
У пациенток с миомами матки в структуре соматических заболеваний статистически значимо чаще, чем у женщин группы сравнения, регистрировались заболевания ЖКТ и среднего уха и сосцевидного отростка (р1–4 0,05 в обоих случаях) (таблица 3). Также среди женщин первой группы в большем количестве случаев встречались анемия и заболевания мочевыделительной системы. В группе женщин с эндометриозом в 2 раза чаще по сравнению с группой сравнения выявлялась генетическая тромбофилия, однако, статистически значимых отличий обнаружено не было.
Все женщины с пролиферативными заболеваниями матки, имели первичное бесплодие от 1 до 20 лет. В анамнезе женщин группы сравнения, регистрировались от 1 до 4 живых здоровых ребенка, в среднем количество детей было 1,65±0,8. Длительность бесплодия и показатели применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) отражены в таблице 4.
Женщины с пролиферативными заболеваниями матки и бесплодием, имели в анамнезе, неудачные попытки ЭКО. Почти треть женщин с миомами матки, чуть менее половины женщин с эндометриозом и большая часть женщин с патологией эндометрия, имели, две и более, неудачных попыток ЭКО (Recurrent Implаntаtion fаilure – повторные неудачи имплантации). Наибольшее число попыток, предпринятых женщинами с бесплодием, достигало семи, что свидетельствует об отсутствии эффекта от проведения программ ВРТ у данных пациенток.
К моменту обращения за помощью, 100% женщин с бесплодием и 18,75% женщин группы сравнения, не использовали средства контрацепции (таблица 5).
Гормональную контрацепцию, использовали более половины пациенток с бесплодием, при пролиферативных заболеваниях матки. Внутриматочную контрацепцию (ВМК) в анамнезе, в среднем применяли 5,5% женщины с бесплодием и не использовали женщины с сохраненной репродуктивной функцией. Тем не менее, отсуствие статистически значимых различий не позволяет однозначно судить о связи ВМК и бесплодия, хотя наличие инородного тела в матке повышает риск развития хронического эндометрита. Барьерными методами на протяжении жизни, пользовалось большинство женщин с эндометриозом и пациентки без репродуктивных нарушений, половина женщин с миомами и гиперплазией эндометрия. Некоторые женщины в течение жизни, использовали несколько видов контрацептивов. Своевременное наступление менархе, наблюдалось у большинства обследованных пациенток (таблица 6).
Экспрессия рецепторов стероидных гормонов
Результаты иммуногистохимического исследования, включающего определение рецепторов к экстрогену и прогестерону в ядрах эпителиоцитов и клеток стромы, представлены в таблице 27.
В биоптатах эндометрия пациенток 1–й группы (бесплодие, обусловленное миомой матки) наблюдалось достоверное уменьшение уровня экспрессии PR в клетках стромы (таблица 27, рисунок 18). Интенсивность экспрессии ER, напротив, была ниже относительно показателей группы контроля, как в железах, так и в клетках стромы, однако, достоверные различий не обнаружено (р 0,05) (таблица 27, рисунок 19).
Эндометрий женщин 2–й группы (бесплодие, обусловленное аденомизом) характеризовался повышением экспрессии PR как в железах, так и в строме. Статистически значимых различий в экспрессии ER как, в эпителиоцитах желез, так и строме не выявлено (таблица 27). Однако визуально наблюдался повышенный уровень экспрессии этого рецептора (рисунок 20).
В фрагментах эндометрия 3–й группы (бесплодие, обусловленное гиперплазией эндометрия), отмечалось уменьшение экспрессии прогестерона в гландулоцитах желез и значительное увеличение его экспрессии в клетках стромы. Экспрессия ER в клетках желез и стромы, достоверно не отличалась от показателей группы сравнения (таблица 27, рисунок 21). Тем не менее, во многих образцах была отмечена неравномерная «островковая» экспрессия рецепторов стероидных гормонов.
Поскольку именно прогестерон являтся основным фактором подготовки эндометрия к имплантации бластоцисты и модулятом экспресии рецепторов ко многим факторам, именно его влияние на развитие эндометриальной дисфункции можно назвать решающим.
Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с бесплодием, обусловленной гиперплазией эндометрия
Задачей изобретения, явилась разработка способа оценки рецептивности эндометрия в период «окна имплантации», у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гиперплазией эндометрия, с использованием результатом иммуногистохимического исследования уровня экспрессии основных факторов, отвечающих за имплантацию эмбриона и рецептивность эндометрия, с последующим вычислением прогностического индекса (PI), на основании иммуногистохимических данных, с использованием метода математического моделирования, с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI = Х1–0,48+ Х2–1,5+ Х3–23,07+0,87 Х4+ Х5–1,21+592, где
Х1 – балл H–score экспрессии прогестерона в железах;
Х2 – балл H–score экспрессии прогестерона в строме;
Х3 – количество CD20+ клеток в строме;
Х4 – балл H–score экспрессии PTEN в железах;
Х5 – балл H–score экспрессии PTEN в строме;
592– Const.
При PI более 0, делают заключение о готовности эндометрия, к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ. При PI менее 0, прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ.
Чувствительность метода составляет 91,66%, специфичность – 100%, эффективность – 95,83%.
Клинические примеры.
Пример 1. Пациентка Ц., 31 год. Обратилась в связи с первичным бесплодием и жалобами на обильные болезненные менструации. Отмечает бесплодие в течение 5 лет, в анамнезе 1 неудачная попытка ЭКО. Соматически не отягощена. Материал получен методом пайпель биопсии на 21день менструального цикла. При гистологическом исследовании: эндометрий средней стадии фазы секреции. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании: балл HSCORE прогестерон в железах– 90; балл HSCORE прогестерон в строме – 270; CD 20+ количество клеток в строме на поле зрения –2; балл HSCORE PTEN в железах– 200; балл HSCORE PTEN в строме – 175.
Значение прогностического индекса определяли по формуле: PI = 90–0,48+270–1,5+2–23,07+0,87200+175–1,21+592=59,9 и получили PI 0, что свидетельствует о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с гиперплазией эндометрия
В течение последующего наблюдения в результате ЭКО наступила беременность, на данный момент срок 35 недель
Пример 2. Пациентка Ф., 33 года. Обратилась в связи с отсутствием беременности в течение 8 лет, в анамнезе 3 неудачные попытки ЭКО. По УЗИ М– эхо высота эндометрия 15,6 мм. Соматически не отягощена. Материал получен методом пайпель биопсии на 21 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: эндометрий средней стадии фазы секреции, очаговая простая гиперплазия без атипии. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании: балл HSCORE прогестерон в железах– 270; балл HSCORE прогестерон в строме – 210; CD 20+ количество клеток в строме на поле зрения – 5; балл HSCORE PTEN в железах– 150;балл HSCORE PTEN в строме – 180. Значение прогностического индекса определяли по формуле: PI = 270–0,48+210–1,5+5–23,07+0,87150+180–1,21+592=–55,25 и получили PI 0, что свидетельствует о высоком риске репродуктивных неудач, в программах ВРТ.
В течение периода наблюдения, две неудачные попытки переноса эмбриона. Беременности зафиксированы не были, отмечен рецидив гиперплазии после гистероскопии и выскабливания полости матки.
Таким образом, предложенные прогностические модели оценки готовности эндометрия к имплантации, позволили рекомендовать дoполнительные иммуногистохимические исследования женщинам с бесплодием и гиперпластическими процессами в матке, для прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона (рисунок 34).
Полученные значения микроскопического и иммуногистохимического исследования биоптатов эндометрия на 20–22 дни менструального цикла, подставляют в соответствующие формулы, для определения прогностического индекса. При PI более 0, прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ, пациентке рекомендуется лечение и прохождение дополнительного обследования на иммуногистохимические маркеры, в соответствии с нозологической формой заболевания, для исключения ложноположительных результатов. При PI менее 0, делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины с различными заболеваниями, обуславливающими маточную форму бесплодия, в программу ВРТ.
В результатте проведенного комплексного морфометрического, микроскопического и иммуногистохимического анализа, можно заключить, что, несмотря на наличие общих признаков нарушение рецептивности у женщин с бесплодием: уменьшение ангиогенеза и снижение площади и высоты пиноподий, необходимо проводить расширенное ИГХ исследование в зависимости от нозологической формы. Предложенные способы позволяют оптимизировать алгоритм исследования и длелать его более персонализированным, что находит отражение в достаточно высоких цифрах эффективности и специфичности.