Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Морфологические признаки меланомы кожи и использование молекулярных маркеров для характеристики опухолевого роста и метастазирования 11
1.1. Патоморфологическая характеристика меланомы кожи 11
1.2. Современные подходы к диагностике и прогнозу развития меланомы 13
1.3. Роль ангиогенеза в развитии опухоли 17
1.4. Молекулярные маркеры ангиогенеза 20
1.5. Роль лимфатической системы и лимфангиогенеза в развитии опухолевого процесса и метастазирования 21
1.6. Молекулярные маркеры лимфангиогенеза 26
1.7. Пролиферативная активность опухолевых клеток и метастазирование 28
1.8. Резюме 30
Собственные исследования
Глава 2. Материал и методы исследования 32
2.1. Общая характеристика клинического материала 32
2.2. Морфологические методы исследования, морфометрия и статистическая обработка полученных данных 34
Глава 3. Пролиферативная активность клеточных элементов меланомы кожи 37
Глава 4. Особенности формирования кровеносных сосудов при меланоме кожи 43
4.1. Ангиогенез в опухолевом узле 43
4.2. Ангиогенез на периферии опухоли 48
Глава 5. Лимфангиогенез при меланоме кожи 52
5.1. Образование лимфатических сосудов в опухолевом узле
5.2. Формирование лимфатических сосудов на периферии опухоли 57
Заключение 62
Выводы 66
Практические рекомендации 67
Список использованных источников
- Роль ангиогенеза в развитии опухоли
- Молекулярные маркеры лимфангиогенеза
- Морфологические методы исследования, морфометрия и статистическая обработка полученных данных
- Формирование лимфатических сосудов на периферии опухоли
Введение к работе
Актуальность темы. Меланома кожи (МК) является одним из наиболее агрессивно протекающих злокачественных новообразований человека, обладающих высоким метастатическим потенциалом, частота которого в мире постоянно растет (Зенит-Журавлева Е.Г. и др., 2014; Maurichi A. et al., 2014). Ранняя диагностика и своевременное удаление первичной меланомы являются основными составляющими успешной терапии данного заболевания. В последнее время появляются работы, свидетельствующие о необходимости внедрения новых маркеров, имеющих диагностическую и прогностическую значимость при меланоме кожи, в дополнение к традиционным клиническим и гистологическим параметрам (Xu X. et al., 2012).
Ангиогенез и лимфангиогенез относятся к важнейшим процессам, определяющим злокачественный рост и метастазирование. Исследования последних лет подтверждают значимость связанных с ними параметров, в том числе показателей плотности перитумо-ральных лимфатических и кровеносных сосудов, в прогнозировании метастазов меланомы и выживаемости пациентов (Heindl L.M. et al., 2011; Pasquali S. et al., 2013; Pastushenko I. et al., 2015). В то же время, по данным других авторов, интенсивность формирования кровеносных сосудов в опухоли не является предиктором дальнейшего развития МК, в отличие от показателей лимфангиогенеза (Xu X. et al., 2012; Pastushenko I. et al., 2014). Очевидно, что эти предварительные выводы должны получить более широкое подтверждение, прежде чем будет целесообразно рекомендовать применение иммуногистохимии лимфатических маркеров в рутинной клинической оценке первичных кожных меланом (Pasquali S. et al., 2013).
Данные литературы свидетельствуют о сложной взаимосвязи факторов роста и рецепторов, участвующих в процессах ангио- и лимфангиогенеза. Показано, что сосудистый эндотелиальный фактор роста-C и -D (VEGF-C и VEGF-D), а также рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-3), играющие ключевую роль в новообразовании лимфатических сосудов, могут принимать участие и в ангиогенезе. С другой стороны, проангио-генные факторы (например, VEGF-A и angiopoetin-2) играют важную роль в лимфангио-генезе (Gomes F.G. et al., 2013). Следовательно, для более полной характеристики и прогноза опухолевого роста необходимо использовать маркеры как ангио-, так и лимфангио-генеза.
Пролиферативная активность клеток опухоли является ключевым фактором опухолевой прогрессии, а ее оценка при помощи иммуногистохимического определения ядерного белка Кi-67 широко используется в качестве прогностического критерия при злокачественных новообразованиях различных локализаций. При этом прогностическая ценность экспрессии Кi-67 при МК до сих пор является предметом дискуссии (Алексинский В.С. и др., 2010; Kamyab-Hesari K. et al., 2014).
Таким образом, оценка пролиферативной активности, выраженности кровеносной и лимфатической васкуляризации опухолевого узла и тканей на его периферии является актуальным направлением научных исследований и может способствовать более точной диагностике первичной МК, а также прогнозу ее дальнейшего течения.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время при определении стадий и прогнозе метастазирования МК в основном основываются на определении толщины, глубины инвазии, изъязвления опухоли, наличия микросателлитов и метастазов в регионарные лимфатические узлы, выраженности пролиферативной активности опухолевых клеток, инвазии их в сосуды. При этом в одну клиническую группу часто попадают пациенты с разным прогнозом и особенностями течения опухолевого процесса. С точки
зрения лечебной тактики это ведет к применению агрессивного подхода к хирургическому и адъювантному лечению, что подвергает большее число пациентов побочным эффектам лечения. С другой стороны, упускается момент предупреждения возможного метастазиро-вания. Современную диагностику нельзя считать удовлетворительной. Заболеваемость меланомой кожи увеличивается приблизительно в 2 раза каждые 10 – 15 лет, в основном за счет лиц молодого возраста, а годичная и 5-летняя выживаемость у пациентов с отдаленными метастазами (МК IV стадии) составляет 45 и 12%, соответственно.
В связи с развитием биотехнологий стало возможным использование опухолевых биомаркеров в дифференциальной диагностике меланомы и определении риска ее мета-стазирования. В настоящее время изучено достаточное их количество, но фундаментальные исследования до сих пор имеют ограниченное практическое применение. К тому же ни один маркер по отдельности не является достаточно значимым в качестве диагностического критерия.
Цель исследования – установить патоморфологические особенности пролифера-тивной активности клеток, формирования кровеносных и лимфатических сосудов при невусе, диспластическом невусе, а также в центре и на периферии первичной опухоли при различных стадиях меланомы кожи.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительное иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности клеток в очаге поражения кожи при невусе, диспластическом невусе и в первичной опухоли при различных стадиях меланомы кожи с использованием маркера пролиферации Ki-67.
-
Провести сравнительный анализ объемной плотности кровеносных сосудов в очаге поражения кожи при невусе, диспластическом невусе и в первичной опухоли при различных стадиях меланомы кожи с использованием маркера эндотелиоцитов кровеносных сосудов CD34.
-
Провести сравнительный анализ объемной плотности лимфатических сосудов в очаге поражения кожи при невусе, диспластическом невусе и в первичной опухоли при различных стадиях меланомы кожи с использованием маркера эндотелиоцитов лимфатических сосудов Podoplanin.
-
Провести сравнительный анализ объемной плотности кровеносных и лимфатических сосудов в центре и на периферии первичной опухоли при различных стадиях мела-номы кожи.
Научная новизна. Впервые по данным сравнительного анализа экспрессии молекулярных маркеров пролиферации, ангиогенеза и лимфангиогенеза при невусе, диспласти-ческом невусе и МК выявлены достоверные различия численной плотности пролифери-рующих клеток, объемной плотности кровеносных и лимфатических сосудов, позволяющие с большей вероятностью проводить дифференциальную диагностику этих патологических процессов.
По данным сравнительного изучения экспрессии Ki-67 впервые продемонстрировано, что выявление в невусе признаков дисплазии ассоциировано с увеличением пролифе-ративной активности клеток новообразования в среднем в 13,5 раз. При различных стадиях меланомы кожи численная плотность Ki-67+-клеток значительно превосходит соответствующие показатели при невусе (в 40 – 107 раз) и диспластическом невусе (в 3 – 8 раз). Показано, что присутствие более 50 Ki-67+-клеток на 105 мкм2 площади среза диагностируемой структуры с чувствительностью 96,7% и специфичностью 76,9% указывает на вероятность развития МК.
Впервые получены данные, что вне зависимости от наличия признаков дисплазии
интенсивность формирования кровеносных и лимфатических сосудов в невусе находится на низком уровне.
Впервые показано, что МК относится к злокачественным новообразованиям с высокой активностью неоангиогенеза – объемная плотность CD34+-сосудов в центре и на периферии опухоли в 3 – 11 раз превосходит соответствующие значения при невусе и дис-пластическом невусе. При этом увеличение данного показателя более 7% сопряжено с высокой вероятностью развития МК (чувствительность 94,7%, специфичность 85,7%).
Впервые установлено, что при развитии МК значительно усиливается процесс формирования лимфатических сосудов – объемная плотность Podoplanin+-структур в центре и на периферии опухоли в 3 – 26 раз превосходит соответствующие значения при невусе и диспластическом невусе. Повышение данного показателя более 3% указывает на высокую вероятность развития МК (чувствительность 94,7%, специфичность 85,7%).
Впервые выявлена значительная вариабельность количественных показателей пролиферации, ангиогенеза и лимфангиогенеза при различных стадиях МК, что указывает на биологическую гетерогенность опухолей, отнесенных к одной клинической группе (стадии).
Впервые, по данным комплексного патоморфологического анализа, установлено, что процессы гемангио- и лимфангиогенеза более выражены на периферии опухолевого узла; при этом показатели объемной плотности кровеносных сосудов превышают соответствующие значения для лимфатических сосудов.
Теоретическое и практическое значение работы. Получены новые знания об особенностях неоваскуляризации и пролиферативной активности клеточных элементов МК. Полученные данные обосновывают целесообразность иммуногистохимического исследования численности Ki-67+-клеток, а также процессов формирования кровеносных и лимфатических сосудов для дифференциальной диагностики невуса, диспластического невуса и МК. При этом следует учитывать высокую вариабельность гемангио- и лимфангиогене-за на различных стадиях МК и тот факт, что при низкой интенсивности формирования сосудов лимфатического русла в опухолевом узле полученные данные не всегда достоверно отличаются от невуса и диспластического невуса.
В связи с тем, что в невусах с наличием и отсутствием явлений дисплазии интенсивность формирования кровеносных и лимфатических сосудов очень низкая и достоверно не различается, показатели ангиогенеза не следует применять для дифференциальной диагностики между указанными структурами.
Методология и методы исследования. Методология исследования основана на применении принципов и методов морфологического анализа патологических процессов, использования теоретических разработок о характере и механизмах развития неопластических процессов. В работе использованы современные методы морфологического анализа (световая микроскопия, иммуногистохимия, морфометрия) и обработки полученных данных. Объект исследования – невус, диспластический невус, опухолевый узел и периферия опухолевого роста при различных стадиях МК. Предмет исследования – особенности пролиферативной активности клеток МК, формирования кровеносных и лимфатических сосудов в опухоли.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Выявление в невусе признаков дисплазии ассоциировано с увеличением пролифе-ративной активности клеток новообразования в среднем в 13,5 раз; показатели объемной плотности кровеносных и лимфатических сосудов при невусе и диспластическом невусе достоверно не различаются.
-
Средние значения численной плотности Ki-67+-клеток, объемной плотности кро-
веносных и лимфатических сосудов в центре и на периферии опухолевого узла при различных стадиях МК достоверно превышают соответствующие показатели невуса и дис-пластического невуса.
-
Увеличение пролиферативного индекса, а также объемной плотности кровеносных и лимфатических сосудов выше пороговых значений (более 50 Ki-67+-клеток на 105 мкм2, более 7% CD34+-сосудов и 3% Podoplanin+-сосудов) указывает на высокую вероятность развития МК.
-
Значительная вариабельность количественных показателей пролиферации, ангио-генеза и лимфангиогенеза при различных стадиях меланомы кожи отражает биологическую гетерогенность опухолей, отнесенных к одной клинической группе (стадии).
-
Процессы гемангио- и лимфангиогенеза при МК более выражены на периферии опухолевого узла.
Степень достоверности результатов диссертации. Все использованные методические (морфологический, иммуногистохимический и морфометрический анализ) приемы и способы статистической обработки соответствуют поставленным цели и задачам и позволяют получить достоверные результаты. Диссертация выполнена на достаточном клиническом и патоморфологическом материале (124 пациента с диагнозом «Меланома кожи I, II или III стадии») с использованием сертифицированного оборудования. Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.
Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации доложены на VIII региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2013); Всероссийской конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2014); совместном заседании сотрудников кафедры онкологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, врачебного персонала отделений ГБУЗ НСО «Новосибирский областной клинический онкологический диспансер» и научных сотрудников лаборатории ультраструктурных исследований ФГБНУ Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии (Новосибирск, 2016).
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в онкологическом отделении № 1 ГБУЗ НСО «Новосибирский областной клинический онкологический диспансер», используются в научной работе лаборатории ультраструктурных исследований НИИКЭЛ – филиале ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр институт цитологии и генетики СО РАН».
Публикации. По теме диссертации опубликованы 9 печатных работ, из них 3 – в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований:
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материала и методов исследования, 3 глав собственных результатов с их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и 7 приложений. Работа изложена на 131 странице компьютерного текста, содержит 26 таблиц, иллюстрирована 26 многокомпонентными комбинированными рисунками. Библиография включает 229 источников (40 отечественных и 189 иностранных). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
Роль ангиогенеза в развитии опухоли
После метастазирования в ЛУ опухолевые клетки формируют вторичную опухоль, клетки которой могут сразу попадать в кровеносные капилляры ЛУ или продолжают движение с током лимфы и поступают в общий кровоток позже, но также с формированием отдаленных метастазов. Показано, что метастазирование в ЛУ коррелирует с повышенным риском формирования отдаленных метастазов и неблагоприятным клиническим прогнозом (Цыпла-ков Д.Э., Петров С.В., 1997а, 1997б; Tsyplakov D.E. et al., 1997).
Новообразованные лимфатические капилляры имеют больший просвет и имеют большую плотность. При исследовании ткани меланомы было показано, что плотность лимфатических капилляров имеет большую прогностическую значимость, чем толщина опухоли. Опухоль-ассоциированные лимфатические эндотелиоциты могут синтезировать хемокины, способствующие проникновению клеток злокачественной опухоли в лимфатические капилляры. Также была выявлена прямая зависимость между гиперэкспрессией VEGF-C, опухоль-ассоциированным лимфангиогенезом внутри опухоли и по её периферии и наличием метастазов в ЛУ. В эксперименте было показано, что при блокировании внутриопухолевых лимфатических сосудов частота метастазирования в ЛУ не изменилась: сделано предположение, что периту-моральных лимфатических сосудов достаточно для процесса лимфогенного метастазирования (Nielsen P.S. et al., 2013; Weide B. et al., 2013; Kamyab-Hesari K. et al., 2014; Bartlett E.K., 2014).
После трансформации опухолевые клетки продолжают пролифериро-вать, получая питательные вещества и кислород путем диффузии. Для дальнейшего развития опухоли запускается процесс лимфангиогенеза. Многие из молекул, которые вызывают рост эндотелиоцитов кровеносных сосудов, также стимулируют пролиферацию клеток эндотелия лимфатических сосудов. В большинстве случаев возникает гиперплазия перитуморальных лимфатических сосудов, реже внутриопухолевых. Возникает расширение просвета капилляра, что связано с пролиферацией его эндотелия, повышением интерстициального давления, секрецией биологически активных молекул. Это способствует проникновению опухолевых клеток в просвет лимфатического сосуда, которые с током лимфы попадают в регионарный ЛУ (Chien M.H. et al., 2013; Dbiski P. et al., 2013; Shibata M.A. et al., 2013; Ni X. et al., 2013; Liu H. et al., 2014; Lee E. et al., 2014а, 2014в). VEGF-C является основным трофическим сигналом для поддержания лимфангиогенеза. Развитие лимфатической сосудов происходит, в первую очередь, через взаимодействие релиза VEGF-C с рецептором VEGFR-3, который является основным VEGF-рецептором эндотелиоцитов лимфатических капилляров. При изучении лимфатических капилляров in vivo было показано, что добавление рекомбинантного VEGF-C в водную среду Данио-рерио (Zebrafish) увеличивало количество лимфатических капилляров, в то время как снижение концентрации VEGF-C приводило к ингибиции роста капилляров. При отсутствии VEGF-C развития лимфатических сосудов в эмбриогенезе не происходит. VEGF-D может только частично компенсировать недостаточность VEGF-C во время развития, процесс лимфангиогенеза не угнетается полностью при гиперэкспрессии VEGF-D. В эксперименте было продемонстрировано, что отсутствие VEGF-D не имеет значения для лимфангио-генеза (Achen M.G., Stacker S.A., 2012; Hoffman S.J. et al., 2012; Paquet-Fifield S. et al., 2013; Astin J.W. et al., 2014; Koltowska K. et al., 2015).
В процессе изучения лимфангиогенеза при злокачественных опухолях была выявлена прямая зависимость между гиперэкспрессией VEGF-C, наличием опухолевой инвазии в лимфатические сосуды, наличием метастазиро-вания в ЛУ и, как следствие, неблагоприятным прогнозом. Экспрессия VEGF-C возрастает с увеличением стадии опухоли (Karaman S., Detmar M. 2014; Zheng W. et al., 2014; Franc M. et al., 2015; Zhang L. et al., 2015; Hisamatsu T. et al., 2015).
В процессе метастазирования злокачественного новообразования важным является ремоделирование лимфатических сосудов внутри ЛУ (Muders M.H., Baretton G.B., 2015). Показано, что строение лимфатических сосудов в ЛУ при метастазировании в него злокачественной опухоли отличается от неметастатического (Garrafa E., 2015).
Воздействие на процесс лимфангиогенеза может являться одним из этапов комплексной терапии злокачественных новообразований, в том числе МК. Супрессия ангиогенеза и лимфангиогенеза приводит к замедлению опухолевого роста и скорости метастазирования.
Таким образом, ингибиторы ангиогенеза или факторов, стимулирую 26 щих пролиферацию эндотелиоцитов и рост сосудов, в том числе и с анти-VEGF активностью, могут являться перспективными противоопухолевыми препаратами, сдерживающими не только рост опухоли, но и подавляющими лимфогенное метастазирование (Takebayashi Y. et al., 1996; Tanigawa N. et al., 1997; Gallo O. et al., 1998; Tjalma W. et al., 1998; Ni X. et al., 2013; Shibata M.A. et al., 2013; Chien M.H. et al., 2013; Chen J. et al., 2013, 2014; Li Y. et al., 2014; Abbasi M.M. et al., 2014; Majumder M. et al., 2014; Watari K. et al., 2014; Yang Z.S. et al., 2014; Masola V. et al., 2014; Yu T.T. et al., 2014; Keyhani E. et al., 2014; Tanaka T. et al., 2014; Irani S. et al., 2014; Farnsworth R.H. et al., 2014; Wang N. et al., 2014; Lee E. et al., 2014б; Berta J. et al., 2014; Walia A. 2015).
Молекулярные маркеры лимфангиогенеза
Патоморфологическое исследование с применением иммуногистохи-мии проведено непосредственно на опухолевом узле МК и на его границе с окружающими тканями (на периферии опухоли).
Удаленные во время операции ткани фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина не менее 24 ч, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Из обработанного таким способом материала готовили гистологические срезы толщиной 5 – 7 мкм (Пирс Э., 1964; Елисеев В.Г. и др., 1967; Лилли P., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996).
Характеристика МК включала в себя следующие критерии: определение максимальной толщины опухоли в мм по Бреслоу; определение уровня инвазии по Кларку; наличие или отсутствие изъязвления первичной опухоли; определение митотического индекса (количество митозов на 1 мм2) при толщине опухоли до 1 мм включительно; наличие транзиторных или сателлит-ных метастазов; оценка краев резекции на наличие опухолевых клеток. При проведении гистологического исследования метастазов меланомы в регионарные ЛУ изучали: количество удаленных ЛУ; количество пораженных ЛУ; прорастание капсулы ЛУ (Клинические рекомендации по диагностике и лечению больных меланомой кожи, 2014).
Все этапы иммуногистохимической реакции (депарафинирование, демаскировка антигена, инкубация с первичными антителами и т.д.) проводили в автоматическом режиме на аппарате BENCHMARK/XT (Ventana). Использовали моноклональные антитела к маркеру эндотелиоцитов лимфатических сосудов – Podoplanin (Monosan), маркеру эндотелиоцитов кровеносных сосудов – CD34 (NOVOCASTRA) и маркеру пролиферации – Ki-67 (NOVOCASTRA).
Для оценки специфичности взаимодействия антител с тканевыми антигенами использовали отрицательный и положительный контроль. Для отрицательного контроля при проведении иммуногистохимической реакции исключали первичные антитела. В качестве положительного контроля использовали препараты фрагментов органов, в которых ранее было доказано содержание исследованных антигенов – параллельно с препаратами меланомы кожи окрашивали препараты биопсийного материала гиперкератоза, рака нижней губы и жировой ткани.
Полученные препараты МК изучали в световом микроскопе «Leiсa DME» и фотографировали с помощью компьютерной программы «Аvigion» при увеличении 100, 400 и 1000 раз. Микрофотографии морфометрировали с использованием компьютерной программы Image J в соответствии с рекомендациями, изложенными в многочисленных работах, посвященных теоретическому обоснованию и конкретным примерам применения этих методов (Глаголев А.А., 1941; Шахламов В.А., 1967; Катинас Г.С., Полонский Ю.З., 1970; Плохинский Н.А., 1970; Вейбель Э.P., 1970; Автандилов Г.Г., 1973, 1980, 1990, 2002; Христолюбова Н.Б., Шилов А.Г., 1974; Weibel E.R., 1979; Автандилов Г.Г. и др., 1981, 1984; Непомнящих Л.М. и др., 1986; Горчаков В.Н., 1997). Обозначение и размерность стереологических параметров, использованных в работе, приведены согласно рекомендациям Международного стереологического общества (Weibel E.R., 1979).
Оценивали объемную плотность Podoplanin+-объектов (лимфатических сосудов), CD34+-структур (кровеносных сосудов) и численную плотность Ki-67+ (пролиферирующих) клеточных элементов в центре опухоли и на ее границе со здоровыми тканями с использованием закрытой тестовой системы из 315 (15х21) точек, площадь системы – 22125 мкм2 (125 мкм х 177 мкм), данные пересчитывали из расчета на 105 мкм2 площади среза. При этом с каждого среза в среднем получали и морфометрировали по 20 микрофотографий. Численную плотность пролиферирующих клеток определяли на микрофото 36 графиях, полученных при увеличении в 400 раз (Head J.R., Seeling L.L., 1984).
На основании численных значений полученных вариационных рядов строили гистограммы, вычисляли эмпирическую функцию распределения выборки. При анализе полученных данных отмечено, что у пациентов с МК различных стадий гистограммы распределения в значительном числе случаев имели мультимодальный характер, в связи с чем для более полной характеристики неоднородности распределения при анализе показателей на различных стадиях условно выделяли подгруппы с низкой, средней и высокой численной плотностью Ki-67+ клеток ( 45, 46 – 100, 100 клеток на 105 мкм2), объемной плотностью CD34+ структур ( 6%, 6 – 15%, 15%) и объемной плотностью Podoplanin+ лимфатических сосудов ( 7%, 7 – 13% и 13%, соответственно).
Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel 7.0 (Microsoft, USA). Определяли медиану, среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего арифметического (m). Достоверность различия сравниваемых средних величин определяли на основании t-критерия Стьюдента в случаях, когда распределение исследуемых признаков было близким к нормальному, а также с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Достоверным считали различия между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности 95% и выше (p 0,05).
С целью разработки дифференциально-диагностических критериев на основе полученных показателей пролиферативной активности, а также интенсивности ангио- и лимфангиогенеза при помощи метода ROC-анализа строили ROC-кривые, определяли величину порога отсечения (cut-off value) для решаемой диагностической задачи и соответствующие этой величине чувствительность и специфичность (Орлова Е.А., 2012).
Морфологические методы исследования, морфометрия и статистическая обработка полученных данных
На периферии опухоли при МК IА стадии объемная плотность CD34+ сосудов составляла 30,81±0,72% от площади среза и была, соответственно, в 10,8 и 9,7 раза больше, чем при спокойном и диспластическом невусе. На фоне IВ стадии (8,92±0,12%) данный показатель в 3,1 и 2,8 раза превышал показатели неактивного и диспластического невусов, но был в 3,5 раза меньше, чем при МК IА стадии (Приложение Г, табл. 13).
При II-III стадиях МК объем CD34+ структур на периферии опухолевого узла возрастал по сравнению со спокойным/диспластическим невусами и МК IВ стадии – в 10,9/9,8 и 3,5 раза (IIА), 10,5/9,4 и 3,3 раза (IIB), 10,1/9,1 и 3,2 раза (IIC), 11,4/10,2 и 3,6 раза (при III стадии) соответственно (Приложение Г, табл. 13).
Таким образом, на периферии опухолевого узла при всех стадиях МК объемная плотность CD34+ сосудов, как и в центре опухоли, была более чем в 2 раза выше, чем при неактивном и диспластическом невусе. По-видимому, для уточнения диагноза МК на основании выявления ангиогене-за не важно, из центра опухолевого узла или из его периферических отделов взята биопсия.
Обращает на себя внимание, что на всех стадиях МК, кроме IВ, выраженность ангиогенеза была практически одинаковой, составляя 29 – 32% от площади среза (Приложение Г, табл. 13). По-видимому, на периферии опухоли, в отличие от центра, активность формирования кровеносных сосудов зависит не только от размеров самой опухоли, интенсивности деления и гипоксии опухолевых клеток (Weidner N. et al., 1991; Gasparini G. et al., 1995; Maeda K. et al., 1996; Kaku T. et al., 1997; Farnsworth R.H. et al., 2014), но и, в большей степени, от состояния стромы и окружающих тканей (Lamszus K. et al., 1997; Leek R.D. et al., 1998), которые вместе с питающими кровеносными сосудами подвергаются сдавлению. В литературе есть данные, что продукция некоторых факторов опухолевого ангиогенеза (например, фактор роста гепа-тоцитов, hepatocyte growth factor) модулируется окружением опухоли (Lamszus K. et al., 1997). Не исключено, что именно это и является основной причиной практически постоянного процента CD34+-сосудов. В таком случае, скорее всего, отличие стадии IВ от других стадий является случайным. При сравнении выраженности ангиогенеза на периферии опухоли и в самом опухолевом узле обнаружено, что на IA, IIA, IIB, IIC и III стадиях объемная плотность CD34+-сосудов на краю опухоли в 2,1; 2,9; 2,1; 3 и 3,3 раза превышала соответствующие показатели в ее центре (Приложение Г, табл. 9, 13). Полученные данные свидетельствуют, что практически на всех стадиях МК, кроме IB, ангиогенез на периферии опухолевого узла более выражен, чем в его центре, и различие достигает 2 – 3 раз. Скорее всего, отличие стадии IB от общей картины еще раз указывает на случайность данной находки.
При разделении пациентов с МК на группы по выраженности ангиогене-за на периферии опухолевого узла обнаружили, что на IIВ, IIС и III стадиях МК с высокой активностью формирования кровеносных сосудов объемная плотность CD34+ сосудов на срезе ткани была, соответственно, в 2,2; 4,4 и 3,7 раза больше по сравнению с теми же стадиями МК, но со средней выраженностью ангиогенеза (Приложение Г, табл. 14) (Приложение Д, рис. 11 - 6).
Как и в центре опухоли, в тех случаях, когда было достаточное количество пациентов в группах сравнения, наблюдали статистически достоверные различия при разделении больных в зависимости от активности ангиогенеза. Здесь также недостаточно пациентов для статистического анализа в группах с низкой активностью ангиогенеза (Приложение Г, табл. 14). То есть, при МК в подавляющем большинстве случаев процессы формирования сосудов значительно выражены как в центре опухолевого узла, так и на его периферии.
При изучении активности формирования кровеносных сосудов на периферии опухолевого узла при МК со средней выраженностью ангиогенеза обнаружено, что на IВ стадии объемная плотность CD34+ сосудов была, соответственно, в 3,1 и 2,8 раза больше, чем при спокойном и диспластическом невусах. На фоне IIВ стадии объем CD34+ структур был в 6,5/5,8 и 2,1 раза выше соответствующих показателей при неактивном/диспластическом неву-сах и МК IВ стадии (Приложение Г, табл. 15).
При МК IIС стадии объемная плотность CD34+ сосудов на периферии опухолевого узла в 3,7 и 3,3 раза превышал показатели спокойного и диспла-стического невусов, но была на 74,6% меньше по сравнению с IIВ стадией. При III стадии данный показатель был выше, чем при спокойном и диспластическом невусах, МК IВ и IIC стадии (в 4,9 и 4,4 раза, на 55,5% и 30,8%, соответственно), но на 33,5% ниже относительно IIВ стадии (Приложение Г, табл. 15). Таким образом, при МК со средней активностью ангиогенеза объем сосудов на периферии опухоли (так же как и в центре опухолевого узла) в 2 и более раза превышал показатели спокойного и диспластического невусов. При этом объемная плотность CD34+-объектов на периферии опухоли при разных стадиях МК меняется разнонаправлено, даже без учета особенностей, обнаруженных на IB стадии.
При сравнении численной плотности CD34+-сосудов на периферии опухоли и в самом опухолевом узле на фоне средней выраженности ангиоге-неза обнаружено, что на IВ, IIB и III стадиях объемная плотность CD34+ сосудов на границе опухоли на 31,6%, в 2,1 раза и на 42,1% превышала соответствующие показатели в центре новообразования. Таким образом, при МК со средней активностью формирования сосудов процессы ангиогенеза на периферии опухоли также более выражены, чем в самом опухолевом узле (Приложение Г, табл. 11, 15).
При МК с высокой активностью образования сосудов объемная плотность CD34+ сосудов на периферии опухоли существенно превышала соответствующие показатели при спокойном и диспластическом невусах: на IА стадии – в 10,8 и 9,7 раза, на IIА стадии – в 10,9 и 9,8 раза, соответственно (Приложение Г, табл. 16).
При IIВ стадии объемная плотность CD34+ объектов была больше, чем при спокойном и диспластическом невусах (в 14,3 и 12,8 раза), МК IА и IIА стадии (на 32,2% и 31,4%). При IIС и III стадиях МК данный показатель достоверно возрастал по сравнению со спокойным/диспластическим невусами, МК IА, IIА и IIВ стадии – в 16,5/14,8 раза, на 52,5%, 51,6% и 15,4% (при IIC стадии) и в 17,9/16,1 раза, на 65,1%, 64,2% и 25% (при III стадии), соответственно (Приложение Г, табл. 16).
Таким образом, при высокой активности ангиогенеза объемная плотность CD34+-сосудов на периферии опухолевого узла практически 10-кратно (в 9,7 раза) превосходит значение соответствующего показателя при неактивном и диспластическом невусе.
Формирование лимфатических сосудов на периферии опухоли
Непосредственно в опухолевом узле при МК IА стадии объемная плотность Podoplanin+ сосудов составляла 4,46±0,02% от площади среза и была, соответственно, в 5,3 и 4,4 раза больше, чем при спокойном и диспластиче-ском невусе. На фоне IВ стадии ее значение (3,32±0,08%) было в 4 и 3,3 раза выше показателей неактивного и диспластического невусов, но достоверно ниже (на 34,3%), чем при МК IА стадии (Приложение Е, табл. 17).
Объемная плотность Podoplanin+ сосудов в опухолевом узле МК IIА стадии (6,09±0,36%) возрастала в 7,3 и 6 раз, на 36,5% и 83,4%, соответственно, по сравнению со спокойным и диспластическим невусами, МК IА и IВ стадии. При МК IIВ стадии данный параметр (7,41±0,23%) превышал соответствующие показатели при спокойном и диспластическом невусах (в 8,9 и 7,3 раза), МК IА (на 66,1%), IВ (в 2,2 раза) и IIА стадии (на 21,7%) (Приложение Е, табл. 17). На фоне IIС стадии МК объемная плотность Podoplanin+ сосудов (11,4±0,4%) была выше, чем при неактивном и диспластическом невусах (в 13,6 и 11,3 раза), МК IА и IВ, IIА и IIВ стадии (в 2,6 и 3,4 раза, на 87,2% и 53,8%, соответственно). При МК III стадии значение данного параметра (7,03±0,33%) превышало показатели спокойного и диспластического невусов (в 8,4 и 7 раз), МК IА и IВ стадии (на 57,6% и в 2,1 раза, соответственно), но оставалось на 62,2% ниже, чем при МК IIС стадии (Приложение Е, табл. 17).
Таким образом, как и при формировании кровеносных сосудов, выраженность лимфангиогенеза при различных стадиях МК отличалась разнона-правлено, однако даже на стадиях МК с минимальной активностью объемная плотность Podoplanin+ сосудов в 3 и более раза превышала показатели неактивного или диспластического невуса. Применение ROC-анализа позволило сделать заключение, что превышение порога в 3% Podoplanin+ объектов на срезе указывает на высокую вероятность развития меланомы кожи (чувствительность 94,7%, специфичность 85,7%).
С целью более полной характеристики гетерогенности выборки по показателю лимфангиогенеза (объемной плотности Podoplanin+-сосудов) в опухолевом узле пациенты с МК различных стадий были разделены на подгруппы с низкими ( 7%), средними (7 – 13%) и высокими значениями данного показателя ( 13%).
Было обнаружено, что при IIА и IIВ стадиях МК со средней активностью лимфангиогенеза объемная плотность Podoplanin+ сосудов на срезе опухоли была, соответственно, в 2,8 и 3,2 раза больше по сравнению с теми же стадиями МК и с низкой выраженностью лимфангиогенеза. При IIА и IIС стадиях патологического процесса с высокой активностью образования сосудов содержание Podoplanin+ структур было в 3,4 и 2 раза выше по сравнению с аналогичными стадиями МК и средней активностью процесса лимфангио-генеза (Приложение Е, табл. 18) (Приложение Ж, рис. 17 – 21).
Таким образом, в тех случаях, когда было достаточное количество пациентов в сравниваемых подгруппах, отмечены достоверные различия между ними по данному показателю. Следует, однако, отметить недостаточное количество пациентов большинства сравниваемых стадий для статистического анализа в группах с низкой и высокой активностью лимфангиогенеза (Приложение Е, табл. 18). При исследовании образования лимфатических сосудов у пациентов при МК с низкой активностью лимфангиогенеза выявлено, что на IВ стадии объемная плотность Podoplanin+ структур в 3,3 и 2,7 раза превышала соответствующие показатели при спокойном и диспластическом невусе (Приложение Е, табл. 19).
На фоне IIA стадии МК объем Podoplanin+-объектов был в 2 раза ниже, чем при МК IВ стадии, при этом величина изучаемого показателя достоверно не отличалась от параметров неактивного и диспластического невусов. В то же время, в опухолевом узле МК IIВ стадии процент Podoplanin+-сосудов новь достоверно превышал параметры спокойного и диспластического неву-сов (в 2,7 и 2,2 раза, соответственно) (Приложение Е, табл. 19). Можно сделать вывод, что при низкой степени формирования сосудов лимфатического русла в опухолевом узле при МК полученные данные не всегда достоверно отличались от неактивного или диспластического невусов.
У больных при МК со средней выраженностью лимфангиогенеза объемная плотность Podoplanin+ объектов превышала соответствующие показатели при спокойном и диспластическом невусах: при IА стадии – в 5,3 и 4,4 раза, при IВ стадии – в 4,6 и 3,9 раза, при IIА стадии – в 4,5 и 3,8 раза (Приложение Е, табл. 20).
При IIВ, IIС и III стадиях МК объемная плотность Podoplanin+ структур превышала показатели спокойного/диспластического невусов, МК IА, IВ и IIA стадии: при IIВ стадии – в 8,9/7,3 раза, на 66,1%, 90,5% и 95,5%; при IIС стадии – в 9,1/7,5 раза, на 70,2%, 95,1% и в 2 раза; при III стадии – в 8,4/7 раз, на 57,6%, 80,7% и 85,5%, соответственно (Приложение Е, табл. 20).
Здесь можно отметить некоторую закономерность. Во-первых, при МК со средней активностью лимфангиогенеза объем лимфатических сосудов не менее, чем в 4 раза превышал показатели спокойного и диспластического невуса. Во-вторых, начиная со IIВ стадии, наблюдался резкий рост объемной плотности Podoplanin+-объектов. То есть произошло разделение полученных данных на 3 группы: 1) спокойный и диспластический невус с величиной значения данного показателя до 1,55%; 2) МК IА, IВ и IIA стадии с объемом Podoplanin+-структур 3-5%; 3) МК IIB, IIC и III стадии с содержанием Podoplanin+-сосудов более 7%.
У больных при МК с высокой активностью формирования лимфатических сосудов объемная плотность Podoplanin+-сосудов значительно превышала соответствующие показатели при спокойном и диспластическом неву-сах – в 15,5 и 12,9 раза при IIА стадии, в 18,1 и 15,1 раза при IIС стадии (Приложение Е, табл. 21). Следует, однако, отметить, что количество пациентов с высокой активностью лимфангиогенеза в большинстве сравниваемых групп при МК оказалось слишком малым для проведения статистического анализа с заданным параметром достоверности.
В целом, можно заключить, что при развитии МК усиливается формирование не только кровеносных, но и лимфатических сосудов. Согласно литературным данным, многие проангиогенные молекулы одновременно стимулируют пролиферацию эндотелиальных клеток кровеносного и лимфатического русла (Chien M.H. et al., 2013; Dbiski P. et al., 2013; Shibata M.A. et al., 2013; Ni X. et al., 2013; Liu H. et al., 2014; Lee E. et al., 2014а).
Опухоль-ассоциированные лимфатические эндотелиоциты могут синтезировать хемокины, способствующие проникновению клеток злокачественной опухоли в лимфатические капилляры – выявлена прямая зависимость между гиперэкспрессией VEGF-C, наличием опухолевой инвазии в лимфатические сосуды, метастазированием в ЛУ и, как следствие, неблагоприятным прогнозом. Показано, что экспрессия VEGF-C возрастает с увеличением стадии опухоли (Karaman S., Detmar M. 2014; Zheng W. et al., 2014; Franc M. et al., 2015; Zhang L. et al., 2015; Hisamatsu T. et al., 2015).
В нашем исследовании не было найдено прямой зависимости между активностью лимфангиогенеза, стадией опухоли и метастазированием МК: как и при формировании кровеносных сосудов, выраженность лимфангиоге-неза при различных стадиях МК отличалась разнонаправленно – на III стадии (с наличием метастазов в регионарные ЛУ) объемная плотность Podoplanin+ объектов оказалась достоверно меньше, чем при стадии IIC.
Таким образом, несмотря на то что на основании выраженности лим-фангиогенеза можно с достаточно высокой вероятностью судить о малигни-зации невуса (с учетом пороговых значений, полученных при ROC-анализе), данный показатель не является достоверным диагностическим и прогностическим критерием в отношении стадии процесса, а также наличия или отсутствия ближайших и отдаленных метастазов.