Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Прогностическое значение плоидометрических и морфометрических исследований при раке почки 13
1.1. Патоморфологические факторы прогноза почечно-клеточного рака 13
1.2. Гетерогенность клеточных популяций при почечно-клеточном раке 18
1.3. Значение микроспектрофотометрического исследования плоидности опухолевых клеток при почечно-клеточном раке 20
1.4. Анеуплоидия как показатель биологического поведения опухоли при почечно-клеточном раке 22
1.5. Морфометрия ядра как прогностический фактор при почечно-клеточном раке 25
1.6. Резюме 28
Собственные исследования
Глава 2. Материал и методы исследования 29
2.1. Материал исследования 29
2.2. Методы исследования
2.2.1. Гистологические методы 32
2.2.2. Гистохимические методы 33
2.2.3. Морфоденситофотометрический и морфометрический методы исследования с применением компьютерного анализатора изображений 33
2.2.4. Статистические методы исследования 38
Глава 3. Плоидометрическая и морфометрическая характеристика ядер канальцевого эпителия неизмененной ткани почки и почечно клеточного рака 39
3.1. Плоидометрическая и морфометрическая характеристика ядер эпителия неизмененной ткани почки 39
3.2. Плоидометрическая и морфометрическая характеристика ядер клеток почечно-клеточного рака
Глава 4. Взаимосвязи плоидмометрических и морфометрических показателей с клинико-морфологическими параметрами при почечно-клеточном раке 45
4.1. Взаимосвязь плоидности опухолевых клеток и клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака 45
4.2. Взаимосвязь площади ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака 51
4.3. Взаимосвязь периметра ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака 55
4.4. Взаимосвязь диаметра ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака 59
4.5. Взаимосвязь фактора круга ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака 62
4.6. Взаимосвязь фактора эллипса ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака 66
4.7. Взаимосвязь фактора удлиненности ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака 70
Глава. 5. Корреляционные взаимосвязи с клинико морфологическими факторами прогноза и анализ выживаемости больных в зависимости от изученных параметров 76
5.1. Взаимосвязи плоидометрических и морфометрических параметров с клинико-морфологическими факторами прогноза при почечно-клеточном раке 76
5.1.1. Взаимосвязи индекса накопления ДНК с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 76
5.1.2. Взаимосвязи типов гистограмм распределения индекса накопления ДНК в опухолевых клетках с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 77
5.1.3. Взаимосвязи площади ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 78
5.1.4. Взаимосвязи периметра ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 78
5.1.5. Взаимосвязи диаметра ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 79
5.1.6. Взаимосвязи фактора круга ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 80
5.1.7. Взаимосвязи фактора эллипса опухолевых клеток с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 80
5.1.8. Взаимосвязи фактора удлиненности ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 81
5.1.9. Взаимосвязи фактора удлиненности (с одновременным увеличением ядра) опухолевых клеток с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака 82
5.2. Сопоставление общей выживаемости больных в зависимости от плоидометрических и морфометрических параметров почечно-клеточного рака 82
Заключение 92
Выводы 105
Практические рекомендации 107
Список сокращений 107
Список литературы
- Значение микроспектрофотометрического исследования плоидности опухолевых клеток при почечно-клеточном раке
- Морфоденситофотометрический и морфометрический методы исследования с применением компьютерного анализатора изображений
- Плоидометрическая и морфометрическая характеристика ядер клеток почечно-клеточного рака
- Взаимосвязь диаметра ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака
Введение к работе
Актуальность темы. Рак почки (РП) является одним из широко распространенных онкологических заболеваний мочевыделительной системы. В мире выявляется около 250 тыс. случаев РП в год, распространенность в структуре онкологической заболеваемости составляет 4,3%, соотношение встречаемости у мужчин и женщин – 3:2 (Давыдов М.И. и др., 2010; Алексеев Б.Я. и др., 2012; Pantuck A.J. et al., 2001).
В России в 2014 году из 544 763 впервые выявленных онкологических больных диагноз РП установлен в 21 394 случаях, что составило 3,9% от общего числа лиц с выявленными злокачественными новообразованиями (Каприн А.Д. и др., 2014). В Алтайском крае показатели заболеваемости РП выше, чем по России: 11,96% и 8,54% соответственно (Чиссов В.И. и др., 2003; Давыдов М.И. и др., 2010). С 2008 года по 2013 год в Алтайском крае смертность от РП возросла с 4,3 до 5,5 на 100 тыс. населения. Наиболее высокий пик смертности от РП в Алтайском крае пришелся на 2011 год, когда заболеваемость составила 7,0 на 100 тыс. населения (Ганов Д.И. и др., 2014). РП имеет огромное социальное значение из-за низкой выживаемости больных после лечения, потому что, как правило, в значительной степени резистентен к терапии (Пасечник Д.Г., 2001; Юрин А.Г., 2007).
РП представляет собой гетерогенную группу опухолей, преобладающим типом среди первичных опухолей почек является почечно-клеточный рак (ПКР), который составляет почти 95% всех случаев опухолей почек у взрослых. В то же время каждый гистологический вариант ПКР имеет уникальные клинико-морфологические особенности.
РП характеризует медленный рост первичного очага с одновременной непредсказуемостью течения (Юрин А.Г., 2007). ПКР проявляет большой метастатический потенциал – метастазы обнаруживаются у 25% пациентов на момент постановки диагноза, у 30-50% больных отдаленные метастазы выявляются в различные сроки после операции. Средняя выживаемость пациентов после операции не превышает 6-12 месяцев (Матвеев В.Б. и др., 2005).
Важной задачей онкоурологии на сегодняшний день остается изучение новых факторов прогноза в определении послеоперационной выживаемости при РП. На данный момент нет объективных прогностических факторов, отвечающих всем требованиям, что заставляет продолжать разработки в этом направлении. Применение таких факторов, как размер опухолевого узла, стадия онкологического процесса, степень дифференцировки злокачественных клеток не всегда позволяет предсказать течение РП у конкретного больного (Шустицкий Н.А., 2007). Одной из причин этого может быть наличие широкой гетерогенности клеточных элементов в разных участках опухоли.
Происхождение популяций опухолевых клеток с разными свойствами в пределах одной опухоли является следствием их генетической неустойчивости (Henk G. et al., 1993). Гетерогенность опухолевых клеток как фактор прогноза изучалась в раках различных локализаций (Vindelov L.L. et al., 1980; Quirkel P., et al., 1987; Sasaki K. et al., 1988, 1991; Carey F.A. et al., 1990; Marusyk A. et al., 2010). При ПКР гетерогенность показана в некоторых работах (Henk G. et al., 1993; Nenning H. et al., 1997). Плоидометрический и ка-риометрический метод могут быть использованы для количественного определения степени гетерогенности опухолевых клеток, определения их фенотипических особенностей и таким образом помочь в разработке более объективной градации опухоли при РП.
Таким образом, учитывая вышеизложенное, изучение плоидометрических и морфо-метрических параметров ядра опухолевых клеток у больных ПКР представляется актуальной задачей, решение которой позволит объективизировать прогноз заболевания.
Степень разработанности темы исследования. Важной проблемой онкологии и патологической анатомии остается улучшение диагностики и прогнозирование выживаемости послеоперационных пациентов при РП. Возникает большая необходимость для больных и врачей быть информированными в плане течения заболевания, риска метаста-зирования и вероятного исхода. Однако на данный момент нет объективных прогностических критериев выживаемости, а применение общепринятых классических факторов прогноза не всегда дает возможность предсказать течение РП у конкретного больного (Шуст-ицкий Н.А., 2007), что делает данную проблему очень актуальной.
В основе проблемы прогнозирования лежит гетерогенность РП в разных участках опухоли (Ljungberg B. Et al., 1996; Nenning H. Et al. 1997). Значение гетерогенности клеток опухоли как прогностического фактора показано при ряде локализаций опухолевого процесса (Vindelov L.L. et al., 1980; Quirkel P. et al., 1987; Sasaki K. еt al., 1988; Carey F.A. et al., 1990; Marusyk A. еt al., 2010), но при РП таких исследований не проводилось.
Ввиду вышеизложенного проблема разработки объективных, достоверных факторов прогноза при ПКР является очень актуальной.
Цель исследования – изучить морфометрические и плоидометрические характеристики ядер клеток почечно-клеточного рака в зависимости от клинико-морфологических параметров опухоли для выявления значимых критериев диагностики и прогноза послеоперационной выживаемости.
Задачи исследования.
-
Провести плоидометрическое и морфометрическое исследование ядер клеток условно неизмененной ткани почки.
-
Установить плоидометрические параметры ядер опухолевых клеток с построением гистограмм гетерогенности параметров в зависимости от клинико-морфологических параметров опухолей.
-
Изучить морфометрические характеристики ядер опухолевых клеток (площадь, периметр, диаметр, фактор круга, фактор эллипса и фактор удлиненности ядра) в зависимости от клинико-морфологических параметров опухолей.
-
Исследовать корреляционные связи плоидометрических и морфометрических характеристик с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака.
-
Изучить влияние плоидометрических и морфометрических параметров ядер клеток почечно-клеточного рака на прогноз 5-летней послеоперационной выживаемости больных.
Научная новизна. Впервые на большом клиническом материале выявлены и систематизированы взаимосвязи плоидометрических и морфометрических параметров ядер опухолевых клеток с рядом клинико-морфологичеcких характеристик ПКР: полом и возрастом больных, стадией, размером, гистологическим типом опухоли, степенью анаплазии опухолевых клеток по Fuhrman, наличием регионарных и дистантных метастазов. Выявлена связь степени гетерогенности клонов опухолевых клеток по плоидометрическим и морфометрическим параметрам с прогрессией неоплазии при ПКР.
Впервые на обширном материале установлены и проанализированы плоидометриче-ские и морфометрические параметры – индекс накопления ДНК (ИНДНК), гистограммы гетерогенности ИНДНК, площадь, периметр и диаметр ядра, фактор круга, фактор эллипса и фактор удлиненности ядра (без учета и с учетом площади ядра) в первичной опухоли при развитии метастазов, показана их прогностическая значимость. Впервые выявлено
прогностическое значение фактора удлиненности ядра опухолевых клеток с одновременным учетом площади ядра.
Установлено, что наиболее значимыми прогностическими факторами 5-летней послеоперационной выживаемости больных ПКР являются такие плоидометрические и морфометрические параметры опухолевых клеток, как диаметр ядра (p = 0,000001), фактор удлиненности с учетом площади ядра (p = 0,000001), площадь ядра (p = 0,00002), периметр ядра (p = 0,00004), ИНДНК (p = 0,00005), тип гистограммы распределения ИНДНК в ядрах (p = 0,025).
Теоретическая и практическая значимость. Проведенное исследование позволило выявить выраженную гетерогенность клеток РП по плоидометрическим и морфометриче-ским параметрам. Степень данной гетерогенности непосредственно коррелирует с клини-ко-морфологическими параметрами опухоли и возрастает в наиболее злокачественных опухолях с наличием метастазов. Значительная гетерогенность клеточных популяций по плоидометрическим и морфометрическим параметрам, приобретение опухолевыми клетками новых фенотипических признаков в метастатических опухолях может быть результатом «патологической» эволюции опухолевых клеток и представлять одно из звеньев патогенеза, способствуя селекции клеток с высоким метастатическим потенциалом, что имеет большое теоретическое и практическое значение.
Изучение плоидометрических и морфометрических параметров ядер клеток первичной карциномы может быть важным прогностическим критерием для оценки риска развития метастазов на дооперационном этапе и при планировании объема хирургического лечения ПКР.
Изученные плоидометрические и морфометрические параметры ПКР позволят более объективно определять степень злокачественности новообразований. Результаты количественных плоидометрических и морфометрических исследований могут быть использованы при проведении научных исследований, направленных на поиск объективных критериев диагностики и прогноза РП.
Методология и методы исследования. Методологически работа основана на применении принципов системного анализа комплекса данных, методов морфологического анализа патологических процессов, использовании теоретических разработок и обобщений о типовых патологических процессах. В исследование включены современные методы морфологического анализа и интерпретации полученных данных. Материал исследования – ткань опухоли и условно неизмененная ткань почки от 115 больных ПКР. Объект исследования – морфометрические и плоидометрические параметры ПКР и их связь с клинико-морфологическими критериями (полом, возрастом пациентов, гистологическим типом, степенью анаплазии, метастатическим потенциалом и стадией онкологического процесса); кумулятивная 5-летняя выживаемость пациентов ПКР в зависимости от молекулярно-биологических характеристик опухоли.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Плоидометрические и морфометрические параметры опухолевых клеток (площадь, периметр, диаметр ядра; фактор круга и фактор удлиненности ядра без и с учетом площади ядра; ИНДНК и тип гистограммы ИНДНК) коррелируют с важнейшими клини-ко-морфологическими параметрами ПКР.
-
Плоидометрические и морфометрические характеристики ядер опухолевых клеток ПКР являются одними из наиболее информативных критериев при оценке распространенности опухолевого процесса и риска возникновения метастазов.
3. К неблагоприятным факторам прогноза ПКР могут быть отнесены: высокие значения площади, периметра, диаметра ядра; высокие показатели фактора удлиненности ядра (без и с учетом площади ядра); значительный ИНДНК и выраженно гетерогенный и гомогенно анеуплоидный типы гистограммы ИНДНК.
Степень достоверности результатов диссертации. Использованные современные методы исследования (патоморфологический анализ, метод тканевых матриц, морфомет-рический, морфоденситометрический анализ) и способы статистической обработки соответствуют поставленным цели и задачам и позволяют получать достоверные результаты. Диссертация выполнена на достаточном по объему операционном материале (образцы опухоли и условно неизмененной ткани почки от 115 больных ПКР) с использованием сертифицированного оборудования. Сформулированные научные положения, выводы и практические рекомендации основаны на результатах собственных исследований, не носят характера умозрительных заключений и вытекают из результатов работы.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались и обсуждались на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в онкологической практике» (Барнаул, 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новые методы в онкологической практике» (Барнаул, 2013); научно-практической конференции, посвященной 20-летию КГБУЗ ДЦ АК «Современные диагностические и лечебные технологии» (Барнаул, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ в международных и республиканских изданиях, из них 5 – в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 42 рисунками, 65 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 73 отечественных и 166 зарубежных источников.
Значение микроспектрофотометрического исследования плоидности опухолевых клеток при почечно-клеточном раке
Рак из собирательных трубочек мозгового вещества почки (из протоков Беллини) – редкая форма ПКР, связанная с протоками мозгового вещества почки, встречается менее чем в 1% случаев злокачественных эпителиальных опухолей у взрослых (Пальцев М.А. и соавт. 2005). До 1998 г. описано не более 200 наблюдений данной неоплазии. Медуллярный тип ПКР – наиболее редко встречающееся, быстро растущее эпителиальное новообразование мозгового вещества почки: к 2000 г. описано только 50 случаев. Предполагается, что опухоль также происходит из собирательных протоков, но при этом не является подтипом опухоли Беллини по данным последних классификаций. При этом типе ПКР описывают повреждения в гене BRC/ABL (Murphy W.M. et al., 2004). Муцинозный тубулярный и веретеноклеточный рак почек относившаяся к группе не классифицируемых карцином почек, развивается из дистального отдела нефрона (в том числе, возможно, из петли Генле) (Соколова И.А. и др., 2006). По данным литературы, частота этих опухолей среди пер 15 вичных новообразований почек составляет около 0,4% (Соколова И.А. и др., 2006). Почечно-клеточный рак, ассоциированный с Хр11.2-транслокацией гена TFE3, описывают лишь в последние годы, поэтому частота его не изучена. Этот тип ПКР возникает преимущественно у детей и лиц молодого возраста, описано лишь несколько случаев у пожилых людей (Coughlin S.S. et al., 1997). На долю не классифицируемого почечно-клеточного рака приходится от 4-5% (Пальцев М.А. и др., 2005) до 6-7% случаев (Murphy W.M. et al., 2004). Это сборная группа опухолей, включающая новообразования комбинированного строения, которые не могут быть отнесены к одному из существующих типов в классификации почечно-клеточного рака; опухоли, вызывающие затруднение в дифференциальной диагностике; карциномы почки высокой степени злокачественности или саркоматоидные раки, в которых эпителиальные элементы не могут быть выявлены или классифицированы. Саркоматоидный вариант сейчас не рассматривается в качестве отдельного типа. Между тем, наличие саркоматоидного компонента является плохим прогностическим признаком, поэтому его необходимо отражать в патогисто-логическом заключении (Cohen R.J. et al., 2000; Cangiano T. et al., 2002).
Важнейшим направлением в клинической практике является выделение факторов, позволяющих составить индивидуальный прогноз и определить оптимальную тактику лечения больных РП [Попов В.В. 2005; Юрин А.Г. 2006, 2009; Серегин А.В. и др., 2009; Зеленевич И.А., 2011; Young A.N. et al., 2001; Zisman A. et al., 2002). При анализе многочисленных литературных данных, посвященных этому вопросу, можно выделить несколько групп факторов, претендующих на роль прогностических. Среди них выделяют традиционно используемые клинические и анатомические факторы (Носов Д.А. и др., 2005; Пальцев М.А. и соавт. 2006; Leibovich B.C. et al., 2003), получившие в последнее время широкое распространение гуморальные факторы (Журавлев В.Н. и др., 2005; Сергеева Н.С. и др., 2005; Suzuki K. et al., 2001; Bamias A. et al., 2003), а также группы гистологических (Delahunt B. 1995; Citterio M. et al., 2004), молекулярных (Лоран О.Б. и др., 2008) и иммуногистохимических фак 16 торов (Непомнящих Л.М. и др., 2006; Степанова С.Л. и др., 2007).
Считается, что возраст и пол не влияют на прогноз больных почечно-клеточным раком (Матвеев В.Б. и др., 2005; Сергеев А.В. и др., 2009). Влиянию анатомических факторов на прогнозирование течения опухолевого процесса и результатов лечения распространенного ПКР посвящено большое количество работ (Пытель Ю.А. 1997; Давыдов М.И. и др., 2002; Носов Д.А. и др., 2005; Магер В.О. 2007; Юрин А.Г. 2007; Figlin V. 1999; Lam J.S. et al., 2004).
Важнейшими среди прогностических факторов, по мнению многих авторов, являются степень ядерной атипии по Фурману (Юрин А.Г., 2007, Fuhman S.A. et al., 1982) и TNM-стадия, менее значимы клеточный вариант и характер роста ПКР (Javidan J. et al., 1999). В настоящее время в России, как и во многих странах, используется классификация, предложенная Международным противораковым союзом (UICC) в 2002 г. – TNM-классификация, подробно освещающая степень распространенности опухолевого процесса с целью определения лечебной тактики, которая по сравнению с предшествующей классификацией (1997) претерпела изменения. Добавлены следующие анатомические распространения поражения: Т1а – опухоль ограничена почкой, 4 см в наибольшем измерении; T1b – опухоль ограничена почкой, 4 см и 7 см в наибольшем измерении; Т2 – опухоль также ограничена пределами почки, но в наибольшем измерении должна быть 7 см (а не 7 см, как ранее). Стадия опухолевого процесса (Т), отражающая анатомическую распространенность новообразования, является наиболее значимым фактором прогноза при РП (Серегин А.В. и др., 2009; Schips L. et al., 2003; Steiner T. et al., 2004; Ficarra et al., 2004, 2005;). Пациенты с опухолью, ограниченной почкой, имеют лучший прогноз (Javidan J. et al., 1999). Инвазия за пределы капсулы Герота (Т3а) уменьшает выживаемость на 27%, наличие опухолевого тромбоза почечной и нижней полой вен (ТЗс) – на 40%. В последнее время появились и новые сводные данные крупнейших европейских онкологических центров о частоте этих стадий заболевания и выживаемости больных, основанные на анализе нескольких десятков тысяч наблюдений. Среди пациентов с локализованными формами почечно-клеточного рака частота опухолей в стадии Т1а составляет 48% (5-летняя выживаемость – 95,3%, 10-летняя – 83,4%), T1b – 34,8% (5-летняя выживаемость – 91,4%), 10-летняя – 83,4%), Т2 – 17,2% (5-летняя выживаемость – 81,6%, 10-летняя-75,2%) (Frank I. еt al., 2001; Han K.R.et al., 2003; Ficarra V. et al., 2005).
Инвазия в коллатеральные вены и капилляры также является неблагоприятным фактором прогноза (Пытель Ю.А. и др., 1997). Наличие метастазов в лимфатические узлы у больных с РП ассоциировано с крайне плохим прогнозом, 5 лет переживает от 5 до 30% пациентов. Появление отдаленных метастазов резко ухудшает прогноз при раке почки. 5-летняя выживаемость больных диссеминированным раком почки составляет 14,6%, что достоверно меньше, чем в группе пациентов с локализованной опухолью (57,3%) (р = 0,00001) (Велиев Е.И. и др., 2005). При наличии отдаленных метастазов стадия Т почечно-клеточного рака прогностического значения не имеет. Большая продолжительность жизни при диссеминированном почечно-клеточным раком наблюдается при метахронном появлении метастазов и солитарных опухолевых очагах, локализующихся в одном органе (Фигуркин К.М. и др., 1998; Носов Д.А. и др., 2005; Русаков И.Г. и др., 2006; Kanamaru H. et al., 1997).
Морфоденситофотометрический и морфометрический методы исследования с применением компьютерного анализатора изображений
Исследование плоидности и площади ядра. Для определения плоид-ности после стандартной гистологической проводки депарафинизированные срезы толщиной 4 мкм окрашивали методом Фельгена с использованием холодного гидролиза в течении 1 часа 30 минут. Далее заключали под покровное стекло, используя в качестве прозрачной среды BioMountStandart.
Содержание ДНК в ядрах клеток определяли на компьютерном анализаторе изображений, состоящем из микроскопа Leica DNM, цифровой видеокамеры Leica EC3 (план объектив 100 х / 0,65, светофильтр 570 нм), морфо-метрической программы ВидеоТест Морфология 5.2, и выражали в единицах плоидности (с). Условия освещения и пороги яркости измеряемых объектов (0 – 250 ед) были одинаковыми для всех измерений. В каждом препарате определяли содержание ДНК в ядрах 25 – 30 интерфазных клеток, а также в ядрах 25 малых тканевых лимфоцитов в этом же срезе. Среднее содержание ДНК в ядре лимфоцита принимали за диплоидное значение (2с).
Для плоидометрических и морфометрических измерений микропрепараты фотографировали цифровым фотоаппаратом при увеличении х 1000 под масляной иммерсией и сохраняли снимок в формате JPG. Далее с помощью инструмента Выделение в программе Adobe Photoshop 6.0. выделяли интересующие ядра и с помощью инструмента Move области выделения переносили на отдельный чистый лист в целях избежания артефактов. Морфометрию обработанных фотоизображений проводили с помощью программы ВидеоТест-Морфология 5.2. Морфометрические параметры определяли с помощью методики «распределение по параметру» в автоматическом режиме (рис. 3, 4, 5). где S – площадь, a, b – боль шая и малая оси эллипса. Характеризует близость объекта к эллипсу, у эллипса Fe = 1; - фактор удлиненности ядра (отн. ед.) (отношение габаритной длины ядра к габаритной ширине ядра). При анализе прогностического значения морфометрических и плоидо-метрических параметров за «критическую точку», позволяющую разделить больных на группы, принималось медианное значение соответствующего показателя.
С целью дополнительной оценки сочетанных изменений фактора удлиненности и площади ядра опухолевых клеток все пациенты были разделены на две группы: 1) больные, у которых среднее значение хотя бы одного из данных показателей было меньше пограничного (медианного) значения; 2) пациенты, у которых средние значения обоих показателей превышали соответствующие пограничные уровни.
При плоидометрическом исследовании высчитывали индекс накопления ДНК (ИНДНК), равный среднему взвешенному показателю ДНК исследуемых клеток. В целях изучения распределения популяций опухолевых клеток по ИНДНК строили гистограммы гетерогенности опухолевых клонов. Гистограммы были разделены на 4 типа согласно модифицированной классификации Nenning H. и соавт. (1997). I тип гистограмм включал парадиплоидные и диплоидные клетки, с единственным пиком в области триплоидных клеток и небольшим числом тетраплоидных клеток (4с) (гомогенно диплоидный тип) (рис. 6); II тип содержал все типы клеток входящий в I тип, с вовлечением не большого числа клонов с ИНДНК 5с и 6с (слабо выраженный гетерогенный тип) (рис. 7);
Гистограмма I типа (гомогенно диплоидный тип). По оси абсцисс – проценты; по оси ординат – ИНДНК. III тип отличался наиболее широкой гетерогенностью и включал все клоны от 2с до 15с (выраженный гетерогенный тип) (рис. 8); IV тип состоял только из пиков полиплоидных и анеуплоидных клонов клеток с ИНДНК от 6с до 15с (гомогенно анеуплоидный тип) (рис. 9). Рис. 7. Гистограмма II типа. По оси абсцисс – проценты; по оси ординат – ИНДНК. Рис. 8. Гистограмма III типа (гетерогенный тип). По оси абсцисс – проценты; по оси ординат – ИНДНК. Рис. 9. Гистограмма IV типа (гомогенно анеуплоидный тип). По оси абсцисс – проценты; по оси ординат – ИНДНК. 2.2.4. Статистические методы исследования
Все данные, полученные в исследовании, статистически обрабатывали. Вычисляли медиану, среднюю арифметическую (М) и ошибку средней арифметической (m). При нормальном распределении данных применяли методы параметрической статистики (test Стьюдента), если данные не соответствовали нормальному распределению, использовали U-тест Манна – Уитни и тест Колмогорова – Смирнова. Коррелятивные взаимоотношения оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Данные считали достоверными при p 0,05.
Сведения о выживаемости послеоперационных пациентов были взяты из «Канцер-регистра» Алтайского края. Выживаемость рассчитывали двумя способами – по Мерабишвили В.М. (2006) и Cutler S., Ederer F. (1958):
1. Прямым способом. Для пациентов через 5 лет после произведенной нефрэктомии. Использовали прикладной пакет программы Microsoft Office Exсel. Производили вычисления, соответствующие расчетам наблюдаемой выживаемости в % (отношение числа больных, переживших контрольный срок, к числу больных, взятых под наблюдение).
2. Актуриальным способом. При этом создавали базу данных с использованием прикладной программы Statistica 6.0. После создания базы данных определяли общую выживаемость по Каплан-Мейеру с определением кумулятивной доли выживших, где время выживания оценивалось по дням. Достоверность различий показателей выживаемости оценивали с помощью логарифмического рангового критерия (log-rank test).
Плоидометрическая и морфометрическая характеристика ядер клеток почечно-клеточного рака
Нами проведен патоморфологический анализ характера плоидности опухолевых клеток ПКР с учетом пола, возраста, гистологической формы, клинической стадии заболевания, степени ядерной атипии по S.A. Fuhrman, размера опухоли и наличия регионарных и отдаленных метастазов.
Проанализирован характер изменений ИНДНК и тип гистограмм опухолевых клеток в зависимости от пола больных. Среднее значение ИНДНК у мужчин составило 5,3с±0,07, у женщин – 4,5с±0,06 (p = 0,0000001). При рассмотрении типов гистограмм ИНДНК, у мужчин выявлено уменьшение процента гистограмм I типа (гомогенно диплоидного) и увеличение IV типа (гомогенно анеуплоидного) (табл. 13).
Характеристика плоидности клеток ПКР в зависимости от пола больных Пол Среднее значение ИНДНК (с) Типы гистограмм (%) I II III IV Мужчины 5,3±0,1 27,3 21,8 21,8 29,1 Женщины 4,5±0,1 46,7 20 21,7 16,7 Примечание: – p 0,05. Таким образом, обнаружены достоверные различия между мужчинами и женщинами по ИНДНК и типам гистограмм распределения данного параметра. При анализе плоидности в зависимости от возраста пациентов выявили, что у больных в возрасте от 30 до 39 лет ИНДНК составил 3,9c±0,1; от 40 до 49 лет – 5,0c±0,2; от 50 до 59 лет – 5,0c±0,1; от 60 до 69 лет – 5,1c±0,1 и от 70 до 79 лет – 4,2c±0,1. При рассмотрении типов гистограмм ИНДНК, в возрастной группе от 30 до 39 лет выявлен наименьший процент гистограмм I типа (гомогенно диплоидного), отсутствие IV типа (гомогенно анеуплоидного) и значительное число гетерогенных гистограмм (80%). В то же время в возрастной группе от 70 до 79 лет доля гистограмм IV типа возрастала до 37% (табл. 14).
Таким образом, наиболее высокие показатели ИНДНК наблюдали в возрастной группе больных от 60 до 69 лет, а наиболее низкие в группе от 30 до 39 лет. В старших возрастных группах (60-79 лет) ИНДНК характеризовался высоким процентом гомогенно анеуплоидных гистограмм IV типа.
Анализ уровня плоидности в клетках ПКР в зависимости от клинической стадии опухолевого процесса позволил обнаружить следующие данные: у пациентов с I стадией заболевания среднее значение ИНДНК составило 3,8с±0,05, со II стадией – 5,9с±0,1, с III стадией – 6,35с±0,1 и с IV стадией – 6,95с± 0,2. При рассмотрении типов гистограмм ИНДНК для I клинической стадии был характерен наибольший процент гистограмм I типа (гомогенно диплоидного) и наименьший процент гистограмм IV типа (гомогенно ане-уплоидного), для IV клинической стадии было характерно отсутствие гистограмм I типа и наибольший процент гистограмм IV типа (рис. 12, табл. 15).
Уровень ИНДНК в опухолевых клетках с зависимости от клинической стадии опухолевого процесса: а – I стадия; б – II стадия; в – III стадия; г – IV стадия. Окраска на ДНК по Фельгену.
В зависимости от гистологического варианта ПКР наибольшее среднее значение ИНДНК было обнаружено в веретеноклеточной карциноме (8,4с±0,1). Промежуточное положение занимали зернистоклеточный (6,1с±0,1) светлоклеточный (4,5с±0,1) и нейроэндокринный рак (5,1с±0,2) Наименьшее значение ИНДНК имели светлоклеточный (4,5с±0,1) и папиллярный рак (4,1с±0,1). При рассмотрении типов гистограмм ИНДНК обнаружено, что для папиллярного рака был характерен наибольший процент (66,7%) гистограмм II и III типа (гетерогенных), а гистограммы IV типа (гомогенно анеуплоидные) отсутствовали. В то же время для зернистоклеточного варианта ПКР и верете-ноклеточного рака возрастал процент гистограмм IV типа (гомогенно ане-уплоидных) до 35,8% и 66,7% соответственно (табл. 16).
Таким образом, наибольшие показатели ИНДНК и числа гомогенно анеуплоидных гистограмм отмечали при зернистоклеточном и веретенокле-точном варианте рака, а наименьшее значение – при папиллярном раке.
При анализе взаимосвязи уровня ИНДНК и степени ядерной атипии по Fuhrman обнаружено, что с нарастанием последней средние значения ИНДНК увеличивались от 2,8с±0,02 при GI до 8,0с±0,1 при GIV (табл. 17). При этом для опухолей со степенью анаплазии GI был характерен наибольший процент гистограмм I типа (гомогенно диплоидного), а гистограммы III и IV типа отсутствовали, в то время как для карцином со степенью анаплазии GIII-GIV наиболее характерными были гистограммы III и IV типов.
Таким образом, при степени анаплазии карцином GIII и GIV отмечали увеличение ИНДНК и возрастание числа выраженно гетерогенных и гомогенно анеуплоидных гистограмм по сравнению с более легкими степенями анаплазии. Таблица 17. Характеристика плоидности клеток ПКР в зависимости от степени ана-плазии карцином
При изучении ИНДНК в зависимости от размера опухоли выявлено, что при размере опухолевого узла 7,0 см (медианное значение) ИНДНК составлял 3,9с±0,05, а при размере 7,0 см ИНДНК достоверно увеличивался до 6,4с±0,1 (p = 0,000005). Гистограмма, характеризующая распределение опухолевых клеток по уровню ИНДНК, показала увеличение клонов клеток с большими значениями ИНДНК в опухолях размером 7,0 см (рис. 13).
Взаимосвязь диаметра ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими параметрами почечно-клеточного рака
При корреляционном анализе обнаружены сильные и умеренные положительные взаимосвязи ИНДНК в ядрах опухолевых клеток с градацией опухоли по Фурману (r = 0,90, p = 0,001), стадией опухоли по TNM (r = 0,57, p = 0,0001), инвазией опухоли в жировую клетчатку (r = 0,51, p = 0,0001), размером опухоли (r = 0,53, p = 0,0001), наличием метастазов (r = 0,51, p = 0,0001) и наличием некроза в опухоли (r = 0,52, p = 0,0001). Не найдено корреляций с полом (r = -0,17, p = 0,66), возрастом пациентов (r = -0,04, p = 0,6), гистологическим типом опухоли (r = 0,13, p = 0,16), степенью выраженности склероза в опухоли (r = -0,02, p = 0,8) (табл. 56).
При корреляционном анализе обнаружены сильные и умеренные положительные взаимосвязи типов гистограмм распределения ИНДНК в ядрах опухолевых клеток с градацией опухоли по Фурману (r = 0,91, p = 0,001), стадией опухоли по TNM (r = 0,55, p = 0,0001), инвазией опухоли в жировую клетчатку (r = 0,49, p = 0,0001), размером опухоли (r = 0,53, p = 0,0001), наличием метастазов (r = 0,45, p = 0,0001) и наличием некроза в опухоли (r = 0,49, p = 0,0001). Не найдено корреляций с полом (r = -0,17, p = 0,07), возрастом пациентов (r = -0,02, p = 0,8), гистологическим типом опухоли (r = 0,11, p = 0,2), степенью выраженности склероза в опухоли (r = -0,09, p = 0,3) (табл. 57).
Корреляционные взаимосвязи гистограмм распределения ИНДНК опухолевых клетках с некоторыми клинико-морфологическими факторами прогноза
При корреляционном анализе обнаружены сильные и умеренные положительные взаимосвязи площади ядер опухолевых клеток с градацией опухоли по Фурману (r = 0,86, p = 0,001), стадией опухоли по TNM (r = 0,62, p = 0,0001), инвазией опухоли в жировую клетчатку (r = 0,60, p = 0,0001), размером опухоли (r = 0,58, p = 0,0001), наличием метастазов (r = 0,61, p = 0,0001) и наличием некроза в опухоли (r = 0,5, p = 0,0001). Не найдено корреляций c полом (r = -0,17, p = 0,61), возрастом пациентов (r = 0,07, p = 0,47), гистологическим типом опухоли (r = 0,11, p = 0,21) (табл. 58).
При корреляционном анализе обнаружены сильные и умеренные положительные взаимосвязи периметра ядра опухолевых клеток с градацией опухоли по Фурману (r = 0,90, p = 0,001), стадией опухоли по TNM (r = 0,62, p = 0,0001), инвазией опухоли в жировую клетчатку (r = 0,60, p = 0,0001), размером опухоли (r = 0,59, p = 0,0001), наличием метастазов (r = 0,61, p = 0,0001) и наличием некроза в опухоли (r = 0,49, p = 0,0001). Не найдено корреляций с полом (r = -0,18, p = 0,06), возрастом пациентов (r = 0,07, p = 0,47), гистологическим типом опухоли (r = 0,10, p = 0,27) и степенью склероза в опухоли (r = – 0,07, p = 0,45) (табл. 59). Таблица 59. Корреляционные взаимосвязи периметра ядра опухолевых клеток с некоторыми клинико-морфологическими факторами прогноза
При корреляционном анализе обнаружены сильные и умеренные положительные взаимосвязи диаметра ядра опухолевых клеток с градацией опухоли по Фурману (r = 0,79, p = 0,001), стадией опухоли по TNM (r = 0,56, p = 0,0001), инвазией опухоли в жировую клетчатку (r = 0,56, p = 0,0001), размером опухоли (r = 0,52, p = 0,0001), наличием метастазов (r = 0,57, p = 0,0001) и наличием некроза в опухоли (r = 0,45, p = 0,0001). Не найдено корреляций c полом (r = -0,16, p = 0,08), возрастом пациентов (r = -0,05, p = 0,62), гистологическим типом опухоли (r = 0,14, p = 0,14) (табл. 60).
Таблица 60. Корреляционные взаимосвязи диаметра ядра опухолевых клеток с некоторыми клинико-морфологическими факторами прогноза Клинико-морфологические и молекулярные параметры Коэффициент корреляции (r) p Пол пациентов -0,16 0,08 Возраст пациентов -0,05 0,62 Степень анаплазии опухоли по Fuhrman 0,79 0,001 Стадия опухоли по TNM 0,56 0,0001 Размер опухоли 0,52 0,0001 Наличие метастазов 0,57 0,0001 Инвазия в жировую клетчатку 0,56 0,0001 Степень склероза в опухоли -0,09 0,34 Наличие некроза в опухоли 0,45 0,0001 Гистологический тип опухоли 0,14 0,14 5.1.6. Взаимосвязи фактора круга ядра опухолевых клеток с клинико-морфологическими факторами прогноза почечно-клеточного рака При корреляционном анализе обнаружены умеренные и слабые обратные взаимосвязи фактора круга ядра опухолевых клеток с градацией опухоли по Фурману (r = -0,37, p = 0,001), инвазией опухоли в жировую клетчатку (r = -0,28, p = 0,003), размером опухоли (r = -0,26, p = 0,004), наличием метастазов (r = -0,41, p = 0,0001). Не найдено корреляций cо стадией опухоли по TNM (r = -0,04, p = 0,7), полом (r = 0,07, p = 0,4), возрастом пациентов (r = 0,08, p = 0,35), гистологическим типом опухоли (r = -0,02, p = 0,81) и наличием некроза в опухоли (r = -0,04, p = 0,6) (табл. 61).