Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления об имплантацион ной восприимчивости и роли молекулярных взаимодействий в эндометрии (обзор литературы) 13
1.1 Вспомогательные репродуктивные технологии: современное состояние проблемы 13
1.2 Нейроиммуноэндокринология эндометрия. Эндометриальные маркеры «окна имплантации» 15
1.3 Эндометрий при бесплодии. Основные механизмы нарушения
имплантации 28
1.4 Прогнозирование исходов циклов экстракорпорального оплодотворения 37
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 39
2.1 Характеристика исследуемого материала 39
2.2 Гистологическое исследование эндометрия 43
2.3 Морфометрическое исследование 46
2.4 Статистическая обработка результатов исследования 47
ГЛАВА 3. Иммуногистохимические критерии импланта ционной восприимчивости эндометрия (результаты собственного исследования) 49
3.1 Оценка зависимости экспрессии исследуемых маркеров от уровней экспрессии ER и PR 49
3.2 Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в эндометрии 49
3.3 Экспрессия лейкемия-ингибирующего фактора (LIF) в эндометрии 60
3.4 Экспрессия интегрина V3 в эндометрии 62
3.5 Экспрессия сосудистого-эндотелиального фактора роста типа А (VEGF-A) в эндометрии 3.6 Экспрессия трансформирующего фактора роста бета 1 (TGF-1) в эндометрии 68
3.7 Прогнозирование исходов экстракорпорального оплодотворения по данным экспрессии иммуногистохимических маркеров 72
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 85
Выводы 98
Практические рекомендации 100
Список литературы 101
- Нейроиммуноэндокринология эндометрия. Эндометриальные маркеры «окна имплантации»
- Гистологическое исследование эндометрия
- Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в эндометрии
- Прогнозирование исходов экстракорпорального оплодотворения по данным экспрессии иммуногистохимических маркеров
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Бесплодный брак остается одной из важных медицинских, социальных,
экономических и общегосударственных проблем. По данным Всемирной
организации здравоохранения, его частота составляет 10-15 % и не имеет
тенденции к снижению (Кулаков В.И. с соавт., 2011). Недостаточная
эффективность методов восстановления естественной фертильности человека
стимулировала развитие новых вспомогательных репродуктивных
технологий (ВРТ), в частности экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО),
результативность которого колеблется от 28,5 % до 32,5 % (De Mouzon J. et
al., 2006; Kupka M.S. et al., 2014). Поэтому в последние годы большое
внимание уделяется разработке методов, направленных на повышение
результативности циклов ЭКО (Seo W.S et al., 2011). Оптимизация
эффективности ЭКО напрямую связана с решением ключевой проблемы
репродуктологии - идентификации периода рецептивности
(восприимчивости эндометрия) для определения функциональной готовности эндометрия к имплантации бластоцисты (Bourgain С., Devroey P., 2003; Boomsma C.M. et al., 2009; Simon A., Laufer N., 2012).
Рецептивность эндометрия – это комплекс структурно-
функциональных характеристик эндометрия с четкими временными
константами, которые определяют способность эндометрия обеспечить
имплантацию эмбриона. Реализация рецептивности эндометрия
осуществляется посредством генетических и молекулярных превращений,
которые приводят к экспрессии большого количества биологически
активных молекул, таких как цитокины, факторы роста, молекулы адгезии и
др. «Золотым стандартом» оценки рецептивности эндометрия долгое время
считалась биопсия, которую использовали в первую очередь для определения
дефекта лютеиновой фазы (Devroey, P. et al., 2004). Возможность легкого
получения эндометриальной ткани породила большие надежды, что биопсия
будет обеспечивать необходимую информацию о рецептивности эндометрия.
Однако ряд исследователей признают, что тонкие признаки изменений
состояния ткани до сих пор ускользают от гистологической визуализации
(Coutifaris C. et.al., 2004; Myers E.R. et.al., 2014). Определение
иммуногистохимическим методом молекулярных посредников,
обеспечивающих имплантационную способность эндометрия, дает
возможность для оценки функциональной готовности эндометрия к имплантации.
Основываясь на выявлении нарушений рецептивности возможно назначение комплексной терапии у женщин с внешне сохраненными параметрами овуляторного цикла, направленной на усиление ангиогенеза и трофических процессов в эндометрии и модификация ведения протокола ЭКО.
Таким образом, отсутствие органической патологии эндометрия не
исключает его функциональную неполноценность. Нарушение
восприимчивости эндометрия может проявляться дисбалансом
молекулярных факторов, формированием подпороговых функциональных субклеточных нарушений.
Степень разработанности темы исследования
Развитие методов иммуногистохимии открыло новые перспективы в разработке клинически значимых биомаркеров восприимчивости эндометрия. Несмотря на большое количество исследований, посвященных определению биологически активных веществ, участвующих в процессе имплантации и возможности их использования для клинического применения (Lessey B.A., 2011; Garrido-Gomez et.al., 2013; Tracey A.E., 2013), существуют разноречивые данные, возможно обусловленные различными микрочипами, применяемыми для анализа, и критериями отбора и условиями проведения исследований. Поэтому единой точки зрения по молекулярным паттернам восприимчивости пока не достигнуто. Так же отсутствует единое мнение о ценности определения экспрессии тех или иных сигнальных молекул в качестве оптимальных маркеров, определяющих фертильность. Поиски в данном направлении активно продолжаются. Следует отметить, что применение какого-либо одного маркера для идентификации восприимчивости эндометрия недостаточно как из-за сложности механизма бесплодия, так и индивидуальности гомеостаза организма у каждой пациентки. Именно поэтому необходимо сформировать панель маркеров, адекватную для обеспечения персонализированного подхода в лечении бесплодия в клиниках ЭКО (Boomsma C.M. et.al., 2009; Kuivasaari-Pirinen et.al., 2012; Xiyuan, Dong, et.al., 2013).
Цель исследования
Верификация наиболее специфичных и значимых
иммуногистохимических маркеров рецептивности эндометрия для
разработки алгоритма персонифицированного подхода к лечению бесплодия
и повышению эффективности ЭКО.
Задачи исследования
1. Верифицировать экспрессию рецепторов к эстрогенам (ER) и
прогестерону (PR) и оценить ее диагностическое значение в ткани
эндометрия в период «окна имплантации» у пациенток c различными
факторами бесплодия.
2. Верифицировать экспрессию и оценить диагностическое значение в
ткани эндометрия молекул первичного прикрепления: лейкемия
ингибирующего фактора роста (LIF) и интегрина V3 в период «окна
имплантации» у пациенток c различными факторами бесплодия.
-
Верифицировать экспрессию и оценить диагностическое значение в ткани эндометрия факторов роста - сосудистого эндотелиального фактора роста, тип А (VEGF-А) и трансформирующего фактора роста, тип 1(TGF1) в период «окна имплантации» у пациенток c различными факторами бесплодия.
-
На основании результатов комплексного иммуногистохимического исследования эндометрия разработать математическую модель и алгоритм для прогнозирования эффективности лечения бесплодия методам ЭКО.
Научная новизна исследования
Установлены основные различия экспрессии таких
иммуногистохимических маркеров как рецепторы к ER и PR, LIF, интегрину
V3, VEGF-A, TGF1, в ткани эндометрия в период «окна имплантации»
при положительном и отрицательном исходах циклов ЭКО. Они состоят в
том, что в подгруппах с положительным исходом цикла ЭКО уровни
экспрессии изучаемых сигнальных молекул достоверно превышают таковые
в подгруппе с отрицательным исходом лечения. Исключение составили
экспрессии маркеров ER и VEGF-А в стромальном компоненте, которые
имели повышенные показатели экспрессии, ассоциированные с
отрицательным исходом программы лечения методом ЭКО.
Впервые выявлено, что для женщин, получающих лечение в связи с мужским фактором бесплодия, наиболее информативны для прогноза иммуногистохимические показатели экспрессии молекул первичного прикрепления: LIF, интегрина V3 и фактора роста TGF1.
Впервые выявлено, что для женщин с трубно-перитонеальным
фактором бесплодия для прогноза информативны также
иммуногистохимические показатели экспрессии молекул первичного прикрепления: LIF, интегрин V3 и отношение экспрессии PR/ER.
Впервые выявлено, что для женщин с наружным генитальным
эндометриозом прогностически значимыми являются
иммуногистохимические показатели экспрессии факторов роста: TGF1, VEGF-А, а так же молекул первичного прикрепления: LIF и интегрина V3.
Разработан алгоритм прогнозирования исхода ЭКО, основанный на комплексной оценке функционального состояния эндометрия посредством иммуногистохимической верификации ключевых сигнальных молекул, участвующих в обеспечении рецептивности эндометрия.
Теоретическая и практическая значимость
В результате проведенного исследования эндометрия в период «окна имплантации» пациенток c различными факторами бесплодия показана диагностическая значимость комплексного изучения гистологических и иммуногистохимических показателей в оценке нарушений имплантационной восприимчивости эндометрия.
Установленные значения экспрессии ключевых сигнальных молекул, участвующих в обеспечении рецептивности эндометрия в период «окна имплантации», позволили создать алгоритм прогнозирования исходов лечения методом ЭКО.
Применение алгоритма позволяет наглядно и с высокой
достоверностью прогнозировать исход программы ЭКО и, тем самым, обосновано планировать индивидуальную тактику ведения пациентки в предстоящем цикле лечения методом ЭКО.
Разработаны научно обоснованные рекомендации по диагностике
нарушений рецептивности эндометрия с использованием
иммуногистохимической верификации сигнальных молекул для женщин, получающих лечение в связи с мужским фактором бесплодия, трубно-перитонеальным бесплодием и наружным генитальным эндометриозом I-II степени.
Методология и методы исследования
Методология диссертационного исследования основывалась на применении основных методов научного познания (обобщение, индукция-дедукция, анализ-синтез и др.), принципов и правил процессного и системного подходов и моделирования. В качестве методологической и теоретической основы исследования использовались труды отечественных и зарубежных ученых по патологической анатомии и физиологии эндометрия, акушерству, гинекологии и репродуктологии, молекулярной биологии.
Разработка и реализация программы исследования базировалась на
традиционных, адаптированных к специфике поставленных задач
современных методах исследования (гистологическом, гистохимическом, иммуногистохимическом и математическом моделировании), а также последующей обработке полученных результатов современными методами математической статистики.
На проведение диссертационной работы получено разрешение Этического комитета при ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О.Отта» (протокол № 61 от 17 декабря 2013г).
Положения, выносимые на защиту
1. Для женщин, получающих лечение в связи с мужским фактором
бесплодия, диагностически значимыми являются следующие показатели
экспрессии исследуемых маркеров: относительная площадь LIF в железистом
компоненте; оптическая плотность интегрина V3 в железистом
компоненте; относительная площадь экспрессии TGF1в строме эндометрия.
2. Для женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия
диагностически значимыми являются показатели экспрессии исследуемых
маркеров: отношение экспрессии PR/ER; относительная площадь экспрессии
LIF в железистом компоненте; оптическая плотность экспрессии интегрина V3 в стромальном компоненте эндометрия.
-
Для женщин с наружным генитальным эндометриозом I-II степени диагностически значимыми являются показатели экспрессии исследуемых маркеров: экспрессия PR в железистом компоненте; оптическая плотность экспрессии LIF в железистом компоненте и относительная площадь экспрессии TGF1 в строме эндометрия.
-
Применение алгоритма, учитывающего в качестве прогностических критериев показатели относительной площади экспрессии LIF в железистом компоненте эндометрия и относительной площади TGF1 в стромальном компоненте, позволяет с высокой надежностью прогнозировать исход лечения методом ЭКО.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Результаты диссертационного исследования достоверны и обоснованы,
что обеспечивается репрезентативностью и достаточным объемом
изученного материала (n=240) и использованием адекватных решению
поставленных задач методов: анамнестического, гистологического,
иммуногистохимического и статистического.
Материалы диссертационного исследования доложены на IV
ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов
«Репродуктивная медицина: взгляд молодых-2013» (Санкт-Петербург, 2013);
VIII междисциплинарной конференции «Здоровая женщина–здоровый
новорожденный» (Санкт-Петербург, 2013); I международном форуме
«Молекулярная медицина – новая модель здравоохранения XXI века:
технологии, экономика, образование» (Санкт-Петербург, 2013); V ежегодной
научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная
медицина: взгляд молодых–2014» (Санкт-Петербург, 2014);
Межрегиональном обществе патологоанатомов (Санкт-Петербург, 2015);
Международной медико-биологической конференции молодых
исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина-человек и
его здоровье» (Санкт-Петербург, 2015); VI ежегодной научной конференции
молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд
молодых–2015» (Санкт-Петербург, 2015); Национальном конгрессе
«Дискуссионные вопросы современного акушерства» (Санкт-Петербург 2015); V- международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ, из
них - глава в «Руководство по нейроиммуноэндокринологии»,
рекомендованном департаментом образовательных медицинских учреждений и кадровой политики министерства здравоохранения Российской Федерации
в качестве учебника для студентов медицинских вузов и 4 статьи в
рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК.
Личный вклад автора в проведенное исследование
Автором проанализированы и обобщены данные литературы по
изучаемой проблеме. Самостоятельно обработаны карты обследования
пациенток. Проведены гистологические, иммуногистохимические и
морфометрические исследования с описанием и обобщением основных
результатов. Статистическая обработка и обобщение полученных
результатов выполнены лично автором.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 21 таблицу и 11 рисунков. Список литературы включает 198 источников, в том числе 45 отечественных и 153 иностранных авторов.
Нейроиммуноэндокринология эндометрия. Эндометриальные маркеры «окна имплантации»
При беременности, наступившей естественным путем, важную роль играет микроокружение эмбриона на разных стадиях его развития. Фолликулярная, трубная жидкости участвуют в заключительных этапах созревания ооцитов, и их секреция модулируется присутствием эмбриона [182].
В программах ВРТ при контролируемой гиперстимуляции яичников, осуществляется забор, оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов in vitro. Это исключает воздействие микроокружения и часто приводит к неполноценности преимплантационного эмбриона. Однако, в настоящее время разработаны методики позволяющие получать эмбрионы высокого качества путем культивирования в средах, содержащих факторы роста и цитокины, а так же при ко-культивировании с клетками эндометрия матери [5]. Из этого следует, что имплантация зависит от трех факторов: качества эмбриона, функциональной зрелости-рецептивности эндометрия и состояния репродуктивной функции женского организма в целом.
При переносе в полость матки эмбрионов после проведения предимплантационной диагностики и высокого морфологичекого качества , а также исключении явных причин препятствующих благополучному завершению программы, отрицательный исход рассматривают как нарушение на этапах имплантации эмбриона [102]. В 1945 году P. Vigano и соавторы провозгласили следующий постулат, ставший впоследствии афоризмом: «Бластоциста может виртуально имплантироваться в любом месте человеческого организма, кроме нерецептивного эндометрия». Удивительно, но имплантация действительно может наступить в любой ткани человеческого тела без предварительной подготовки этой ткани, однако в эндометрии имплантация возможна только в период «окна имплантации».
Отсутствие имплантации в циклах ЭКО является одной из основных проблем современной репродуктологии. В связи с чем, с целью повышения результативности циклов ЭКО, в последние годы, особое внимание уделяется изучению "окна имплантации" и процессам, происходящим между рецепторным аппаратом эндометрия и бластоцистой. Этот период приходится на 7-10 день после овуляции и соответствует 21-24 дню естественного 28-дневного менструального цикла [168,198] или наступает на 1-2 дня раньше в циклах стимуляции овуляции [144]. «Окно имплантации» представляет собой период времени когда эндометрий восприимчив к имплантации бластоцисты, в этот период возможно взаимодействие эмбриона и эндометрия, приводящее к имплантации бластоцисты и наступлению беременности. Продолжительность «окна имплантации» очень короткая составляет около 48 часов, поэтому должна совпадать по времени с развитием эмбриона до стадии бластоцисты. Врачи репродуктологи выделяют «окно имплантации» и «окно переноса». Ранее перенос эмбрионов проводили на стадии 4–8 клеток (2–3-й день после оплодотворения). Этот период времени называют окном переноса, он предшествует на 2-4 дня «окну имплантации». В настоящее время стараются продлевать культивирование эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты, так как это способствует синхронизации процессов между эндометрием и эмбрионом и увеличивает показатели успешных имплантаций [52, 137, 194]. Этот период определяется экспрессией большого количества сигнальных молекул, таких как цитокины, протеазы, хемокины, ионы, питательные и транспортные белки, которые осуществляют паракринную, аутокринную, интракринную и юкстакринную регуляцию клеточных и межклеточных взаимодействий. Эти взаимодействия модулируют последующее формирование и «поведение» бластоцисты, сохранение беременности и адаптацию к ней организма матери. Определение оптимального времени максимальной рецептивности эндометрия, для проведения селективного переноса эмбрионов в полость матки, является основной целью большого числа исследований [90,172,178,181].
Согласно современным представлениям процесс имплантации протекает в три взаимосвязанных и условно выделяемых фазы: присоединения (apposition), сцепления (adhesion) и вторжения (invasion). Начало процесса имплантации имеет строго фиксированный момент - это «вылупление» бластоцисты из блестящей оболочки (хетчинг). Исчезновение блестящей оболочки «обнажает» рецепторы и освобождает выход различных сигнальных молекул, которые вовлекаются в последующие этапы имплантации. Аппозиция - определяется как неустойчивая адгезия бластоцисты к поверхности эндометрия и проявляется началом "диалога" между бластоцистой и рецептивным эндометрием посредством локального действия гормонов, паракринных регуляторов: ряда цитокинов (LIF, IL-1, IL-6), факторов роста (GM-CSF, VEGF, TGF, HB-EGF, IGF), простагландинов [46,68,109, 114].
Вторая фаза имплантации (adhesion) характеризуется стабильной адгезией которая проявляется усилением функциональных взаимосвязей между эпителием трофобласта и поверхностным эпителием эндометрия посредством местных паракринных сигналов, в первую очередь таких адгезионных молекул как интегрины.
Комплекс иммуноглобулинов, селектины, интегрины и кадгерины общепризнано считают молекулами адгезии. Интегрины - семейство трансмембранных гликопротеинов, состоящих из двух различных нековалентных цепей (,). В клеточно-матриксной и клеточно-клеточной адгезии важную роль занимают интегрины. Кроме этого, они участвуют и во многих физиологических процессах: эмбриональном развитии, различных защитных механизмах гемостазе. Интегрины являются связующими молекулами между клетками. Они беспечивают процессы миграции клеток, дифференцировки и пролиферации. Интегрины, это посредники механических и химических путей реализации различных процессов, посредством активации факторов роста. Данная группа белков присутствует в функциональном слое эндометрия и децидуальных и цитотрофобластических структурах [62,125].
Гистологическое исследование эндометрия
Материалом для исследования послужили биопсии эндометрия женщин планирующих лечение методами ВРТ в отделении репродуктивных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О.Отта»».
Критерии включения в исследование составили: - возраст от 18 до 37 лет; - наличие только одного фактора бесплодия; - ЭКО и перенос эмбрионов (ПЭ) в полость матки осуществлялся в последующем цикле после проведения биопсии эндометрия; - отсутствие гормонального лечения до взятия биопсии в течение 3 месяцев; - уровень ФСГ в крови не выше 11 МЕ/л на 2–5 день менструального цикла (ДМЦ); - уровень АМГ в крови в пределах 1–2,5 нг/л, на 2–5 ДМЦ; - наличие от 6 до 12 антральных фолликулов при ультразвуковом исследовании яичников на 2–4 ДМЦ; - использование короткого протокола с применением антагонистов гонадотропин-рилизинг гормона (Гн-РГ); - перенос только морфологически качественных эмбрионов; - морфологическое соответствие эндометрия средней стадии фазы секреции, отсутствие признаков недостаточности лютеиновой фазы, хронического эндометрита и другой патологии эндометрия. Биопсии были получены на 7-9 день после овуляции с помощью аспирационной кюретки PipelledeCornier («JiangsuCo., Ltd.», КНР) в цикле, предшествующем проведению ЭКО. Для регистрации овуляции использовали один из методов: либо определяли пик лютеинизирующего гормона (ЛГ) в моче с помощью стрип-теста; либо определяли овуляцию ультразвуковым методом. Для поддержки лютеиновой фазы цикла применялся микронизированный прогестерон.
Перенос морфологически качественных эмбрионов в полость матки выполняли на 3, 4 или 5 день развития. На стадии дробления качество эмбрионов оценивалось по наличию фрагментации цитоплазмы и количеству бластомеров [98].
На третий день переносили эмбрионы качества А и В с 8–10 бластомерами.
Эмбрион класса А – симметрично развитый эмбрион, имеющий не более 10 % фрагментации и количество бластомеров, соответствующее дню культивирования.
Эмбрион класса В – симметрично развитый эмбрион с фрагментацией не более 20 % и количество дробящихся бластомеров, соответствует дню культивирования.
На четвертый день культивирования переносили морулы третьего и/или четвертого класса согласно классификации Тао [185].
Морула третьего класса – это эмбрион правильной округлой формы с компактизованными бластомерами с фрагментацией не более 10 %.
Морула четвертого класса – это эмбрион правильной округлой формы с полностью компактизованными бластомерами без фрагментации.
На пятый день культивирования переносили бластоциты со степенью экспансии 3-5, с качеством развития трофэктодермы и внутриклеточной массы А и В [105].
Оставшиеся морфологически качественные эмбрионы криоконсервировались методом витрификации. Диагностика беременности проводилась биохимическим методом на 14 день после переноса эмбрионов в полость матки и ультразвуковым методом на 21 день. Критерии исключения из исследования составили: - гипо- и гипергонадотропная недостаточность функции яичников; - гиперандрогенемия любого происхождения; - синдром поликистозных яичников (СПЯ) и НГЭ III-IV степени распространённости; - ожирение у пациенток с ИМТ более 35 кг/м; - возраст старше 37 лет; - наличие более одного фактора бесплодия; - отмена переноса в текущем цикле по какой либо причине (синдром гиперстимуляции яичников). Выявление патологии эндометрия при гистологическом исследовании.
При формировании групп женщин для исследования стремились максимально стандартизировать их по ключевым лабораторным и анамнестическим факторам, влияющим на рецептивность эндометрия, стараясь при этом создать условия, где единственной переменной будет рецептивность эндометрия.
Одним из ключевых факторов, определяющим фертильность является овариальный резерв. Оценка овариального резерва проводилась по параметрам: возраст, уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), антимюллеров гормон (АМГ), количеству фолликулов в яичниках на 2-4 ДМЦ от 9 до 12 (эти показатели являлись критериями включения в исследование)
Так же большое отрицательное влияние на рецептивность оказывают перенесенные гинекологические заболевания и оперативные вмешательства. Во всех группах исследования частота встречаемости инфекций передающихся половым путем, оперативных вмешательств статистически не различалась. Сопутствующая соматическая патология была представлена заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (хронический гастрит/гастродуоденит, дискинезия желчевыводящих путей), мочевыделительной системы (МВС) (хронический цистит, мочекаменная болезнь, хронический пиелонефрит). В период подготовки и проведения лечения методами ЭКО данные заболевания были в стадии ремиссии или медикаментозной компенсации.
Важным фактором влияющим на многие показатели репродуктивного здоровья и эффективность программ ЭКО является возраст женщины. Возраст вошедших в исследование женщин варьировался от 22 до 35 лет и в среднем составил 34 года, что отражает ранний репродуктивный возраст у всех женщин.
Все обследованные женщины имели регулярный менструальный цикл без значительных отклонений от нормы. Возраст менархе в среднем составил 11,90±0,14 лет. Продолжительность менструального цикла варьировала от 25 до 33 дней (28,52±0,23 дня). Возраст начала половой жизни достоверно не отличался у женщин обследованных групп и составил в среднем 19,53±0,22 лет.
Продолжительность бесплодия варьировала от 3 до 10 лет, в среднем составляя 6,32±0,85 лет. Первичное и вторичное бесплодие одинаково часто встречалось в исследуемых группах.
В результате отбора в исследование вошло 240 случаев, которые на первом этапе исследования были разделены на 2 группы по исходу программы ЭКО, без учета фактора бесплодия:
Экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона в эндометрии
Математическое и статистическое моделирование стало общим инструментом в оценке и управлении возникновений патологических состояний. Как отмечают исследователи, имеющие смысл прогнозы можно получить только с учетом прошлого поведения реальной системы. Желание использовать максимальное количество входной информации, согласующееся с прошлым поведением модели, усложняет задачу прогноза из-за увеличения пространства параметров. При этом увеличивается неудобство практического применения алгоритма из-за большого разброса прогнозируемых характеристик, сложности и трудоемкости расчетов [176-178].
Правдоподобной моделью является та, которая феноменологически (этиопатогенетически) согласуется с наблюдаемыми данными и соответствует принципам доказательной медицины. Основой прогнозирования должно быть отражение этиопатогенетической феноменологии болезни или нарушения здоровья на основе данных о непосредственных или отдаленных эффектах, клинических исходах, имеющих четкую научную интерпретацию и медико-социальную значимость. При приемлемой точности модель не должна быть чрезмерно сложной для практического использования. Модель должна представлять собой логическую или математическую зависимость по наилучшим из имеющихся качественных и количественных статистических данных [127,144].
Оценка информативности иммуногистохимических маркеров при прогнозировании исхода экстракорпорального оплодотворения в группе женщин, получивших лечение в связи с мужским фактором бесплодия
Оценку информативности иммуногистохимических маркеров и прогнозирование исхода экстракорпорального оплодотворения для группы женщин, получивших лечение в связи с мужским фактором бесплодия, проводили с помощью дискриминантного анализа. Этот метод позволяет формулировать решающее правило, для определения положительного (наступление беременности) и отрицательно (отсутствие беременности) исхода среди женщин, участвовавших в цикле ЭКО на основании иммуногистохимических маркеров. В связи с тем, что не все исследуемые показатели подчинялись нормальному закону распределения, были использованы непараметрические методы дискриминации, не требовательные к виду распределения случайных величин.
При проведении дискриминантного анализа из общей группы женщин, получивших лечение в связи с мужским фактором бесплодия, случайным бесповторным отбором были сформированы группы обучения 54 (67,5 %) и проверки 26 (32,5 %) пациенток. Информативность иммуногистохимических маркеров при прогнозировании исхода цикла ЭКО в группе женщин, получивших лечение в связи с мужским фактором бесплодия, оценивали по критерию Уилкса (таблица 15).
Информативность иммуногистохимических маркеров при прогнозировании исхода экстракорпорального оплодотворения в группе женщин, получивших лечение в связи с мужским фактором бесплодия Иммуногистохимические маркеры Критерии Уилкса F Относительная площадь экспрессии LIF в железистом компоненте эндометрия 0,63 37,03 Оптическая плотность экспрессии интегрина V3 в железистом компоненте эндометрия 0,90 6,96 Относительная площадь экспрессии интегрина V3 в стромальном компоненте эндометрия 0,90 6,69 Относительная площадь экспрессии TGF1 в 0,91 6,25 1 2 3 стромальном компоненте эндометрия Оптическая плотность экспрессии VEGF в стромальном компоненте эндометрия 0,93 4,46 Оптическая плотность экспрессии TGF1 в железистом компоненте эндометрия 0,97 2,09
Статистика Уилкса позволяет оценить вклад каждой переменной в разделение общей совокупности на группы: чем меньше значение показателя, тем меньше его вклад в дискриминацию. Анализ таблицы показал, что наиболее информативны при прогнозе исхода цикла ЭКО в группе с мужским фактором бесплодия являются молекулы первичного прикрепления это относительная площадь экспрессии LIF и интегрина V3 в железистом компоненте эндометрия, и относительная площадь экспрессии фактора роста TGF1 в стромальном компоненте эндометрия. Использование пошаговой процедуры включения переменных на основе статистики Уилкса позволило рассчитать дискриминантные функции: P = 1,9A+153,3B+1,6C-53,1 (2) O = 0,9A+121,7B+0,6C-21,5, (3) где P – дискриминантная функция положительного исхода ЭКО О – дискриминантная функция отрицательного исхода ЭКО А - Относительная площадь экспрессии LIF в железистом компоненте эндометрия, B - Оптическая плотность экспрессии интегрина V3 в железистом компоненте эндометрия, C - Относительная площадь экспрессии TGF1 в стромальном компоненте эндометрия. Таблица 16 Статистическая оценка факторов, выделенных по результатам дискриминантного анализа Фактор Критерии Уилкса F Свободный член 0,3 137,9 Относительная площадь экспрессии LIF в железистом компоненте эндометрия 0,3 142,0 Оптическая плотность экспрессии интегрина aVp3 в железистом компоненте эндометрия 0,9 5,0 Относительная площадь экспрессии TGF1 в стромальном компоненте эндометрия 0,9 8,4 Критерий F статистически значим при p 0,01
Критерий F статистически значим при p 0,05 Все входящие в дискриминантные функции переменные достоверно отличаются от нуля (таблица 16). Испытание полученной модели на группе проверки выявило 96,2 % правильность дискриминации. Кросс-проверка на группе обучения показала несколько меньшие, но также высокие результаты 92,3 % правильных ответов.
Прогнозирование исходов экстракорпорального оплодотворения по данным экспрессии иммуногистохимических маркеров
Все входящие в дискриминантные функции переменные достоверно отличались от нуля. Испытание полученной модели на группе проверки выявило 97,2 % правильность дискриминации. Кросс-проверка на группе обучения показала несколько меньшие, но также высокие результаты: 94,1 % правильных ответов. На третьем этапе проводили оценку информативности иммуногистохимических маркеров и прогнозирование исхода экстракорпорального оплодотворения для группы женщин с наружным генитальным эндометризом I-II степени с использованием дискриминантного анализа. Для этого из общей группы женщин с наружным генитальным эндометриозом случайным бесповторным отбором были сформированы группы обучения 37 (67,3 %) и проверки 18 (32,7 %) пациенток.
Наиболее информативны при прогнозе исхода цикла ЭКО в группе женщин с наружным генитальным эндометриозом: относительная площадь экспрессии LIF; относительная площадь экспрессии и оптическая плотность интегрина V3 в железистом и стромальном компоненте эндометрия а так же относительная площадь экспрессии фактор роста TGF1 и VEGF-А в стромальном компоненте эндометрия.
Использование пошаговой процедуры включения переменных на основе статистики Уилкса позволило рассчитать дискриминантные функции: P = 0,04A+126,0B+3,7C-23,5 (12) O = 0,09A+83,9B+1,9C-13,4, (13) где P – дискриминантная функция положительного исхода ЭКО О – дискриминантная функция отрицательного исхода ЭКО А - Экспрессия PR в железистом компоненте эндометрия, B - Оптическая плотность экспрессии LIF в железистом компоненте эндометрия, C - Относительная площадь экспрессии TGF1 в стромальном компоненте эндометрия Все входящие в дискриминантные функции переменные достоверно отличались от нуля. Испытание полученной модели на группе проверки выявило 89,1 % правильной дискриминации. Кросс-проверка на группе обучения показала несколько меньшие, но также высокие результаты: 88,8 % правильных ответов.
Заключительным этапом была разработка алгоритма прогнозирования исходов экстракорпорального оплодотворения по данным экспрессии иммуногистохимических маркеров. Для этого использовали метод деревьев классификации, позволяющего соотносить объекты к тому или иному классу в зависимости от соответствующих значений одной или нескольких независимых (предикторных) переменных. Построение дерева классификации позволило на основе решающих правил классифицировать объекты. Выбор наилучшего дерева был проведен на основе наименьшей цены (доли неправильно классифицированных наблюдений), то есть выбран прогноз с наименьшим процентом неправильных классификаций.
При построении (поиске) дерева классификации подходящего размера с минимальной ошибкой классификации были реализованы все методы ветвления при различных комбинациях основных установок. Критериями качества дерева классификации были выбраны: количество ошибок классификации, соотношение и значение цен кросс-проверки и глобальной кросс-проверки.
При построении дерева классификации цена обучения равна 0,043, т.е. доля ошибочной классификации равна 4,3 %, а при V-кратной кросс-проверке средняя доля ошибочно классифицированных наблюдений достигла 10 %.
Анализ дерева классификации показал, что наиболее информативные показатели при прогнозировании исхода ЭКО: относительная площадь экспрессии TGF1 в стромальном компоненте эндометрия (ранг-100), относительная площадь экспрессии LIF в железистом компоненте эндометрия (ранг-84) и оптическая плотность экспрессии LIF в железистом компоненте эндометрия (ранг-71).
С помощью разработанной модели возможно прогнозирование группы с неблагоприятным исходом лечения и определение индивидуального риска возникновения осложнений в виде перегрузки медикаментозными средствами и психо-эмоциональной нагрузки, что позволяет принимать научно-обоснованные решения, направленные на улучшение эффективности проводимых лечебных мероприятий.
На основании разработанного решающего правила предложен следующий алгоритм прогноза возникновения неблагоприятного исхода: 1. При планировании лечения методами ЭКО необходимо проведение биопсии эндометрия и гистологического исследования. 2. На втором этапе в случае не выявления явных причин препятствующих формированию рецептивности эндометрия (гиперпластические процессы, воспалительные изменения) проводят комплексную оценку функционального состояния эндометрия с применением иммуногистохимического метода. 3. На третьем этапе соотносят каждого обследованного к группам «положительный исход» и «отрицательный исход» используя алгоритм прогнозирования.
Становится все более очевидным, что одного идеального биомаркера не существует, так как сложность патогенеза любого заболевания, ведущего к бесплодию и физиологические особенности каждой пациентки не могут быть идентифицированы по одному биомаркеру.
Расширение фундаментальных исследований по изучению молекулярно-клеточных механизмов имплантации позволит лучше понимать механизмы лежащие в основе формирования имплантации и может явиться основой для разработки лекарственных средств для селективного воздействия на эндометрий с нарушенной рецептивностью. Для применения в практике необходимо проведение крупных исследований на больших когортах женщин с нормальной и нарушенной фертильностью, что позволит определить диапазон нормы экспрессии различных молекул, стандартизировать методы и даст возможность в перспективе опираться и использовать их для предиктивной диагностики и коррекции рецептивности