Клинико-патоморфологический анализ костномозгового микроокружения и миелофиброза при множественной миеломе Дьячкова Юлия Александровна

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Современные представления о структурно функциональных особенностях миелофиброза и костномозгового микроокружения при множественной миеломе. роль цитокинов в регуляции эритропоэза. прогностическое значение анемии и миелофиброза 12

1.1. Современные представления о костномозговом микроокружении и миелофиброзе при множественной миеломе 12

1.2. Структурно-функциональные особенности эритрона при множественной миеломе 22

1.3. Баланс цитокинов у пациентов с множественной миеломой. Роль цитокинов в регуляции эритропоэза 27

1.4. Резюме 31

Собственные исследования

Глава II. Характеристика клинических наблюдений и методы исследования 33

2.1. Общая характеристика клинических наблюдений 33

2.2. Методы клинического исследования 39

2.3. Цитологические методы исследования периферической крови и костного мозга 43

2.4. Методы патоморфологического исследования трепанобиоптатов подвздошной кости 43

2.5. Определение спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов 46

2.6. Методы статистического анализа 47

Глава III. Патоморфологическая характеристика гемопоэза, опухолевой ткани, костномозгового микроокружения и миелофиброза при множественной миеломе

3.1. Характеристика костного мозга и костномозгового микроокружения по данным миелограммы 48

3.2. Исследование миелофиброза у пациентов с множественной миеломой 61

3.3. Резюме 69

Глава IV. Особенности эритрона и цитокинов у пациентов с хронической почечной недостаточностью, миеломной нефропатией и миелофиброзом 72

4.1. Особенности эритрона и миелофиброза при множественной миеломе у пациентов с хронической почечной недостаточностью, миеломной нефропатией 72

4.2. Исследование периферического звена эритрона и баланса цитокинов в различных фазах множественной миеломы 77

4.3. Резюме 87

Глава V. Клинико-патоморфологическая значимость изменений костномозгового микроокружения, миелофиброза, эритрона и цитокинов при множественной миеломе (обсуждение результатов исследования) 89

Заключение 98

Выводы 102

Практические рекомендации 104

Список литературы

• Структурно-функциональные особенности эритрона при множественной миеломе
• Цитологические методы исследования периферической крови и костного мозга
• Исследование миелофиброза у пациентов с множественной миеломой
• Исследование периферического звена эритрона и баланса цитокинов в различных фазах множественной миеломы

Введение к работе

Актуальность темы. В настоящее время во всем мире сохраняется тенденция к увеличению заболеваемости гемобластозами, в том числе и множественной миеломой (ММ). В последние десятилетия появилась тенденция к более частому возникновению множественной миеломы у лиц моложе 55 лет (Бессмельцев С.С. и др., 2004). К прогностическим факторам этого заболевания относятся: высокий уровень _2-микроглобулина в сыворотке крови, снижение уровня альбумина в сыворотке крови, высокий уровень лактатде-гидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови. В последние годы активно изучается роль миело-фиброза (МФ) в качестве патологического фактора прогноза при ММ. Выраженный МФ при ММ прямо коррелирует с числом низкодифференцированных плазматических клеток (p=0,020), митотической активностью (р=0,003), которые сами по себе являются неблагоприятными прогностическими маркерами неопластического процесса. Общая выживаемость пациентов, не ответивших на лечение, и пациентов с выраженным МФ при ММ после лечения – значительно короче. Пациенты с выраженным МФ имеют медиану выживаемости всего 11 мес (Subramanian R. et al., 2007).

При исследовании трепанобиоптатов костного мозга показано, что при грубом МФ, наличии низкодифференцированных плазматических клеток в миелограмме и диффузном типе опухолевой инфильтрации пациенты имеют выживаемость менее одного года (Singhal N. et al., 2004). По данным других исследователей et al., 2004), МФ при ММ чаще наблюдается при незрелом типе миеломных клеток, чем при зрелом (р<0,001).

Данные литературы свидетельствуют о том, что проведение одновременного морфологического исследования как опухолевых клеток, так и МФ во время наблюдения за пациентами с ММ является более прогностически значимым, чем изолированное исследование опухолевого субстрата et al., 2012).

Миелофиброз может развиваться у 10 – 30% больных ММ в развернутых стадиях болезни, после проведения нескольких линий химиотерапии (Abildgaard N. et al., 1997). Однако остается неясным, влияют ли объем опухолевой массы в костном мозге и химиотерапия на выраженность МФ.

Анализ структурных особенностей кроветворной ткани и стромального микроокружения больных ММ является актуальным, так как на основании сведений о морфофункцио-нальном статусе паренхимы и стромы костного мозга представляется возможным получить неизвестные ранее факты, уточняющие патогенез появления и становления неопластического клона В-лимфоцитов при ММ. Кроме того, сведения о взаимоотношениях кроветворной и стромальной ткани костного мозга больных ММ могут быть использованы в целях оценки прогноза заболевания и совершенствования методов лечения (Ругаль В.И. и др., 2012).

Интерес к изучению особенностей эритропоэза и факторов, влияющих на клетки эритрона при гемобластозах, на протяжении многих лет остается высоким. Анемия является одним из наиболее частых осложнений при онкогематологических заболеваниях, в том числе и при ММ (Moullet I. еt al., 1998; Straus D.J., 2003; Ludwig H. еt al., 2004; Birge-gard G. et al., 2006, 2008).

В настоящее время большое значение в патогенезе ММ придается роли цитокинов. Основная часть опубликованных результатов посвящена изучению сывороточной концентрации цитокинов у пациентов с ММ, отражающей иммунологическую реактивность организма в целом. Исследований способности клеток крови к продукции цитокинов независимо от других клеток, участвующих в их продукции, при ММ практически не встречается. Тем не менее, в последние годы появилась возможность изучения потенциальных резервов активации клеток с использованием метода дифференцированного определения спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов (Рыжикова С.Л. и др., 2011).

Роль ряда цитокинов, таких как интерлейкин-6, интерлейкин-8, интерлейкин-10, моно-цитарный хемоаттрактантный белок и сосудисто-эндотелиальный фактор роста в патогенезе лимфопролиферативных заболеваний хорошо изучена (Lauta V.M., 2003). В то же время значение гранулоцитарного и гранулоцитарно-макрофагального колониестимули-рующих факторов в развитии ММ остается недостаточно исследованным.

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время активно изучается роль миелофиброза при множественной миеломе et al., 2004; et al., 2004; Subramanian R. et al., 2007; et al., 2012). Имеются сведения, что одновременный патоморфологический анализ опухолевого субстрата и миелофиброза во время мониторирования множественной миеломы является более прогностически значимым, чем изолированное исследование опухолевых клеток. Есть данные, что существенное значение в инициации и прогрессировании миелофиброза имеет костномозговое микроокружение (Silberman R. et al., 2013). Однако малоизученным остается вопрос о влиянии химиотерапии на миелофиброз при множественной миеломе. Недостаточно освещены вопросы корреляций между МФ и тяжестью заболевания, ассоциации МФ и анемии.

Цель исследования – изучить патоморфологические особенности костномозгового микроокружения и миелофиброза при множественной миеломе в динамике химиотерапии и оценить их взаимосвязи с клиническими особенностями течения заболевания, состоянием эритрона и уровнем цитокинов.

Задачи исследования:

1. Изучить патоморфологические характеристики гемопоэза, опухолевой ткани, стро-мального микроокружения и миелофиброза при множественной миеломе в динамике химиотерапии.

2. Исследовать патоморфологические изменения костномозгового микроокружения при множественной миеломе в зависимости от особенностей течения заболевания, состояния центрального и периферического звеньев эритрона, маркеров опухолевой массы.

3. Выявить патоморфологические особенности миелофиброза при множественной мие-ломе в дебюте и в динамике химиотерапии в зависимости от клинических проявлений заболевания, наличия миеломной нефропатии (МН) и хронической почечной недостаточности (ХПН), состояния эритрона, объема опухолевого поражения костного мозга.

4. Исследовать уровень спонтанной и митоген-индуцированной продукции провоспа-лительных и противовоспалительных цитокинов и колониестимулирующих факторов в различных фазах множественной миеломы и определить взаимосвязи с миелофиброзом.

Научная новизна. При исследовании множественной миеломы установлено, что в дебюте заболевания в составе костномозгового микроокружения преобладают ретикулярные клетки, остеобласты, фибробласты, макрофаги; в рецидиве заболевания – адвентициаль-ные клетки и адипоциты. Установлена обратная корреляционная связь между содержанием альбумина в сыворотке крови и процентным содержанием остеобластов, фибробластов, эндотелиоцитов в костном мозге. Выявлена прямая корреляционная связь между суточной экскрецией белка с мочой и процентным содержанием в костном мозге остеобластов, фибробластов, эндотелиоцитов, адипоцитов. Обнаружена прямая корреляционная связь между процентным содержанием адвентициальных клеток и адипоцитов в костном мозге и концентрацией фибриногена и ЛДГ в сыворотке крови.

Впервые установлено, что МФ при ММ в 1,5 раза чаще наблюдается при рецидиве заболевания, чем в дебюте и при ответе на химиотерапию. Выявлена зависимость степени МФ от фазы заболевания. Установлено, что у пациентов с ММ после химиотерапии преобладает сочетание начального и выраженного МФ, в то время как у пациентов в рецидиве заболевания преобладает выраженный МФ.

Выявлена ассоциация МФ с опухолевым поражением костного мозга, а также прямая корреляция между относительной площадью фиброзной ткани (Sотн.фибр.тк.) и относительной площадью опухолевой ткани (Sотн.опух.тк.). Показано, что Sотн.фибр.тк. при

МФ-2 и МФ-3 больше в рецидиве заболевания, чем в другие фазы ММ. Установлено, что общая Sотн.фибр.тк. при начальном и выраженном МФ у пациентов с миеломной нефро-патией больше по сравнению с аналогичными показателями у пациентов без МН. Впервые выявлены факторы, ассоциированные с развитием хронической почечной недостаточности и миеломной нефропатии у пациентов с множественной миеломой.

Выявлены обратные корреляционные связи между распространенностью МФ и числом клеток эритроидного ряда, уровнем гемоглобина у пациентов с ММ. Наибольшие значения Sотн.фибр.тк. при начальном и выраженном МФ наблюдаются у пациентов с анемией тяжелой степени. Установлено, что суммарная Sотн.фибр.тк. начального и выраженного МФ>20% ассоциирована с анемией, нуждающейся в гемотрансфузионной коррекции. Выявлена прямая взаимосвязь между процентным содержанием остеобластов в костном мозге и количеством эритроцитов в периферической крови.

Впервые охарактеризован уровень спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов в зависимости от фазы ММ. Показано, что у всех пациентов с ММ повышен уровень продукции провоспалительных цитокинов: спонтанной продукции эндотелиаль-ного фактора роста сосудов (сVEGF), митоген-индуцированной продукции эндотелиаль-ного фактора роста сосудов (мVEGF). Выявлены высокие уровни противовоспалительных цитокинов: спонтанной продукции интерлейкина-4 (сИЛ-4) и митоген-индуцированной продукции антагониста рецепторов интерлейкина-1 (мИЛ-1РА), а также спонтанной продукции антагониста рецепторов интерлейкина-1 (сИЛ-1РА) у пациентов после химиотерапии. Установлено, что в дебюте и рецидиве заболевания понижен уровень противовоспалительного цитокина мИЛ-10.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания об изменениях костномозгового микроокружения, выраженности и распространенности МФ при ММ в зависимости от особенностей течения заболевания, проведения химиотерапии, состояния эритрона, что имеет большое значение для понимания клинико-патоморфологической значимости МФ и костномозгового микроокружения при ММ.

Установление того факта, что МФ является маркером объема опухолевой массы, чаще встречается в рецидиве ММ, позволяет использовать его для оценки факторов риска при выборе тактики ведения пациентов, подборе терапии. В связи с тем, что МФ имеет наибольшее значение среди других структурных компонентов стромального микроокружения, его необходимо оценивать при характеристике патоморфологической картины трепанобиоптатов подвздошной кости у пациентов с ММ. Оптимальным для этого является использование метода автоматизированного морфометрического исследования.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что при диагностике миеломной нефропатии следует учитывать уровень ЛДГ в сыворотке крови, при диагностике хронической почечной недостаточности – уровень суточной протеинурии и белка в моче, уровень ЛДГ и фибриногена в сыворотке. У пациентов с ММ в качестве дополнительного способа оценки активности заболевания целесообразно использовать определение уровня цитокинов в плазме крови.

Методология и методы исследования. Методология исследования основана на применении принципов и методов комплексного структурного анализа патологических процессов, использования теоретических разработок и обобщений о стромальном микроокружении и миелофиброзе. В работе использованы современные методы патоморфоло-гического и цитологического анализа и обработки полученных данных. Объект исследования – трепанобиоптаты подвздошной кости, аспираты костного мозга, мазки периферической крови пациентов с множественной миеломой. Предмет исследования – патомор-фологические изменения костномозгового микроокружения и миелофиброза в динамике химиотерапии множественной миеломы в зависимости от клинических особенностей заболевания, маркеров опухолевой массы, состояния эритрона.

Основные положения, выносимые на защиту.

5. В дебюте множественной миеломы в составе костномозгового микроокружения преобладают ретикулярные клетки, остеобласты, фибробласты, макрофаги; в рецидиве заболевания – адвентициальные клетки и адипоциты. Между процентным содержанием клеток костномозгового микроокружения (остеобластами, фибробластами, эндотелиоцитами, адипоцитами) и суточной экскрецией белка с мочой, концентрацией фибриногена и ЛДГ в сыворотке крови существует прямая корреляционная связь.

6. Миелофиброз в 1,5 раза чаще наблюдается при рецидиве заболевания, чем в дебюте и при ответе на химиотерапию. У пациентов с ММ после химиотерапии преобладает сочетание начального и выраженного МФ, в то время как у пациентов в рецидиве заболевания преобладает выраженный МФ. Вне зависимости от фазы заболевания начальный МФ встречается с одинаковой частотой. Для пациентов после химиотерапии характерно увеличение частоты выраженного МФ (МФ-2 и МФ-3).

7. Независимыми факторами при развитии хронической почечной недостаточности у пациентов с анемией, по данным многофакторного анализа, являются: уровень суточной протеинурии более 0,5 г, уровень белка в моче более 0,6 г/л, уровень ЛДГ в сыворотке более 400 Ед/л, уровень фибриногена более 5500 мг/л. Независимым фактором при развитии миеломной нефропатии у пациентов с анемией является уровень ЛДГ более 400 Ед/л. Общая Sотн.фибр.тк. при начальном и выраженном МФ у пациентов с миеломной нефропа-тией больше, чем у пациентов без нефропатии.

8. По результатам морфометрического исследования трепанобиоптатов подвздошной кости у пациентов с ММ установлены обратные корреляционные связи между распространенностью МФ и числом клеток эритроидного ряда, между распространенностью МФ и уровнем гемоглобина. Суммарная Sотн.фибр.тк. начального и выраженного МФ>20% ассоциирована с анемией, нуждающейся в гемотрансфузионной коррекции. Существует прямая взаимосвязь между процентным содержанием остеобластов в костном мозге и количеством эритроцитов в периферической крови.

9. У всех пациентов с ММ повышен уровень продукции провоспалительных цитокинов (сVEGF, мVEGF), также для них характерны высокие уровни противовоспалительных ци-токинов (сИЛ-4 и мИЛ-1РА у всех больных, сИЛ-1РА у пациентов после ХТ). У пациентов в дебюте и рецидиве заболевания понижен уровень противовоспалительного цитокина (мИЛ-10).

Степень достоверности результатов диссертации. Использованные современные методы патоморфологического, морфометрического и цитологического исследования костного мозга, способы статистической обработки данных соответствуют поставленным цели и задачам исследования и позволяют получить достоверные результаты. Диссертация выполнена на достаточном количестве клинических наблюдений (85 пациентов с множественной миеломой) с применением сертифицированного оборудования. Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» (Новосибирск, 2007), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), IV съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2014), Всероссийской конференции, посвященной 155-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2014), межлабораторной научной конференции ФГБ-НУ «Институт молекулярной патологии и патоморфологии» (Новосибирск, 2015).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 11 научных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования результатов диссертаций и в системе цитирования (библиографических базах) Web of Science и Scopus.

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 115 страницах компьютерного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы – 1 глава, характеристики клинических наблюдений и методов исследования – 1 глава, результатов собственных исследований – 2 главы, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Текст иллюстрирован 26 таблицами и 30 рисунками.

Структурно-функциональные особенности эритрона при множественной миеломе

Характерным признаком ММ является обнаружение в костномозговом пунктате больных миеломноклеточных пролифератов, двух- и трехядерных опухолевых клеток, обилие «пламенеющих» плазматических клеток. Опухолевые плазматические клетки в большой степени повторяют морфологические признаки клеток плазматического ряда. Типичные миеломные клетки имеют диаметр от 15 до 30 мкм, характеризуются округлой или овальной формой, диаметр ядра составляет около 5-7 мкм. Ядра клеток эксцентрично расположены, имеют нежную структуру и одно ядрышко. Цитоплазма интенсивно базофильная, с перинуклеарной зоной просветления. Отмечается вакуолизация - характерный признак некоторых клеток. Суммарное количество опухолевых клеток для установления диагноза ММ, как правило, должно превышать 10%.

Независимо от распространенности опухолевого поражения и варианта миеломной инфильтрации отмечается реакция стромального микроокружения.

При гистологическом изучении трепанобиоптата подвздошной кости больных ММ регистрируются миеломноклеточные разрастания (Андреева Н.Е. и др., 2003). При морфологическом исследовании выявляется нормо-или гипоклеточный костный мозг. Встречаются очаги опустошения костного мозга, участки отека стромы. Степень зрелости плазмоцитов различна. Изредка отмечается тотальное заполнение костномозговых лакун плазматическими клетками. Помимо плазматических клеток, в костномозговых лакунах трепанобиоптатов у больных определяются элементы трех ростков миелопо-эза, однако их количество, как правило, снижено. Обнаруживаются участки гладкой или лакунарной резорбции костной ткани различной степени выраженности, иногда в очагах резорбции выявляются остеокласты.

Следует отметить, что в настоящее время не вполне ясна роль отдельных составляющих кроветворного микроокружения костного мозга в патогенезе ММ и направленность изменений стромальных структур при этом заболевании. В костном мозге больных ММ происходят активные процессы резорбции кости.

В проведенных исследованиях выявлено достоверное уменьшение объема жировой ткани у больных ММ. Общеизвестно, что жировая ткань играет важную роль в поддержании нормального гемопоэза. Это достигается как путем выработки адипоцитами биологически активных веществ, так и посредством прямых межклеточных взаимодействий с элементами гемопоэтической ткани. Возможными причинами уменьшения объема жировой ткани являются инфильтрация костного мозга плазматическими клетками, нарушение созревания преадипоцитов в адипоциты вследствие изменения условий функционирования эндостальной популяции клеток или долговременная кортико-стероидная терапия. Вероятно, существенное уменьшение количества такого важного элемента кроветворного микроокружения, как жировые клетки, наряду с другими факторами вносит свой вклад в функционирование нормального миелопоэза, что проявляется некоторым уменьшением объема ге-мопоэтической ткани, а на клинико-гематологическом уровне — анемией и лейкопенией (Бессмелъцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2004).

Миеломные клетки ускоряют костную деструкцию, они стимулируют главным образом остеокласты и индуцируют клетки костномозгового микроокружения, вследствие чего продуцируются факторы, которые ускоряют образование остеокластов и замедляют образование остеобластов. Иммунные клетки способствуют остеодеструктивному процессу посредством продукции цитокинов и адгезии молекул, которые увеличивают рост миеломных клеток и усиливают их резистентность к ХТ, усиливают остеокластогенез, супресси-руют остеобластогенез.

В норме костный мозг во всех возрастных группах имеет небольшое количество ретикулиновых и коллагеновых волокон, которые находятся, главным образом, во взаимосвязи с поверхностью губчатой кости и кровеносными сосудами (Семенова Н.Ю. и др., 2014). В организме человека, по крайней мере, существует 28 типов коллагена, но фибриллярный коллаген – I, II и III типов составляет около 80-90% от всех типов коллагена. Костномозговой коллаген представлен преимущественно I и III типами. Все типы коллагенов имеют трехспиральную структуру, что возможно благодаря обилию глицина, пролина и остатков гидроксипролина. Коллагеновая трёхспиральная цепочка синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) в качестве проколлагеновых предшественников: проколлаген I типа формируется из двух 1[I] и oдной 2[I] молекул. Коллаген III типа формируется из трёх 1[III] молекул. Коллагеновые молекулы не формируются в фибриллы и волокна до тех пор, пока не произойдёт их секреция в экстрацеллюлярное пространство, и экстрацеллюлярные проколлагенпептидазы не удалят N- и C-концевые пропептиды (Lodish H. et al., 2000; Roman E. et al., 2011).

Ретикулин содержит примерно 10% углеводов, в противоположность I типу коллагена, который содержит только 1% углеводов (Ushiki T., 2002). В то время как коллаген I типа формирует толстые волокна, коллаген III типа обычно формирует единичные волокна или маленькие пучки из тонких волокон (Abildgaard N., 1997). Меньший диаметр волокна и повышенное содержание межфибриллярного вещества отличают ретикулин от коллагена.

Коллагеновая и/или ретикулиновая продукция осуществляется фиб-робластами костного мозга, которые включают адвентициальные ретикулярные клетки, перисинусоидальные адвентициальные клетки, периартериаль-ные адвентициальные клетки.

Состояние, характеризующееся увеличением в костном мозге содержания соединительнотканных волокон без точной ссылки на их количество и качество (ретикулин или коллаген), называется МФ (Thiele J. et al., 2005; Tadmor T. et al., 2013). Предполагается, что МФ – это комплексный процесс, который включает накопление и сборку коллагеновых компонентов экстра-целлюлярного матрикса и неколлагеновых компонентов экстрацеллюлярного матрикса (фибронектин).

Этиология и клиническая значимость МФ до конца ещё не ясны. Но имеются основания полагать, что клинические осложнения, связанные с повышением количества ретикулиновых волокон (ретикулиновый фиброз) отличаются от клинических осложнений, ассоциированных с повышением количества коллагеновых волокон (коллагеновый фиброз). Так, ряд исследований показал, что количество костномозгового ретикулина имеет слабо выраженную корреляцию с числом лейкоцитов, тромбоцитов, уровнем гемоглобина и тяжестью основного заболевания (O Malley D.P. et al., 2005). В то же время, присутствие коллагеновых волокон и их количество обнаружило сильную корреляцию с аналогичными показателями (Thiele J. et al., 2005).

Имеются предположения о различном патогенезе ретикулинового и коллагенового МФ. Ретикулиновый МФ часто обратим при успешной терапии, а коллагеновый обратим с меньшей вероятностью (Kvasnicka H.M. et al., 2015).

Миелофиброз встречается с различной частотой и различной степени тяжести. Все степени могут присутствовать в одном биоптате, что делает не только сложным классификацию, но также и гистоморфометрическое исследование различных частей костного мозга (Frisch B. et al., 1997). Шкала оценки фиброза костного мозга (Шкала Европейского консенсуса): МФ 0 - беспорядочно расположенные линейные ретикулиновые волокна без взаимопересечений, соответствующие нормальному костному мозгу; МФ-1 – рыхлая сеть ретикулиновых волокон с множеством взаимопересечений, особенно в околососудистой области; МФ-2 – диффузное и плотное увеличение ретикулиновых волокон с обширными пересечениями, иногда с наличием пучков коллагена и/или фокального остеосклероза; МФ-3 – диффузное и плотное увеличение ретикулиновых волокон с общирными пересечениями с грубыми пучками коллагена, часто ассоциировано с первичным остеосклерозом (Тhiele J. et аl., 2005).

Цитологические методы исследования периферической крови и костного мозга

Диагноз миеломной нефропатии устанавливали по наличию стойкой протеинурии (белок в суточной моче более 0,1 г) и/или парапротеина в моче при верифицированной множественной миеломе, а также при уровне креати-нина сыворотки крови более 177 мкмоль/л (Durie B.G.M., Salmon S.E., 1975; Менделеева Л.П. и др., 2014). Критерием ХПН у пациентов с миеломной нефропатией являлся уровень креатинина сыворотки крови согласно классификации М.Я.Ратнер и соавт. (1977): I степень ХПН – 170-440, II степень – 441-880, III степень – 881-1320, IV степень – выше 1320 мкмоль/л.

К основным факторам неблагоприятного прогноза при установлении диагноза множественной миеломы относили высокий уровень 2– микроглобулина и снижение уровня альбумина в сыворотке крови.

Оценка эффективности лечения множественной миеломы проводилась согласно рекомендациям по диагностике и лечению ММ (Андреева Н.Е., 2001), национальным клиническим рекомендациям по диагностике и лечению множественной миеломы (Менделеева Л.П. др., 2012, 2014), по изменению уровня моноклонального белка в сыворотке крови и моче. Полный ответ диагностировали при: отсутствии парапротеина в сыворотке и моче по данным иммунофиксации; количестве плазматических клеток в миелограмме менее 5%; отсутствии мягкотканых плазмоцитом.

Очень хороший частичный ответ диагностировали в случае: определения М-протеина в сыворотке крови и моче только при иммунофиксации, но не при электрофорезе; снижения уровня М-протеина в сыворотке на 90% и более, а М-протеина в моче - до уровня менее 100 мг/сут.

Частичный ответ у пациентов с ММ устанавливали в следующем случае: уменьшения уровня М-градиента в сыворотке на 50% и более, а в моче на 90% и более, при этом абсолютное количество М-протеина в моче должно быть менее 200 мг/сут; уменьшения размеров мягкотканых плазмоцитом на 50% и более.

Стабилизация заболевания устанавливалась при несоответствии показателей критериям полного ответа, очень хорошего частичного ответа, частичного ответа или прогрессирования миеломы.

Прогрессия заболевания устанавливалась при: повышении уровня М-градиента на 25% и более от наименьшего достигнутого уровня в сыворотке (увеличение на 5 г/л и более), в моче (увеличение на 200 мг/сут и более); числа плазматических клеток в костном мозге (абсолютное число - не менее 10%);появлении новых очагов в костях или увеличении размеров ранее определяемых очагов; появлении мягкотканых плазмоцитом или увеличении их размеров; гиперкальциемия (корригированный уровень кальция сыворотки более 11,5 мг/дл или 2,65 ммоль/л), которую можно связать с плазмоклеточной пролиферацией.

Рецидив после полного ответа диагностировался при: повторном появлении М-протеина в сыворотке крови или моче, выявляемого при электрофорезе или иммунофиксации; определении в костном мозге более 5% плазматических клеток; появлении любого другого признака прогрессирования (новых плазмоцитом, новых остеолитических очагов или гиперкальциемии).

Для исследования показателей центрального и периферического звеньев эритрона в динамике химиотерапии использовали мазки периферической крови и аспираты костного мозга, окрашенные по методу Романовского-Гимзы. Подсчёт показателей гемограммы осуществляли на гематологическом анализаторе «HEMOLUX 19». Гемограмма включала в себя показатели гемоглобина и эритроцитов, а также эритроцитарные индексы: средний диаметр эритроцитов (MCV), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (MCHC), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH), показатель анизоцитоза эритроцитов (RDW). Количество ретикулоцитов оценивали в мазках крови, окрашенных бриллиант-крезиловой синью.

Подсчёт миелокариоцитов костного мозга осуществляли в камере Го-ряева. Подсчёт миелограммы (Воробьев А.И., 1985; Меньшиков В.В., 1987; Файнштейн Ф.Э. и др., 1987) и клеток костномозгового микроокружения (Абрамов М.Г., 1985; Гольдберг Е.Д., 1989; Хоффбранд В., 2007) проводили на 400 ядросодержащих клеток костного мозга. Миелограмма содержала данные о процентном содержании клеток эритроидного ряда в целом, а также эритробластов, базофильных, полихроматофильных и оксифильных нормо-цитов и мегалобластов.

Трепанобиопсию подвздошной кости во всех случаях выполняли по строгим медицинским показаниям. Трепанобиоптаты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, затем декальцинировали в растворе ЭДТА (Трилон Б). Обезвоживание и пропитывание образцов парафином про 44

водили в автомате для обработки тканей STP-120.

Парафиновые срезы трепанобиоптатов подвздошной кости, толщиной 4 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, по методу ван Гизона, импре-гнировали серебром по методу Гомори. Полученные таким образом обзорные изображения фотографировали, тем самым, фиксируя окрашенные в различные цвета зоны.

Фиксация обзорных изображений парафиновых срезов осуществлялась с помощью цветной фото-видеокамеры Axio Cam (Германия). Величину площади зон, окрашенных в черный и розовый цвета, соответствующих фиброзной ткани, и величину площади зон, окрашенных в синий и бледно-розовый цвета, соответствующих гемопоэтической ткани, получали с помощью источника света и соответствующих RGB (красный, зеленый, синий) датчиков определения цвета, так что площадь окрашенных зон соответствовала электрическому напряжению на выходе цветовых датчиков. Площадь окрашенных зон получали с помощью установленного в цепи после RGB датчиков цифрового сигнального процессора. Анализ для получения величин площадей окрашенных зон производили с помощью компьютеризированного микроскопа Zeiss (Германия). В качестве источника света использовали RGB светодиодный источник света.

В парафиновых срезах трепанобиоптатов подвздошной кости, импре-гнированных серебром, в черный цвет окрашивалась ретикулиновая ткань (зона черного окраса). В парафиновых срезах трепанобиоптатов, окрашенных по методу ван Гизона, коллагеновая ткань окрашивалась в розовый цвет (зона розового окраса). В препаратах трепанобиоптатов, окрашенных гематоксилином и эозином, гемопоэтическая ткань окрашивалась в бледно-розовый (цитоплазма) (зона бледно-розового окраса) и в синий цвет (клеточные ядра) (зона синего окраса). Костная ткань в препаратах, окрашенных по ван Гизону и гематоксилином и эозином, имела ярко-розовый оттенок (зона ярко-розовой ткани), площадь фиброзной ткани определялась суммой площадей зон черного окраса и зон розового окраса. Площадь гемопоэтической ткани определялась суммой площадей зон синего и бледно-розового окрасов.

Высокая точность данного метода обеспечивалась применением автоматизированной оценки малых величин отклонения величин площадей фиброзной и гемопоэтической тканей, а оперативность улучшалась вследствие применения автоматизированного (компьютерного) способа определения соотношения указанных площадей (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996).

Степень миелофиброза устанавливали согласно шкале Европейского консенсуса (Thiele J. et. al., 2005). Миелофиброз 1-й степени (ретикулиновые волокна расположены рыхло, преимущественно в периваскулярных зонах) расценивали как начальный фиброз, МФ 2-й и 3-й степени (увеличение количества диффузно расположенных ретикулиновых волокон с очагами скопления коллагеновых волокон или их утолщенными пучками) определяли как выраженный фиброз (Tadmor T. et al., 2013).

Морфометрическое исследование МФ проводили с использованием программы анализа изображений AxioVision 4.6, камеры Axio Cam (Германия), микроскопа Zeiss (Германия), компьютера. В парафиновых срезах тре-панобиоптатов подвздошной кости, толщиной 4 мкм, импрегнированных серебром по методу Гомори и окрашенных по методу ван Гизона, при увеличении 200 измеряли абсолютную площадь фиброзной ткани.

На парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли абсолютную площадь гемопоэтической, жировой и костной ткани, синусоидов, а также опухолевой ткани. Изучали все костномозговые полости одного среза, что соответствовало 5 – 7 полям зрения микроскопа и 20 – 30 полям зрения камеры (в зависимости от размера среза). Площадь одного поля зрения камеры известна и составляла 364000 мкм2 (0,7мм2).

Сложив площадь фиброзной ткани во всех полях зрения камеры, полу чали суммарную абсолютную площадь фиброзной ткани в пределах одного среза (Sфибр.тк.). Аналогичным образом получали суммарную абсолютную площадь гемопоэтической и опухолевой ткани. Затем вычисляли относитель ную площадь фиброзной ткани по формуле: Sотн.фибр.тк. = Sфибр.тк./.Sгемопоэт.тк. 100%, где Sфибр.тк. – суммарная абсолютная площадь фиброзной ткани, Sгемопоэт.тк. – суммарная абсолютная площадь гемопоэтической ткани (Долгих Т.Ю. и др., 2015). Относительную площадь опухолевой ткани (Sотн.опух.тк.) вычисляли по формуле: Sотн.опух.тк. = Sопух.тк./(n 364000) 100%, где Sопух.тк. – суммарная абсолютная площадь опухолевой ткани, n – число проанализированных полей зрения.

Исследование миелофиброза у пациентов с множественной миеломой

По литературным данным, ретикулярные клетки способны непосредственно влиять на процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников (Абдулкадыров К.М., 2004), в связи с чем можно предположить, что интенсивность опухолевого роста в дебюте заболевания обусловлена патологическим процессом пролиферации опухолевой ткани под воздействием ретикулярных клеток.

Известно, что факторы, продуцируемые клетками стромы костного мозга, в том числе макрофагами и фибробластами, способствуют росту опухоли, непосредственно, миеломных клеток и опосредованно, усиливая ангио-генез. Повышенный ангиогенез коррелирует с ростом плазматических клеток у пациентов с ММ (Wrobel T. et al.,2003).

Рецидив ММ характеризуется самым большим количеством адипоци-тов и адвентициальных клеток (р 0,05) (рис. 20). Данный факт можно объяснить вытеснением нормальных ростков кроветворения опухолевой тканью и, соответственно, при рецидиве заболевания в условиях уменьшения нормальной миелоидной ткани, учитывая функциональные особенностиадипоцитов и адвентициальных клеток, можно предположить их повышенное образование. В части адвентициальных клеток обнаруживаются крупные жировые капли. Наличие переходных форм между адвентициальными клетками и адипоци-тами указывает на возможности развития жировой ткани костного мозга человека из адвентициальных ретикулярных клеток (Trentin J.J. et al., 1971).

В фазе после ХТ и в рецидиве ММ отсутствуют эндотелиоциты, остеобласты отсутствуют в рецидиве заболевания. В настоящее время известно, что повышенная пролиферативная активность гемопоэтической ткани характеризуется увеличенным количеством стромальных клеток в состоянии повышенной функциональной активности (Tauro S. еt al., 2002; La Russa V. еt al., 2002). Вероятно, этим можно объяснить отсутствие эндотелиоцитов у пациентов в фазе после ХТ и в рецидиве, поскольку более активное и агрессивное течение множественная миелома имеет в дебюте заболевания.

В своей работе С.С.Бессмельцев и К.М.Абдулкадыров (2004) обнаружили отрицательную корреляционную связь между объемом костной ткани и количеством эритроцитов в периферической крови. По результатам проведенного нами корреляционного анализа между клетками костномозгового микроокружения и клетками периферической крови выявлена достоверная прямая взаимосвязь между остеобластами и количеством эритроцитов в периферической крови (r=0,901; р=0,000). Представленные данные указывают на то, что активность остеобластных элементов прямо или опосредованно приводит к угнетению эритропоэза и, следовательно, вносит свой вклад в патогенез анемического синдрома у больных ММ.

Вопросы взаимосвязей клеток микроокружения с маркерами опухолевой массы в настоящее время мало изучены. Нами был проведен корреляционный анализ между стромальным микроокружением и маркерами опухолевой массы у всех пациентов, у которых было исследовано костномозговое микроокружение (n=42). Выявлены взаимосвязи между остеобластами и содержанием альбумина (r=-0,410, р=0,011), а также суточной экскрецией белка с мочой (r=0,582, р=0,000). Обнаружена обратная взаимосвязь фибробластов с альбумином (r=-0.413;р=0,010), прямая связь с суточной экскрецией белка с мочой (r=0,704; р=0,000). Достоверная прямая связь выявлена между адвен-тициальными клетками и фибриногеном (r=0,393;р=0,015). Прямая корреляционная связь отмечалась между адипоцитами и ЛДГ (r=0,550;р=0,000), а так же суточной экскрецией белка с мочой (r=0,369; р=0,023). Выявлены взаимосвязи эндотелиоцитов с количеством альбуминов (r=-0,320;р=0,050), суточной экскрецией белка с мочой (r=0,495; р=0,002).

Морфометрическое исследование костномозгового микроокружения в трепанобиоптатах подвздошной кости показало, что Sотн.костн.тк. в любой фазе ММ достоверно меньше, чем в контрольной группе (р 0,05) (табл. 10). Относительная площадь опухолевой ткани в рецидиве заболевания оказалась больше, чем в дебюте заболевания (р=0,042).

При исследовании миелофиброза у пациентов с множественной миело-мой выявлено, что в рецидиве заболевания МФ встречался в 85,7% случаев, что в 1,5 раза чаще, чем в дебюте заболевания (57%) и в фазе ответа на ХТ (57%) (рис. 21).

В пределах одного среза трепанобиоптатов встречается сочетание различных степеней МФ, при этом в дебюте ММ с равной частотой (рис. 22). Таблица 10. Морфометрическое исследование трепанобиоптатов подвздошной кости при множественной миеломе, М±о Относительная площадь, % 1-я группа(N=21) 2-я группа (N=14) 3-я группа(N=7) Контрольная группа (N=10) Примечание. - р 0,05 по сравнению с дебютом множественной миеломы; # - р 0,05 по сравнению с контрольной группой. Рис. 21. Частота встречаемости миелофиброза при множественной миеломе в различные фазы заболевания, %.

Частота встречаемости МФ-1, МФ-2 и МФ-3 в различные фазы заболевания, %. У пациентов, ответивших на ХТ, преобладает сочетание начального и выраженного МФ, в то время как у пациентов в рецидиве заболевания преобладает выраженный МФ. Независимо от фазы заболевания начальный МФ встречается примерно с одинаковой частотой (в дебюте – 33,0%, в фазе ответа на лечение – 25,0%, в рецидиве – 33,0%).

В дебюте ММ и у пациентов, ответивших на ХТ, Sотн.фибр.тк. при МФ-1 (рис. 23, 24) превышает Sотн.фибр.тк. при МФ-2 (рис. 25, 26) и МФ-3 (рис. 27, 28) (табл. 11). При этом Sотн.фибр.тк. при МФ-1 у пациентов, ответивших на ХТ, достоверно больше, чем у пациентов в дебюте заболевания.

Примечание. – р 0,001 по сравнению с дебютом заболевания при МФ-1; - p 0,001 по сравнению с показателем пациентов, ответивших на химиотерапию, при МФ-1.

У больных в рецидиве Sотн.фибр.тк. при МФ-2 выше, чем аналогичный показатель у больных в дебюте ММ и у пациентов, ответивших на ХТ. У пациентов в рецидиве Sотн.фибр.тк. при МФ-3 так же выше, чем Sотн.фибр.тк. при МФ-3 у пациентов в дебюте ММ и у пациентов, ответивших на ХТ.

Анализ величины Sотн.фибр.тк. при начальном, выраженном МФ и сочетании начального и выраженного МФ в различных стадиях ММ выявил, что этот показатель в III стадии достоверно больше, чем в I стадии (р 0,001) независимо от выраженности МФ (табл. 12).

Исследование периферического звена эритрона и баланса цитокинов в различных фазах множественной миеломы

Морфометрическое исследование костномозгового микроокружения в трепанобиоптатах подвздошной кости показало, что Sотн.костн.тк. в любой фазе ММ достоверно меньше, чем в контрольной группе (р 0,05). Относительная площадь опухолевой ткани в рецидиве заболевания оказалась больше, чем в дебюте заболевания (р=0,042). При исследовании МФ у пациентов с ММ выявлено, что в рецидиве заболевания МФ встречался в 85,7% случаев, что в 1,5 раза чаще, чем в дебюте заболевания (57%) и в фазе ответа на ХТ (57%).

В дебюте ММ и у пациентов, ответивших на ХТ, преобладает МФ-1: в этих группах Sотн.фибр.тк. при МФ-1 превышает Sотн.фибр.тк. при МФ-2 и МФ-3. При этом Sотн.фибр.тк. при МФ-1 у пациентов, ответивших на ХТ, достоверно больше, чем у пациентов в дебюте заболевания.

У больных в рецидиве Sотн.фибр.тк. при МФ-2 выше, чем аналогичный показатель у больных в дебюте ММ и у пациентов, ответивших на ХТ. У пациентов в рецидиве Sотн.фибр.тк. при МФ-3 также выше, чем Sотн.фибр.тк. при МФ-3 у пациентов в дебюте ММ и у пациентов, ответивших на ХТ.

Сочетание МФ различной степени в пределах одного трепанобиоптата, возможно, объясняется динамикой развития фиброза, воздействием одновременно факторов, различных по силе воздействия, и требует дальнейшего изучения, в частности, определения ассоциаций степени и площади МФ с такими прогностическими маркёрами, как степень дифференцировки плазматических клеток и их митотическая активность.

У пациентов с ММ после ХТ преобладает сочетание начального и выраженного МФ, в то время как у пациентов в рецидиве заболевания преобладает выраженный МФ. Независимо от фазы заболевания начальный МФ встречается примерно с одинаковой частотой.

Выявлено, что у пациентов, ответивших на ХТ, количество тромбоцитов достоверно выше (р 0,05) по сравнению с дебютом множественной мие-ломы и контрольной группой, а в рецидиве достоверно ниже, чем у пациентов с ответом на ХТ (р 0,05). Обнаружена достоверная обратная корреляция степени инфильтрации пунктата костного мозга плазматическими клетками с количеством тромбоцитов в периферической крови у пациентов с ММ в дебюте заболевания, что может быть обусловлено опухолевой метаплазией костного мозга (Бессмельцев С.С. и др., 2004).

Полученные в работе результаты свидетельствуют о редукции красного ростка костного мозга до начала цитостатического лечения и в рецидиве по сравнению с группой после ХТ и группой контроля при ММ; степень редукции зависит от выраженности опухолевой инфильтрации костного мозга.

Распространенность анемии при ММ в данном исследовании составила 68,23%, что соответствует литературным данным (Birgegard G., 2008; Kyle R.A. et al., 2009).

В нашей работе не обнаружено прямой корреляционной связи между количеством эритроидных клеток костного мозга и уровнем гемоглобина и эритроцитов периферической крови. Содержание эритроцитов и гемоглобина в периферической крови существенно не отличалось у пациентов с различной степенью гипоплазии костномозгового красного ростка. Аналогичные данные были получены при исследованиях, посвященных проблеме анемии при ММ (Сараева Н.О. и др., 2006; Ludwig H., 2000).

Объяснением этого может служить возможность развития внекостно-мозговых очагов кроветворения, в частности, эритропоэза, при гемобластозах с опухолевым поражением костного мозга. В современной литературе описаны случаи развития экстрамедуллярного гемопоэза в органах ретикуло-эндотелиальной системы (печени, селезенке, лимфатических узлах) и почках при гематологических заболеваниях, а также при некоторых опухолях печени и почек как в эксперименте, так и в клинической практике (Arkadopoulos N. еt al., 2009).

При проведении корреляционного анализа клеток периферической крови с маркерами опухолевой массы отмечена прямая взаимосвязь эритроцитов с количеством тромбоцитов и обратная с уровнем суточной протеинурии, общим белком сыворотки, альбумином. Определено, что уровень гемоглобина прямо коррелирует с количеством тромбоцитов, суточной протеинурией, альбумином, а с общим белком сыворотки, СРБ и фибриногеном существует обратная связь. Выявленную прямую корреляционную связь между уровнем альбумина сыворотки и показателями гемоглобина периферической крови можно рассматривать с различных сторон. Гипоальбуминемия является важным прогностическим фактором, определяющим высокую степень риска при ММ. Существуют данные, подтверждающие наличие обратной связи между уровнем сывороточного альбумина и ИЛ-6, являющегося основным фактором роста для миеломных клеток (Pelliniemi T.T. et al., 1995). Поэтому уровень альбумина сыворотки у пациентов с ММ является косвенным показателем про-лиферативной активности опухолевых клеток (Андреева Н.Е., 2003).

С другой стороны, по данным ряда исследователей, ИЛ-6 является ингибитором синтеза эндогенного эритропоэтина (Поспелова Т.И., Лямкина А.С., 2008; Pagel H. еt al., 1989; Cazzola M. еt al., 1995), и его повышенная продукция, ассоциированная с гипоальбуминемией, является дополнительным фактором, угнетающим эритропоэз.

При проведении сравнительной характеристики костномозгового ком-партмента эритрона у пациентов с ММ до начала цитостатического лечения выявлена значимая редукция клеточных популяций эритроидного ряда по сравнению с группой пациентов, ответивших на лечение, и группой контроля (р 0,05).

В дебюте ММ, а также у пациентов после ХТ выявлена достоверная корреляционная связь степени инфильтрации костного мозга плазматическими клетками с уровнем гемоглобина и количеством эритроцитов в периферической крови. У пациентов в рецидиве также выявлена достоверная корреляционная связь степени инфильтрации костного мозга плазматическими клетками с уровнем гемоглобина и количеством эритроцитов в периферической крови.

При проведении однофакторного анализа выявлено, что количество тромбоцитов периферической крови ниже 100х109/л является фактором, ассоциированным с развитием анемического синдрома (Hb менее 100 г/л).

При проведении многофакторного анализа показано, что независимыми факторами при развитии анемического синдрома (Hb менее 120 г/л) являются: суточный белок в моче более 90 г/л, общий белок сыворотки более 100 г/л.