Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Ядрышковые организаторы и нуклеолярный аппарат клетки: структура, функции и значение при исследовании опухолевого роста 19
1.1. Особенности молекулярной организации рибосомных генов 19
1.2. Характеристика основных структурных компонентов ядрышка и основные классификации нуклеол 21
1.3. Морфофунциональная характеристика нуклеолонемного типа ядрышек 23
1.4. Морфофункциональная характеристика переходного типа ядрышек 24
1.5. Морфофунциональная характеристика кольцевидного типа ядрышек 25
1.6. Морфофункциональная характеристика микроядрышек и свободных фибриллярных центров 27
1.7.Аргирофильные белки ядрышка: строение и функции 29
1.8. Взаимосвязь морфофункциональной активности нуклеолярного аппарата с клеточным циклом 34
1.9. Ядрышковые организаторы в оценке пролиферативного потенциала клетки
1.10. Морфофункциональная активность ядрышковых организаторов и плоидность клеточного ядра 39
1.11. Структурные преобразования нуклеолярного аппарата при дифференцировке и специализации клеток 42
1.12. Участие белков ядрышка в апоптозе 43
1.13. Значение морфометрического исследования ядрышек 46
1.14. Гетерогенность ядрышкового аппарата в различных популяциях опухолевых клеток и ее клиническое значение 47
1.15. Значение исследования ядрышковых организаторов онкоморфологии 49
собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования 55
2.1. Материал исследования 55
2.2. Методы исследования
2.2.1. Гистологические методы 57
2.2.2. Гистохимические методы з
2.2.3. Исследование митотического режима 60
2.2.4. Иммуногистохимические методы 60
2.2.5. Морфометрические методы 62
2.2.6. Морфоденситофотометрические методы 64
2.2.7. Статистические методы 65
Глава 3. Морфофункциональная характеристика нуклеолярного аппарата клеток неизмененной ткани почки 66
Глава 4. Морфофункциональная характеристика нуклеолярного аппарата опухолевых клеток при почечно-клеточном раке 72
4.1. Морфофункциональная характеристика нуклеолярного аппарата опухолевых клеток в зависимости от пола больных 72
4.2. Морфофункциональная характеристика нуклеолярного аппарата опухолевых клеток в зависимости от возраста больных 74
4.3. Морфофункциональная активность нуклеолярного аппарата клеток в различных гистологических вариантах ПКР 79
4.4. Морфофункциональная активность нуклеолярного аппарата клеток ПКР в зависимости от клинической стадии заболевания 93
4.5. Морфофункциональная активность нуклеолярного аппарата клеток ПКР в зависимости от размера опухолевого узла 97
4.6. Морфофункциональная активность нуклеолярного аппарата клеток ПКР различной степени анаплазии 101
4.7. Морфофункциональная активность нуклеолярного аппарата клеток ПКР при метастазировании 105
Глава 5. Морфометрическое исследование морфо функциональной активности нуклеол при почечно-клеточном раке 110
5.1. Морфометрическая характеристика нуклеолярного аппарата опухолевых клеток в зависимости от пола больных 111
5.2.Морфометрическая характеристика нуклеолярного аппарата опухолевых клеток в зависимости от возраста больных 112
5.3. Морфометрические параметры ядрышкообразующих зон клеток в различных гистологических вариантах ПКР 114
5.4. Морфометрическая характеристика нуклеолярного аппарата клеток ПКР в зависимости от клинической стадии заболевания 118
5.5. Морфометрическая характеристика нуклеолярного аппарата клеток ПКР в зависимости от размера опухолевого узла 121
5.6. Морфометрическая характеристика нуклеолярного аппарата клеток ПКР различной степени анаплазии 122
5.7. Морфометрическая характеристика нуклеолярного аппарата клеток ПКР при метастазировании 125
Глава 6. Количественное исследование содержания белка нуклеофозмина/b23 в ядрышках опухолевых клеток при почечно-клеточном раке 128
6.1. Количественное определение белка нуклеофозмина/B23
в опухолевых клетках в зависимости от пола больных 128
6.2. Количественное определение белка нуклеофозмина/B23
в опухолевых клетках в зависимости от возраста больных 128
6.3. Количественное определение белка нуклеофозмина/B23 в опухолевых клетках в различных гистологических вариантах ПКР 129
6.4. Количественное исследование ядрышкового белка нуклео-фозмина/B23 в ядрах опухолевых клеток ПКР в зависимости от клинической стадии 130
6.5. Количественное исследование ядрышкового белка нуклео фозмина/B23 в ядрах опухолевых клеток ПКР в зависимости
от размера опухолевого узла 131
6.6. Количественное исследование ядрышкового белка нуклео-фозмина/B23 в ядрах опухолевых клеток ПКР различной степени анаплазии 132
6.7. Количественное исследование ядрышкового белка нуклео-фозмина/B23 в ядрах опухолевых клеток при метастазировании 134
Глава 7. Морфофункциональная активность ядрышковых организаторов в зависимости от уровня ангиогенеза, факторов пролиферации и апоптоза
7.1. Морфофункциональная активность ядрышковых организаторов ПКР в зависимости от уровня ангиогенеза в опухоли
7.2. Морфофункциональная активность ядрышковых организаторов и плоидность опухоли
7.3. Морфофункциональная активность ядрышковых организаторов и пролиферативная активность клеток опухоли (по данным исследования митотического режима)
7.4. Морфофункциональная активность ядрышковых организаторов и пролиферативная активность клеток опухоли (по данным индекса мечения Ki-67)
7.5. Морфофункциональная активность ядрышковых организаторов в p53-позитивных и p53-негативных опухолях
7.6. Морфофункциональная активность ядрышковых организаторов в bcl-2-позитивных и bcl-2-негативных опухолях
Глава 8. Коррелятивные взаимосвязи нуклеолярных маркеров с клинико-морфологическими и молекулярно-биологическими параметрами почечно-клеточного рака
8.1. Взаимосвязи количества ФЦ (AgNORs) на 1 ядро с клинико-морфологическими и биомолекулярными параметрами ПКР 8.2.Взаимосвязи числа ядрышек на 1 ядро с клинико-морфо логическими и биомолекулярными параметрами ПКР 151
8.3. Взаимосвязи количества КЯд на 1 ядро с клинико-морфо-логическими и биомолекулярными параметрами ПКР 152
8.4. Взаимосвязи количества ПЯд на 1 ядро с клинико-морфо-логическими и биомолекулярными параметрами ПКР 153
8.5. Взаимосвязи количества ФЦ в ПЯд с клинико-морфологическими и биомолекулярными параметрами ПКР 154
8.6. Взаимосвязи количества НЯд на 1 ядро с клинико-морфо-логическими и биомолекулярными параметрами ПКР 155
8.7. Взаимосвязи количества ФЦ в НЯд с клинико-морфологическими и биомолекулярными параметрами ПКР 156
8.8. Взаимосвязи площади ЯОЗ на 1 ядро с клинико-морфологическими и биомолекулярными параметрами ПКР 157
8.9. Взаимосвязи интегральной оптической плотности белка нуклеофозмина/B23 на 1 ядро с клинико-морфо-логическими и биомолекулярными параметрами ПКР 157
Глава 9. Однофакторный и многофакторный прогностический анализ выживаемости больных при почечно-клеточном раке 159
9.1. Клинико-морфологические, нуклеолярные параметры и послеоперационная выживаемость больных 159
9.2. Однофакторный прогностический анализ выживаемости больных 182
9.3. Многофакторный прогностический анализ выживаемости больных 183
Заключение 185
Выводы 210
Практические рекомендации
- Морфофункциональная характеристика переходного типа ядрышек
- Исследование митотического режима
- Морфофункциональная характеристика нуклеолярного аппарата опухолевых клеток в зависимости от возраста больных
- Морфометрическая характеристика нуклеолярного аппарата клеток ПКР в зависимости от размера опухолевого узла
Введение к работе
Актуальность проблемы. В структуре заболеваемости злокачественными опухолями в ряде стран мира рак почки (РП) выходит на 10-е место и составляет 3% от заболеваемости злокачественными новообразованиями у взрослых (Parkin D. et al., 2005). Ежегодно в мире регистрируется более 200 тыс. новых случаев РП и их количество продолжает расти (Mickisch G.H., 2002). В общей структуре заболеваемости в России (для обоих полов) злокачественные новообразования почки в 2009 г. составили 3,6%, что соответствует 11-му ранговому месту (Аполихин О.И. и др., 2011). В Алтайском крае эти показатели выше общероссийских: 11,96 и 8,54 соответственно (Давыдов М.И. и др., 2005; Чиссов В.И. и др., 2003). Смертность от РП в Алтайском крае с 2008 по 2013 г. повысилась с 4,3 до 5,5 тыс. на 100 тыс. населения. Пик смертности от РП в Алтайском крае приходился на 2011 г. – 7,0 на 100 тыс. населения (Ганов Д.И. и др., 2014).
Большое социальное значение РП обусловлено выраженной связью этой патологии с урбанизацией и низкой выживаемостью больных после лечения, так как РП, как правило, в значительной степени резистентен к лучевой и химиотерапии (Юрин А.Г., 2007).
РП представляет собой гетерогенную группу опухолей различных по гистогенезу и клиническому течению. Преобладающей формой среди первичных опухолей почек является почечно-клеточный рак (ПКР), который встречается в 90 – 95% всех случаев опухолей почек у взрослых. Особенностью РП является медленный рост с одновременной агрессивностью и непредсказуемостью течения (Юрин А.Г., 2007). В то же время каждый из гистологических вариантов ПКР имеет свои уникальные клинические и морфологические характеристики. ПКР обладает высоким метастатическим потенциалом. У 30 – 50% пациентов диагностируются дистантные метастазы в различные сроки после нефрэкто-мии. Средняя послеоперационная выживаемость больных этой категории составляет 6 – 12 мес (Матвеев В.Б. и др., 2005).
Одной из важнейших проблем онкоурологии и патологической анатомии остается улучшение качества диагностики, разработка новых дополнительных критериев в определении прогноза выживаемости больных после проведения хирургического лечения РП. На сегоднящий день нет достоверных прогностических факторов, обладающих необходимой чувствительности и специфичностью, что заставляет продолжать исследования в этом направлении. Применение классических прогностических факторов, таких как размер опухоли, стадия заболевания, степень дифференцировки и злокачественности опухолевых клеток далеко не всегда позволяет прогнозировать течение рака почки у конкретного пациента (Шустицкий Н.А., 2007). В основе данного явления может лежать явление широкой гетерогенности РП по молекулярно-биологическим характеристикам клеточных элементов в разных участках опухоли (Ljungberg B. et al., 1996; Nenning H. et al., 1997).
Возникновение множественных популяций опухолевых клеток с различными свойствами в пределах одной и той же опухоли является следствием их генетической неустойчивости (van der Poel H.G. et al., 1993). Значение гетерогенности клеток опухоли как прогностического фактора показана при раке ряда локализаций (Vindelov L.L. et al., 1980; Quirkel P. et al., 1987; Sasaki K. et al., 1988, 1991; Carey F.A. et al., 1990; Marusyk A. et al., 2010]. Гетерогенность клонов ПКР выявлена в некоторых работах, но по большей мере это касается плоидности, а значение гетерогенности нуклеолярных параметров при РП не исследована.
Изучение активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток представляется нам актуальным, поскольку она может быть взаимосвязана со степенью пролиферации, апоптоза и ангиогенезом опухоли при ПКР и поэтому нуждается в дальнейшей оценке.
В настоящее время все больше ощущается необходимость для пациентов быть информированными по различным аспектам заболевания ПКР, включая риск метастазирования
и вероятного исхода. Точные факторы прогноза также могут помочь в разработке оптимальных алгоритмов наблюдения для вероятности прогнозирования рецидивирования заболевания (Cерегин А.В. и др., 2009). Поэтому имеется необходимость в разработке новых дополнительных факторов прогноза при ПКР.
Таким образом, определение количественных, морфометрических и иммуногистохи-мических параметров ядрышкового аппарата опухолевых клеток у больных при ПКР является актуальной проблемой, решение которой может позволить объективизировать прогноз заболевания.
Цель исследования – изучить клинико-морфологические и молекулярно-биологические параметры почечно-клеточного рака с оценкой особенностей нуклеологенеза для разработки критериев прогноза послеоперационной выживаемости больных.
Задачи исследования:
-
Изучить морфологические, морфометрические, иммуногистохимические особенности ядрышек и количественные соотношения их морфофункциональных типов в неизмененной ткани почки.
-
Определить морфологические, морфометрические, иммуногистохимические параметры и количественное распределение различных морфофункциональных типов ядрышек при почечно-клеточном раке во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами: полом и возрастом больных, гистологическим типом, стадией патологического процесса, размером, степенью анаплазии и метастатическим потенциалом опухоли.
-
Выявить взаимосвязи морфологических, морфометрических, иммуногистохимиче-ских характеристик ядрышек и количественного распределение различных морфофункци-ональных типов ядрышек рака почки с маркерами пролиферации: содержанием ДНК, ми-тотическим индексом и экспрессией Ki-67.
-
Выявить особенности морфологических, морфометрических, иммуногистохимиче-ских параметров и количественного распределения различных морфофункциональных типов ядрышек почечно-клеточного рака во взаимосвязи с экспрессией маркеров апоптоза p53 и bcl-2.
-
Изучить взаимосвязь морфологических, морфометрических, иммуногистохимиче-ских характеристик ядрышек клеток рака почки и количественного соотношения их различных морфофункциональных типов с выраженностью ангиогенеза в опухоли.
-
Изучить общую 5-летнюю выживаемость больных почечно-клеточном раком после хирургического лечения в зависимости от клинико-морфологических, молекулярно-биологических и нуклеолярных характеристик опухоли.
-
Провести одно- и многофакторный регрессионный анализ клинико-морфологических, молекулярно-биологических и нуклеолярных параметров рака почки для определения прогностически значимых критериев.
Научная новизна. Впервые на большом операционном материале ПКР выявлены и систематизированы взаимосвязи нуклеолярных параметров опухолевых клеток с рядом важнейших патоморфологических и молекулярно-биологических параметров опухоли: полом, возрастом, клинической стадией заболевания, размером опухоли, степенью ана-плазии по Fuhrman, наличием метастазов, степенью выраженности неоангиогенеза, про-лиферативным и апоптотическим статусом.
Впервые детально охарактеризованы морфологические, морфометрические и иммуно-гистохимические особенности нуклеолярного аппарата РП в зависимости от степени злокачественности опухоли. Показано, что нуклеолярные характеристики могут являться значимыми критериями при определении степени злокачественности опухолевых клеток при ПКР: чем больше в опухолевых клетках активно работающих ядрышковых организаторов, тем выше степень злокачественности новообразования.
Впервые показана взаимосвязь активности нуклеолярного аппарата с метастатическим и инвазивным потенциалами опухоли при ПКР. В метастазирующих карциномах по срав-4
нению с локализованными выявляется более широкая гетерогенность клеток по активности ядрышкового аппарата, с образованием значительного числа клонов с высокой активностью ядрышек, что, по-видимому, является следствием селекции опухолевых клеток с более высоким метастатическим потенциалом. Выявление таких клеток имеет большое значение для прогнозирования развития метастазов на дооперационном периоде.
Взаимосвязь параметров активности нуклеолярного аппарата с маркерами пролиферации (плоидностью, митотическим индексом и Ki-67) позволяют рассматривать их в качестве индикаторов процесса пролиферации.
Впервые выявлено значение состояние неоангиогенеза и влияния гипоксии на морфо-функциональную активность ядрышковых организаторов при ПКР. Недостаточность нео-ангиогенеза и возникновение гипоксии приводит к гиперэкспрессии онкопротеина нук-леофозмина/B23, который активирует белок супрессор p53, что еще более повышает про-лиферативный потенциал опухолевых клеток и их злокачественность.
Впервые проведен однофакторный регрессионный анализ 5-летней послеоперационной выживаемости больных с применением новых нуклеолярных критериев прогноза: числа ядрышек, числа фибриллярных центров (ФЦ), площади ядрышкообразующих зон (ЯОЗ), интегральной оптической плотности (ИОП) белка нуклеофозмина/B23, содержания кольцевидных (КЯд), переходных (ПЯд) и нуклеолонемных ядрышек (НЯд), числа ФЦ в НЯд и ПЯд.
Впервые на основе многофакторного регрессионного анализа по Коксу сопоставлены патоморфологические, молекулярно-биологические прогностические факторы опухоли и параметры активности нуклеолярного аппарата с выделением наиболее значимых критериев 5-летней послеоперационной выживаемости пациентов.
Впервые показана прогностическая значимость ряда новых нуклеолярных маркеров опухолевых клеток при ПКР, таких как: число ФЦ в НЯд на 1 ядро; площадь ЯОЗ на 1 ядро; содержание НЯд на 1 ядро; ИОП белка нуклеофозмина/B23 на 1 ядро и количество ФЦ на 1 ядро.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования представляют собой новые знания о патогенезе и молекулярно-биологических особенностях ПКР. Полученные результаты могут служить основой для дальнейшего исследования взаимосвязи патоморфологии ядрышек и клинико-морфологических параметров при раке других локализаций. Данные о структурной организации ядрышек и экспрессии ядрышко-вого белка нуклеофозмина/B23 в клетках РП могут иметь прикладное значение и способствовать выработке новых дополнительных критериев прогноза, методов диагностики и лечения ПКР.
Результаты количественного подсчета ФЦ, компьютерного морфометрического анализа площади ядрышек и интегральной оптической плотности нуклеофозмина/B23 могут быть использованы при классификации ядрышек в качестве объективных критериев.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.Неизмененная ткань почки характеризуется низкой морфофункциональной активностью нуклеолярного аппарата, большим количеством КЯд и ПЯд и невысокой ИОП белка нуклеофозмина B/23.
-
Клинико-морфологические параметры ПКР (стадия заболевания, степень анаплазии, гистологический тип, размер новообразования и метастатический потенциал опухоли) коррелируют с нуклеолярными характеристиками опухолевых клеток: числом ядрышек и ФЦ, содержанием КЯд, ПЯд и НЯд, количеством ФЦ в ПЯд и НЯд, площадью ЯОЗ и ИОП белка нуклеофозмина/B23.
-
Морфофункциональная активность нуклеолярного аппарата клеток ПКР коррелирует с факторами пролиферации: плоидностью, митотическим индексом и ИМ Ki-67. Высокое число ядрышек и ФЦ; содержание НЯд; количество ФЦ в НЯд; значительная площадь ЯОЗ; большая ИОП белка нуклеофозмина/B23 в сочетании с уменьшением количества
КЯд и ПЯд свидетельствует о высокой пролиферативной активности клеток опухоли.
Параметры ядрышковой активности при ПКР взаимосвязаны с процессами апоптоза происходящими в опухоли. В p53-позитивных и bcl-2-негативных опухолях параметры ядрышковой активности достоверно выше.
-
Плотность микроциркуляторного русла (ПМЦР) в опухоли оказывает влияние на параметры нуклеологенеза опухолевых клеток. При низкой плотности микрососудов возрастают параметры ядрышковой активности: число ядрышек и ФЦ; содержание НЯд; количество ФЦ в НЯд; площадь ЯОЗ; ИОП белка нуклеофозмина/B23. Количество КЯд и ПЯд при этом снижается.
-
Неблагоприятными факторами 5-летней выживаемости больных являются: наличие регионарных и отдаленных метастазов; высокая степень анаплазии по Fuhrman; ІІІ-ІV клинические стадии по TNM; высокая митотическая активность; саркоматоидный вариант опухоли; инвазия опухоли в жировую клетчатку; количество AgNORs в клетках опухоли; площадь ЯОЗ в клетках опухоли; ИОП белка нуклеофозмина/B23; содержание НЯд в опухолевых клетках; экспрессия p53 в опухолевых клетках; экспрессия Ki-67 в опухолевых клетках; содержание КЯд в клетках опухоли; число ФЦ в НЯд; размер опухоли; плоид-ность клеток опухоли; ПМЦР в опухоли; экспрессия маркера Bcl-2 в опухолевых клетках и количество ядрышек в клетках опухоли.
-
Независимыми факторами прогноза при ПКР являются: наличие регионарных и отдаленных метастазов (t=3,2; p=0,001); ІІІ-ІV стадии по TNM (t=-2,9; p=0,004); число ФЦ в НЯд 6 (t=-2,6; p=0,008); площадь ЯОЗ 2 мкм2 (t=2,25; p=0,02); размер опухолевого узла 7 см (t=2,2; p=0,03); содержание НЯд в клетках опухоли 46% (t=2,15; p=0,03); ИОП белка нуклеофозмина/B23 1000 у.е. (t=2,1; p=0,03) и количество AgNORs в клетках опухоли 5 (t=2,0; p=0,05).
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на XІV Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2010); Всероссийской научно-практической конференции онкоурологов (Красноярск, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Барнаул, 2010); 6-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2010); X региональной научно-практической конференции урологов Сибири (Барнаул, 2011); Российской научно-практической конференции с международным участием (Барнаул, 2011); 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2011); Дальневосточной научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Владивосток, 2011); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной памяти член-кор. РАМН, з.д.н. РФ, профессора О.В.Хмельницкого «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Санкт-Петербург, 2011); VІ конгрессе Российского общества онкоурологов (Москва, 2011); 8-й конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения – 2012» (Санкт-Петербург, 2012); Российской научно-практической конференции с международным участием «Высокие технологии в онкологии» (Барнаул 2012); VII региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012); ІІІ Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2012); VII съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Астана, 2012); VІІ конгрессе Российского общества он-коурологов (Москва, 2012); Российской научно-практической конференции с международным участием (Барнаул, 2013); VII конгрессе Российского общества онкоурологов (Москва, 2013); конференции «Медицинская наука и здравоохранение», посвященной 60-летию АГМУ (Барнаул, 2014); Российской научно-практической конференции с международным участием «Таргетная терапия в онкологии» (Барнаул, 2014).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 55 работ в республиканских и международных изданиях, из них 22 – в ведущих рецензируемых научных изданиях, рекомен-6
дуемых ВАК РФ. Получен патент РФ на изобретение № 2447438 от 07.06.2010.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследований», 8 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Общий объем диссертации 272 страниц машинописного текста. Указатель литературы содержит 595 отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 53 таблицами и 129 рисунками.
Морфофункциональная характеристика переходного типа ядрышек
Выяснение механизмов возникновения и прогрессии опухолевого процесса рассматривается как важнейшая задача современной экспериментальной и клинической патологии. Наряду с такими известными проявлениями злокачественной трансформации как увеличение размеров и плоидности ядра, изменение ядерно-цитоплазматического соотношения, возрастание параметров пролиферации и апоптоза, динамика структурных и морфофункцио-нальных перестроек нуклеолярного аппарата опухолевой клетки также могут служить основой для патоморфологических методов оценки этапов опухолевой прогрессии [Левитан Н.В., 1990].
1.1. Особенности молекулярной организации рибосомных генов
Первые упоминания о ядрышках относятся к концу XІX века, когда в научные исследования стали активно внедряться различные методы окрашивания ядра [Мамаев Н.Н. и др., 1992]. Именно в этот период Pianese G. (1896) сообщил, что гипертрофированные ядрышки, неправильной формы, характерны для малигнизированных клеток. В 1965 году Ф. Ритосса и С. Спигел-мен установили, что ядрышко является участком хромосомы, называемым ядрышковым организатором (ЯО), в котором транскрибируются гены рибо-сомных 18S РНК и 28S РНК [Владимирова Т.М. и др., 2006]. Эта РНК ответственна за сборку рибосом. Образно говоря, активно работающий ЯО, по меткому определению Джона Крокера, [Крокер Д., 1999] можно назвать «фабрикой» рибосом. Под контролем ЯО 18S- и 28S- субъединицы объединяются с образующимися вне ядрышка 5S-субъединицами, которые для образования зрелых рибосом транспортируются через ядерные поры. У человека ЯО располагаются на коротком плече пяти акроцентрических хромосом, из которых 13, 14, 15 относят к группе D и 21, 22 относят к группе G.
В акроцентрической хромосоме копии рибосомной ДНК (рДНК) организованы в виде тандемных повторов, образующих протяженный кластер [Ляпунова Н.А. и др., 2001]. Первые электронно-микроскопические фотографии активной транскрипции рибосомных генов (р-генов) на препаратах, фиксированных в щадящих условиях, показали растущие нити транскриптов рРНК, отходящие от матрицы рДНК, лишенной видимых нуклеосом; образующие своеобразные характерные «лочки», отражающие постепенное удлинение транскриптов и прерывающиеся нетраскрибируемыми участками (спейсерами) [Збарский И.Б., 1988; Franke W.W., 1979]. Точность определения числа рибосомных повторов в геноме напрямую зависит от используемого метода. Так, метод Вейко Н.Н и соавт. (1996, 2000) позволил показать, что количество рДНК человека может варьировать у различных индивидов от 390 до 580 копий на диплоидный набор хромосом. Ляпуновой Н.А. и соавт. (2001) выделено четыре морфофункциональных варианта р-генов: 1) активные (транскрибируемые); 2) потенциально активные (не транскрибируемые в данном типе клеток); 3) неактивные; 4) «молчащие». Указанные варианты различаются свойствами конформации (доступности модифицирующим агентам) транскрибируемой областью рДНК, «плотностью» метилирования цитозиновых оснований в транскрибируемой области рДНК.
Факт существования «молчащих» р-генов подтверждает способность ядрышек к компенсаторной гипертрофии. Выявлено, что ультрафиолетовое облучение одного из ядрышек в клетке приводит к инактивации и деградации облученного ядрышка и, в тоже время, к компенсаторному росту и активации другого, необлученного [Зацепина О.В. и др., 1988; Сахаров В.Н. и др., 1978; 1988]. При этом активация сопровождается значительным увеличением числа фибриллярных центров (ФЦ) и уменьшением их линейных размеров по сравнению с контролем; в деградирующих ядрышках число ФЦ уменьшается, а их размеры увеличиваются. Активацией «молчащих» копий р-генов можно также объяснить увеличение площади серебрения аргирофильных белков ядрышка при физиологическом старении клеточной линии фибробластов человека [Цветкова Т.Г. и соавт., 1997].
Изменения транскриптивной активности в онтогенезе, обнаруженные при исследовании ЯО хромосом в эмбриональном периодах, положены в основу гипотезы о наследственной программе экспрессии р-генов в индивидуальном развитии. Предполагают, что реализация этой программы может осуществляться за счет резервных «молчащих» р-генов, которые могут активироваться в связи с необходимостью интенсивного белкового синтеза. Число резервных «молчащих» р-генов варьирует в различных акроцентрических хромосомах и их активация происходит неравномерно. Показано, что хромосома 21 по сравнению с другими ядрышкообразующими хромосомами содержит наибольшее число «молчащих» копий р-генов, а 15 хромосома проявляет как пониженную активность, так и является наиболее низкокопийной [Пендина А.А. и др., 2000; Полянская Г.Г., 2000].
В соответствии с общепризнанной номенклатурой, с составе ядрышек выделяют следующие основные структурные компоненты: фибриллярные центры; рибонуклеопротеидный (РНП) фибриллярный компонент; РНП-гранулярный компонент; ядрышковые вакуоли; около- и внутриядрышковый хроматин [Челидзе П.В. и др., 1988; Goessens G., 1984; Jordan E.G., 1984].
Фибриллярные центры (ФЦ) – это структуры соответствующие яд-рышкообразующим районам хромосом [Челидзе П.В., 1985; Chouinard L.A., 1971]. Они построены из рыхло лежащих фибрилл низкой электронной плотности. Толщина фибрилл составляет 6-8 нм, также встречаются фибриллы меньшего (3-5 нм) или большего (15-20 нм) диаметра [Мантейфель В.М. и др., 1986]. Согласно экспериментальным данным, в толще ФЦ расположена неактивная в отношении синтеза рибосомная ДНК (рДНК), тогда как процессы транскрипции проходят на поверхности ФЦ [Mirre C. et al., 1978, 1981]. С помощью окраски аммином осмия удалось выявить, что рДНК ФЦ находятся в растянутом состоянии и образуют фибриллы диаметром 3-5 нм [Derenzini M. et al., 1984].
Фибриллярный компонент представляют собой фибриллы диаметром 4-8 нм. Фибриллы окружают ФЦ в виде сплошного слоя или образуют на поверхности ФЦ небольшие скопления – «шапочки». Фибриллярный компонент может образовывать впячивания внутрь ФЦ, что придает ему чашеобразную форму [Гозак П. и др., 1983; Thity M. et al., 1985]. По своему составу этот компонент представлен новообразованной 45S пре-рРНК [Fakan S. et al., 1971].
Исследование митотического режима
При исследовании числа ядрышек показано, что в клетках рака почки у мужчин число ядрышек составило 1,7±0,1, число ядрышек варьировало от 1 до 5 при модальном значении равном 1. У женщин, число ядрышек было равно 1,7±0,1 (p 0,05), число ядрышек колебалось от 1 до 4,5, при модальном значении 1,5 (табл. 6). Таким образом, различий в количестве ядрышек в клетках опухоли у мужчин и женщин не обнаружено.
При рассмотрении морфофункциональных типов ядрышек показано, что у мужчин количество КЯд в клетках опухолей составило 23,9%±3,4, а у женщин 21,2%±3,05 (p = 0,6).
Число ПЯд у мужчин составило 41,1%±3,7, у женщин количество ПЯд незначительно возрастало до 46,6%±3,7 (p = 0,3). У мужчин ПЯд содержали 2,8±0,1 ФЦ, у женщин – 2,9±0,1 ФЦ (p = 0,6). Число ФЦ в ПЯд у мужчин колебалось от 0 до 4, при модальном значении 2,7, у женщин число ФЦ в ПЯд варьировало от 0 до 4, при модальном значении 3. При процентном разграничении ПЯд по числу ФЦ у мужчин с 2 ФЦ было 39% ядрышек, с 3 ФЦ было 35% ядрышек и с 4 ФЦ – 26% ядрышек. У женщин с 2 ФЦ было 33,8% ядрышек, с 3 ФЦ было 38,6% ядрышек и с 4 ФЦ – 27,6% ядрышек (рис. 14) Таким образом, у женщин незначительно преобладали ПЯд с 3 и 2 ФЦ.
Распределение НЯд по числу ФЦ в зависимости от пола больных. По оси абсцисс – количество ФЦ; по оси ординат – процентное содержание ядрышек.
Для оценки морфофункциональной активности клеток по данным серебрения ядрышковых организаторов в зависимости от пола опухолевые клетки были нами распределены на группы в зависимости от числа ФЦ. (рис. 16). У мужчин по сравнению с женщинами возрастает число клеток с большим числом ФЦ на 1 ядро (от 31 до 50) и несколько уменьшается количество клеток с числом ФЦ (от 1 до 10). Гистограмма, характеризующая распределение клеток по числу ФЦ у мужчин в целом отличается сдвигом влево. 60,0%
При исследовании числа ядрышек показано, что в опухолевых клетках больных в возрасте от 31 до 40 лет их число составило 1,3±0,07, от 41 до 50 лет - 1,7±0,07, от 51 до 60 лет - 1,6±0,04, от 61 до 70 лет - 1,7±0,04 и от 71 до 80 лет - 1,8±0,08 (табл. 7).
Таким образом, наименьшее число ядрышек отмечали в возрастной группе от 31 до 40 лет, а наибольшее в возрасте от 71 до 80 лет. При рассмотрении морфофункциональных типов ядрышек показано, что в возрасте от 31 до 40 лет число КЯд составило 34,2%±10,6, от 41 до 50 лет - 19,8%±4,8, от 51 до 60 лет - 25,0%±3,7, от 61 до 70 лет - 18,7%±4,1 и от 71 до 80 лет - 23,1%±9,1 (табл. 8).
Таким образом, при возрасте от 31 до 40 лет наблюдали наибольшее количество КЯд в опухолевых клетках, но данные были недостоверны.
Число ПЯд в возрастной группе от 31 - 40 лет составило 60,2%±8,0, от 41 до 50 лет - 44,8%±5,7, от 51 до 60 лет - 43,2%±4,2, от 61 до 70 - 41,3%±4,4 и от 71 до 80 лет - 45,3%±9,3. Число ФЦ в ПЯд в возрастной группе от 31 -40 лет составило 2,9±0,09, от 41 до 50 лет - 2,9±0,05, от 51 до 60 лет -2,9±0,04, от 61 до 70 - 2,95±0,05 и от 71 до 80 лет - 2,9±0,08 (табл. 9). Примечание (число НЯд): p составляет – p1-2 = 0,05; p1-3 = 0,06; p1-4 = 0,02; p1-5 = 0,2. Для более детального анализа морфофункциональной активности НЯд, они были распределены на группы в зависимости от числа ФЦ. При возрасте от 31 до 40 лет число НЯд содержащих 5-9 ФЦ составило 100%, НЯд с другим числом ФЦ выявлено не было. В возрастной группе от 41 до 50 лет число НЯд содержащих 5-9 ФЦ составило 65,4%, 10-14 ФЦ – 25,7%, 15-19 ФЦ – 1,7%, 20-24 ФЦ – 3,9%, 25-29 ФЦ – 0%, 30-34 ФЦ – 1,7%, 35-39 ФЦ – 1,1%, 40-44 ФЦ – 0,5%, 45 и более ФЦ – 0%. В возрастной группе от 51 до 60 лет число НЯд содержащих 5-9 ФЦ составило 52,2%, 10-14 ФЦ – 31,7%, 15-19 ФЦ – 8,4%, 20-24 ФЦ – 6%, 25-29 ФЦ – 0%, 30-34 ФЦ – 0,6%, 35-39 ФЦ – 0%, 40-44 ФЦ – 0,3%, 45 и более ФЦ – 0,8%. В возрастной группе от 61 до 70 лет число НЯд содержащих 5-9 ФЦ составило 47,1%, 10-14 ФЦ – 30%, 15-19 ФЦ – 9,1%, 20-24 ФЦ – 8,8%, 25-29 ФЦ – 3,5%, 30-34 ФЦ – 1,2%, 35-39 ФЦ – 0,3%, 40-44 ФЦ – 0%, 45 и более ФЦ – 0%.
В возрастной группе от 51 до 60 лет число НЯд содержащих 5-9 ФЦ составило 52,2%, 10-14 ФЦ – 31,7%, 15-19 ФЦ – 8,4%, 20-24 ФЦ – 6%, 25-29 ФЦ – 0%, 30-34 ФЦ – 0,6%, 35-39 ФЦ – 0%, 40-44 ФЦ – 0,3%, 45 и более ФЦ – 0,8%. В группе пациентов от 71 до 80 лет число НЯд содержащих 5-9 ФЦ составило 41,9%, 10-14 ФЦ – 37,1%, 15-19 ФЦ – 3,4%, 20-24 ФЦ – 4,8%, 25-29 ФЦ – 3,2%, 30-34 ФЦ – 4,8%, 35-39 ФЦ – 4,8%, 40-44 ФЦ – 0%, 45 и более ФЦ – 0% (табл. 12).
Таким образом, при анализе морфофункциональной активности НЯд в опухолевых клетках в зависимости от возраста обнаружено, что в возрастной группе от 31 до 40 лет число НЯд и количество ФЦ в НЯд были наименьшим, а в группе от 61 до 70 лет наибольшим. Также выявлено, что у больных в возрасте от 31 до 40 лет преобладали НЯд содержащие от 5 до 9 ФЦ, в тоже время, у больных более старших возрастных групп происходило значительное расширение спектра НЯд по числу ФЦ и уменьшение числа НЯд содержащих от 5 до 9 ФЦ.
При исследовании числа ФЦ на 1 ядро показано, что в опухолевых клетках больных в возрасте от 31 до 40 лет число ядрышек составило 1,3±0,07, от 41 до 50 лет - 1,7±0,07, от 51 до 60 лет - 1,6±0,04, от 61 до 70 лет -1,7±0,04 и от 71 до 80 лет - 1,8±0,08 (табл. 13).
Морфофункциональная характеристика нуклеолярного аппарата опухолевых клеток в зависимости от возраста больных
Нами был проведен анализ морфофункциональной активности ядрыш-ковых организаторов при ПКР в зависимости от bcl-2-статуса опухоли. Опухоль считали bcl-2-негативной, если экспрессия ингибитора апоптоза bcl-2 составила от 0 до 2 баллов и опухоли считали bcl-2- позитивными, если экспрессия ингибитора апоптоза составила от 3 до 4 баллов.
В нашем исследовании положительная иммуногистохимическая реакция на bcl-2 в опухоли наблюдалась в виде, преимущественно, гомогенного или мелкозернистого окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток. Интенсивность окрашивания была от бледно-желтой до темно-коричневой. Среди всех исследованных больных разброс значений экспрессии bcl-2 составил от 0 до 4 баллов, в среднем уровень экспрессии составил 1,8±0,1 баллов. Bcl-2-негативных опухолей было 60,2%, bcl-2-позитивных опухолей – 39,1%.
При определении морфофункциональной активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток в зависимости от bcl-2-статуса показано, что в bcl-2-позитивных карциномах (рис. 97) параметры активности составили: среднее число ядрышек на 1 ядро – 1,7±0,1; среднее число ФЦ на 1 ядро – 6,9±1,0; содержание КЯд – 26,7±4,7; ПЯд – 46,4±4,8; НЯд – 27,8±6,7; среднее число ФЦ на 1 ПЯд составило 2,6±0,2; среднее число ФЦ на 1 НЯд – 5,9±0,9; средняя площадь ЯОЗ – 2,0±0,2 мкм2 и средняя ИОП белка нуклеофозмина/B23 – 978,6±112,9 у.е. (табл. 42).
В bcl-2-негативных опухолях (рис. 98) параметры ядрышковой активности достоверно возрастали и составили: среднее число ядрышек на 1 ядро – 1,7±0,1; среднее число ФЦ на 1 ядро – 10,8±1,2; содержание НЯд – 43,1±5,1; среднее число ФЦ на 1 ПЯд составило 3,0±0,05; среднее число ФЦ на 1 НЯд – 8,0±0,8; средняя площадь ЯОЗ – 2,8±0,2 мкм2 и средняя ИОП белка нуклеофозмина/B23 – 1980,1±267,6 у.е. В то же время в bcl-2-негативных опухолях наблюдалась четкая тенденция к уменьшению числа КЯд и ПЯд до 17,6±3,1 и 39,2±3,8 соответственно, но данные были не достоверны (см. табл. 42).
Рис. 98. Bcl-2-негативная опухоль: а – иммуногистохимическая реакция на bcl-2, ув. 400; б – иммуногистохимическая реакция на нуклеофозмин/B23. Ув. 1000.
Таким образом, в bcl-2-негативных опухолях по сравнению с bcl-2-позитивными опухолями отмечали увеличение активности нуклеолярного аппарата опухолевых клеток, которое проявлялось в возрастании следующих параметров: количества ФЦ на 1 ядро, числа ФЦ на 1 ПЯд, площади ЯОЗ и ИОП белка нуклеофозмина/B23. Возрастание данных параметров, по нашему мнению, прежде всего, обусловлено высокой экспрессией белка нуклеофоз-мина/B23, который блокирует апоптоз посредством активации гена BAX. При этом происходили существенные перестройки нуклеологенеза, проявляющиеся в перераспределении морфофункциональных типов ядрышек – увеличение содержания активных нуклеолонемных форм и уменьшение числа неактивных.
Резюмируя все вышеизложенное, можно говорить, что морфофункцио-нальная активность нуклеолярного аппарата при ПКР была взаимосвязана с такими биомолекулярными параметрами, как ангиогенез, плоидность, про-лиферативная активность и процессы апоптоза в опухоли. В опухолях с низкой ПМЦР по сравнению с опухолями с высокой ПМЦР отмечали увеличение активности нуклеолярного аппарата, которое проявлялось в возрастании числа ядрышек на 1 ядро, количества ФЦ на 1 ядро, содержания НЯд, числа ФЦ на 1 НЯд, площади ЯОЗ и ИОП белка нуклеофозмина/B23. Возрастание морфофункциональной активности нуклеолярного аппарата связано с высокой экспрессией белка нуклеофозмина/B23, которая вызвана явлениями гипоксии к опухоли. Поэтому в карциномах с низкой ПМЦР выявляли существенные перестройки нуклеологенеза, проявляющиеся в перераспределении морфофункциональных типов ядрышек в сторону увеличения содержания активных НЯд и уменьшения числа малоактивных КЯд и ПЯд.
В анеуплоидных опухолях при ПКР по сравнению с диплоидными отмечали увеличение активности нуклеолярного аппарата опухолевых клеток, которое проявлялось в возрастании числа ядрышек на 1 ядро, количества ФЦ на 1 ядро, содержания НЯд, числа ФЦ на 1 НЯд, площади ЯОЗ и ИОП белка нуклеофозмина/B23. Возрастание этих параметров обусловлено как возрастанием числа ядрышкообразующих хромосом в анеуплоидных опухолях, так и увеличением активности отдельных ядрышковых организаторов. Результатом чего было перераспределение морфофункциональных типов ядрышек в сторону увеличения содержания нуклеолонемных форм и уменьшения числа КЯд и ПЯд.
В опухолях с высокой пролиферативной активностью (по данным исследования митозов и Ki-67), по сравнению с опухолями с низкой пролифе-ративной активностью, отмечали увеличение активности нуклеолярного аппарата клеток, которое проявлялось в возрастании количества ФЦ на 1 ядро, содержания НЯд, числа ФЦ на 1 НЯд, площади ЯОЗ и ИОП белка нук-леофозмина/B23. Возрастание данных параметров обусловлено высокой экспрессией белка нуклеофозмина/B23, который регулирует пролиферативные процессы в клетке. В опухолях с высокой пролиферативной активностью выявляли существенные перестройки нуклеологенеза, проявляющиеся в перераспределении морфофункциональных типов ядрышек в сторону увеличения содержания активных форм и уменьшения числа малоактивных кольцевидных и переходных типов ядрышек. Полученные закономерности указывают на то, что морфофункциональная активность нуклеолярного аппарата может служить индикатором пролиферативной активности при ПКР.
В p53-позитивных опухолях при ПКР по сравнению с p53-негативными опухолями отмечали увеличение активности нуклеолярного аппарата опухолевых клеток, которое проявлялось в возрастании следующих параметров: числа ядрышек на 1 ядро, количества ФЦ на 1 ядро, содержания НЯд, числа ФЦ на 1 НЯд, площади ЯОЗ и ИОП белка нуклеофозмина/B23. Возрастание данных параметров, по нашему мнению, прежде всего, обусловлено высокой экспрессией белка нуклеофозмина/B23, который, как известно, стимулирует активность белка-супрессора p53. При этом происходили существенные перестройки нуклеологенеза, проявляющиеся в перераспределении морфо-функциональных типов ядрышек в сторону увеличения содержания активных нуклеолонемных форм и уменьшения числа неактивных КЯд и ПЯд.
В bcl-2-негативных опухолях по сравнению с bcl-2-позитивными опухолями отмечали увеличение активности нуклеолярного аппарата опухолевых клеток, которое проявлялось в возрастании следующих параметров: количества ФЦ на 1 ядро, числа ФЦ на 1 ПЯд, площади ЯОЗ и ИОП белка нук-леофозмина/B23. Возрастание данных параметров, по нашему мнению, прежде всего, обусловлено высокой экспрессией белка нуклеофозмина/B23, который блокирует апоптоз посредством активации гена BAX. При этом происходят существенные перестройки нуклеологенеза, проявляющиеся в перераспределении морфофункциональных типов ядрышек в сторону увеличения содержания активных нуклеолонемных форм и уменьшения числа неактивных КЯд и ПЯд, тенденция к чему четко прослеживается.
Морфометрическая характеристика нуклеолярного аппарата клеток ПКР в зависимости от размера опухолевого узла
Когда число ядрышек было 1,5, тогда к 1800 дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,89 (89%), а когда число ядрышек на 1 ядро было 1,5, то тогда кумулятивная доля выживших составила 0,68 (68%). При сравнении кривых выживаемости этих групп больных с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия данных были достоверны (log-rank, p=0,05).
Когда число НЯд было 46%, тогда к 1800 дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,94 (94%), а когда число НЯд на 1 ядро было 46%, то тогда кумулятивная доля выживших составила 0,50 (59%). При сравнении кривых выживаемости этих групп больных с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия данных были достоверны (log-rank, p=0,00001).
Когда число ФЦ в НЯд было 6, тогда к 1800 дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,98 (98%), а когда число ФЦ в НЯд было 6, то тогда кумулятивная доля выживших составила 0,58 (58%). При сравнении кривых выживаемости этих групп больных с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия данных были достоверны (log-rank, p=0,00008).
Когда число ПЯд было 65%, тогда к 1800 дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,92 (92%), а когда число ПЯд на 1 ядро было 65%, то тогда кумулятивная доля выживших составила 0,70 (70%). При сравнении кривых выживаемости этих групп больных с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия данных были достоверны (log-rank, p=0,04).
Когда число КЯд было 18%, тогда к 1800 дню после операции кумулятивная доля выживших составила 1,0 (100%), а когда число КЯд на 1 ядро было 18%, то тогда кумулятивная доля выживших составила 0,60 (60%). При сравнении кривых выживаемости этих групп больных с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия данных были достоверны (log-rank, p=0,00006). операции кумулятивная доля выживших составила 0,98 (98%), а когда Ag-NORs на 1 ядро было 5 AgNORs, то тогда кумулятивная доля выживших составила 0,42 (42%). При сравнении кривых выживаемости этих групп больных с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия данных достоверны (log-rank, p=0,000001).
Когда площадь ЯОЗ было 2 мкм2, тогда к 1800 дню после операции кумулятивная доля выживших составила 0,98 (98%), а когда площадь ЯОЗ на 1 ядро было 2,0 мкм2, то тогда кумулятивная доля выживших составила 0,53 (53%). При сравнении кривых выживаемости этих групп больных с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия данных были достоверны (log-rank, p=0,000001).
Когда ИОП белка нуклеофозмина/B23 была 1000 у.е., тогда к 1800 дню после операции кумулятивная доля выживших составила 1,0 (100%), а когда ИОП белка нуклеофозмина/B23 на 1 ядро была 1000 у.е., то тогда кумулятивная доля выживших составила 0,62 (62%). При сравнении кривых выживаемости этих групп больных с использованием логарифмического рангового критерия показано, что различия данных были достоверны (log-rank, p = 0,000001).
Таким образом, при исследовании 5-летней выживаемости больных по Каплан-Мейер статистическую значимость показали следующие клинико-морфологические, молекулярно-биологические и нуклеолярные параметры (в порядке убывания значимости признака): наличие регионарных и отдаленных метастазов (p=0,000001); степень анаплазии по Fuhrman (p=0,000001 – 0,03); клиническая стадия по TNM (p=0,000001); митотическая активность (p = 0,000001); гистотип опухоли (p=0,000001 – 0,02); инвазия в жировую клетчатку (p=0,000001); количество AgNORs в клетках опухоли (p=0,000001); площадь ЯОЗ в клетках опухоли (p=0,000001); ИОП белка нуклеофозмина/B23 в клетках опухоли (p=0,000001); содержание НЯд в опухолевых клетках (p = 0,00001); экспрессия p53 в опухолевых клетках (p=0,00001); экспрессия Ki-67 в опухолевых клетках (p=0,00004); содержание КЯд в клетках опухоли (p = 0,00006); число ФЦ в НЯд (p=0,00008); размер опухоли (p=0,0001); плоид-ность клеток опухоли (p=0,0002); ПМЦР в опухоли (p=0,02); экспрессия маркера Bcl-2 в опухолевых клетках (p=0,02) и количество ядрышек в клетках опухоли (p=0,05). Параметр наличия склероза в опухоли в нашем исследовании не явился значимым прогностическим фактором (p=0,8).
Следующим этапом нашего исследования прогноза ПКР было выполнение однофакторного регрессивного прогностического анализа по Коксу. В однофакторный регрессивный анализ по Коксу нами были включены 20 кли-нико-морфологических и молекулярно-биологических параметров, среди которых 8 параметров характеризовали морфофункциональную характеристику нуклеолярного аппарата опухолевых клеток. Однофакторный регрессионный анализ влияния на выживаемость избранных параметров показал, что большинство исследованных нами факторов (19 факторов) были прогностически значимыми: количество AgNORs в клетках опухоли (2=71,2; t=6,1; p=0,000001); площадь ЯОЗ в клетках опухоли (2=63,2; t=5,5; p=0,000001); содержание НЯд в клетках опухоли (2=58,9; t=6,5; p=0,000001); ИОП белка нуклеофозмина/B23 (2=58,3; t=4,3; p=0,000001); наличие метастазов (2=45,2; t=7,0; p=0,000001); содержание КЯд в клетках опухоли (2=42,4; t=5,2; p=0,000001); степень анаплазии по Furhman (2=40,9; t=6,1; p=0,00001); мито-тическая активность (2=40,4; t=5,9; p=0,000001); cодержание ФЦ в НЯд (2=37,3; t=5,3; p=0,000001); экспрессия p53 в опухоли (2=27,9; t=5,1; p=0,000001); стадия по TNM (2=27,4; t=5,15; p=0,000001); плоидность клеток опухоли (2=26,1; t=4,2; p=0,000001); инвазия в жировую клетчатку (2=23,6; t=4,9; p=0,00001); ПМЦР (2 =22,4; t=-3,8; p=0,000001); экспрессия Bcl-2 в опухоли ( =21,5; t=-4,0; p=0,000001); размер опухоли (2=20,5; t=4,2; p=0,00001); экспрессия Ki-67 в опухоли (2=20,3; t=4,3; p=0,000001); содержание ПЯд в клетках опухоли (2=13,6; t=3,1; p=0,0002); количество ядрышек в клетках опухоли (2=8,5; t=2,8; p=0,003). В то же время гистологический вариант ПКР оказался незначимым фактором (2=0,05; t=0,2; p=0,8).
Следующим этапом исследования было проведение прогностического многофакторного регрессивного анализа исследуемых параметров. Проведенного прогностического многофакторного регрессионного анализа по Коксу выживаемости больных позволило выявить значимые маркеры (2=143,9; df=21; p=0,00001). Такими маркерами стали (в порядке убывания параметра t):
На основании многофакторного регрессионного анализа по Коксу множества клинико-анатомических и молекулярно-биологических параметров показано, что нуклеолярные параметры опухолевых клеток явились независимыми факторами прогноза при ПКР.
Таким образом, исследование нуклеолярных параметров опухолевых клеток позволяет более полно понять некоторые закономерности прогрессии неоплазии при ПКР. Для неизменной ткани почки характерны малоактивные формы ядрышек, а для ПКР высокоактивные варианты нуклеол. В наиболее злокачественных карциномах возникает широкую гетерогенность клеток по активности нуклеолярного аппарата, что является существенным моментом в селекции клонов клеток с высоким метастатическим потенциалом. Поэтому, возрастание числа фибриллярных центров, количества нуклеолонемных ядрышек и содержание белка нуклеофозмина/B23 и в тоже время уменьшение содержания кольцевидных и переходных вариантов ядрышек, является следствием возрастания злокачественности и агрессивности клеток рака почки.
Морфологические и функциональные изменения ядрышек, наблюдаемые при ПКР взаимосвязаны с процессами неоангиогенеза, с генетическими нарушениями, отражением которых является несбалансированность содержания ядерной ДНК, пролиферативными и апоптотическими процессами, происходящими в новообразовании и рядом важных клинико-морфологических параметров опухоли. Нуклеолярные параметры опухолевых клеток явились независимыми факторами прогноза при ПКР и поэтому они могут использоваться при построении моделей при прогнозировании послеоперационного течения заболевания у больных раком почки.