Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ 1. Обзор литературы 17
1.1. Современные представления о структурно функциональной организации тимуса и гуморальной регуляции его функциональной активности 17
1.2. Биологическое действие ионизирующего излучения и его эффекты на тимус 35
1.2.1. Ионизирующее излучение и общие механизмы развития его биологических эффектов 35
1.2.2. Влияние ионизирующего излучения на тимус 40
1.3. Современные представления о спинномозговой жидкости и
обоснование возможности применения ксеногенного ликвора... 46
РАЗДЕЛ 2. Материал и методы исследования 68
2.1. Получение спинномозговой жидкости крупного рогатого скота 68
2.2. Схема эксперимента, экспериментальная модель, доза и кратность введения спинномозговой жидкости 70
2.3. Методы и критерии исследования тимуса 74
РАЗДЕЛ 3. Морфофункциональные особенности тимуса крыс разного возраста в норме и при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 78
3.1. Динамика изменения массы тела, абсолютной и относительной массы тимуса крыс разного возраста в норме и при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 78
3.2. Структурно-функциональные особенности тимуса контрольных крыс разного возраста 90
3.3. Структурно-функциональные особенности тимуса крыс разного возраста при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 113
3.3.1. Закономерности морфологических преобразований тимуса крыс периода новорожденности при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 113
3.3.2. Закономерности морфологических преобразований тимуса крыс ювенильного возраста при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 132
3.3.3. Закономерности морфологических преобразований тимуса крыс молодого возраста при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 149
3.3.4. Закономерности морфологических преобразований тимуса крыс предстарческого возраста при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 171
РАЗДЕЛ 4. Морфофункциональные особенности тимуса крыс после однократного облучения без коррекции и при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 190
4.1. Динамика изменения массы тела, абсолютной и относительной массы тимуса крыс после однократного облучения без коррекции и при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 190
4.2. Структурно-функциональные преобразования тимуса крыс после однократного облучения без коррекции 199
4.3. Структурно-функциональные преобразования тимуса крыс после однократного облучения при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости 236
4.3.1. Морфология тимуса крыс после облучения при однократном парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости в большой дозе 236
4.3.2. Морфология тимуса крыс после облучения при многократном парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости в малых дозах 271
РАЗДЕЛ 5. Анализ и обобщение результатов собственных исследований 303
Выводы 339
Практические рекомендации 343
Список условных сокращений и обозначений 344
Список литературы
- Ионизирующее излучение и общие механизмы развития его биологических эффектов
- Схема эксперимента, экспериментальная модель, доза и кратность введения спинномозговой жидкости
- Закономерности морфологических преобразований тимуса крыс периода новорожденности при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости
- Структурно-функциональные преобразования тимуса крыс после однократного облучения без коррекции
Введение к работе
Актуальность проблемы. Тимус является центральным органом
иммуногенеза и играет ключевую роль в формировании клеточного
иммунитета, но при этом в значительной степени подвержен
нейрогуморальному регуляторному воздействию (Сапин М.Р., 1996; Pearse G.,
2006). Возрастающее антропогенное загрязнение окружающей среды вс чаще
приводит к развитию иммунопатологических состояний, затрагивающих, в том
числе, и тимус, структурная организация паренхиматозного и стромально-
сосудистого компонентов которого тесно взаимосвязана со становлением
иммунологической компетентности организма (Старых О.Н., 2002; Митин А.Н.,
2012). В качестве одного из подобных антропогенных факторов следует
рассматривать ионизирующее излучение, оказывающее выраженное негативное
воздействие на тимус. Согласно литературным данным, воздействие
ионизирующего излучения приводит к состоянию иммунологической
супрессии, которое ярко проявляется в структурно-функциональной
перестройке тимуса (Митин А.Н., 2012; Бибик Е.Ю., 2014). Поэтому проблема изучения адаптации и восстановления органов иммунной системы на фоне повреждающего действия ионизирующего излучения остается актуальной и на сегодняшний день (Бутомо Н. В., 2004). В соответствии с этим, в практическом здравоохранении и ветеринарии продолжает существовать потребность в новых высокоэффективных и безопасных методах защиты от гамма-облучения / нивелирования его негативных последствий (Ильюченок Т.Ю., 1980). Вопросы морфологических преобразований центральных и периферических органов иммуногенеза, в том числе и тимуса, в норме (Сапин М. Р., 1996; Ярилин А.А., 1999; Pearse G., 2006; Мороз Г.А., 2009) и после воздействия ионизирующего излучения (Ярилин А. А., 1991; Мотуляк А.П., 2007; Митин А.Н., 2012) достаточно широко освещены в литературе. У различных экспериментальных животных продемонстрирована динамика структурных перестроек тимуса в ответ на действие различных видов и доз ионизирующего излучения, в том числе при использовании общего и локального облучения (Григоренко Д.Е., 2000; Park H. S. et al., 2006; H. Ohi et al., 2007; J. Li et al., 2012). Вместе с тем, доступные в литературе данные не позволяют точно предсказать динамику гистопатологических реакций в тимусе при подведении определенной дозы облучения в рамках конкретной экспериментальной модели. Одним из наименее изученных вопросов в данной области следует считать динамику изменения экспрессии различных иммуногистохимических маркеров.
С другой стороны, вопросы морфогенеза тимуса в условиях воздействия экзогенных факторов затрагивают фундаментальные проблемы взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем организма, что ставит перед исследователями задачу выяснения механизмов надсистемной регуляции и методов влияния на нее (Бадалян Л.О., 1982; Blalock J. E., 1989; Weigent D.A., 1990; Акмаев И. Г., 1997; Weigent D. A., 1995; Petrovsky N., 2001; Webster J. I., 2002; Jara L.J., et al., 2006). В этой связи наиболее перспективными являются подходы, основанные на изучении естественных процессов в организме, и поиск средств природного происхождения, способных оказывать влияние на различные уровни регуляции. Подобные средства, как правило, обладают
высокой эффективностью и хорошим профилем безопасности при достаточно широкой области применения.
С этой точки зрения, спинномозговая жидкость (СМЖ) является уникальным субстратом для получения биогенного препарата. Следует отметить, что физиологическая роль СМЖ – одной из важнейших гуморальных сред организма, остается недостаточно изученной. Данные, указывающие на наличие тесной взаимосвязи между интерстициальной жидкостью и ликвором (Bradbury M. W. B., 1985), а также на наличие специальных каналов для циркуляции жидкости в паренхиме головного мозга по аналогии с лимфатическими капиллярами (Aspelund A. A. et al., 2015; Louveau A. et al., 2015), позволяют рассматривать СМЖ в качестве транспортно-регуляторного звена сложной системы нейрогуморальных реакций.
Объединение двух актуальных проблем – определения механизмов
межсистемного взаимодействия и изучения физиологической роли СМЖ в
качестве гуморальной среды, обладающей регуляторным потенциалом, –
наталкивает на мысль о теоретической возможности изучения
фундаментальных вопросов влияния нейроэндокринных сигналов на функциональное состояние иммунной системы посредством "переноса" субстрата, обладающего определенной активностью, из одного организма в другой. Параллельно с этим возможно исследование перспектив использования СМЖ в качестве лекарственного сырья путем определения возможного профиля безопасности и изучения спектра оказываемых эффектов на органы-мишени на экспериментальных моделях.
Началом научного направления, посвященного изучению биологических свойств СМЖ и возможных сфер ее применения, следует считать первую половину XX века, когда были предприняты попытки использовать ауто-, алло-или гетероликворотрансфузии на различных клинико-экспериментальных моделях (Атанова Е. М., 1954; Фридман А. П., 1971; Куприянов С. Н., 1976; Ткач В. В. и др., 1983; Melrose P., 1984). Использование ксеногенного ликвора оказалось наиболее предпочтительным ввиду ряда факторов, среди которых: обширная сырьевая база, удобство получения и хранения нативной СМЖ, близость физико-химического состава ликвора крупного рогатого скота и человека, отсутствие биоэтических проблем, связанных с использованием человеческого материала, а также отсутствие межвидовой и индивидуальной непереносимости (Фридман А. П., 1971). Помимо этого, подход с использованием ксеногенной СМЖ позволяет широко использовать различные модели на лабораторных животных, экстраполируя полученные данные на человека.
Новый толчок в развитии данного направления дал цикл
экспериментальных работ, проведенных под руководством профессора В. В. Ткача (Ткач В.В. и др., 1995), а в последующем – под руководством профессора В. С. Пикалюка (Пикалюк В.С., 2013). Был изучен целый спектр эффектов парентерального введения ксеногенной СМЖ на различные органы и ткани, в том числе и на органы нервной, эндокринной и иммунной систем (Пикалюк В.С., 2010; Шаймарданова Л. Р., 2011; Киселев В.В., 2012; Бессалова Е. Ю., 2013; Гасанова И.Х., 2013; Макалиш Т. П., 2013; Кривенцов М.А., 2014).
Накопленный к настоящему моменту фактический экспериментальный материал нуждается в систематизации и создании единой концепции регуляторного воздействия ликвора. Вместе с тем, большинство полученных данных касается особенностей морфологических преобразований различных органов при введении ксеногенного ликвора интактным животным (Ткач В. В. и др., 1983; Пикалюк В.С., 2010), тогда как лишь единичные исследования демонстрируют эффекты СМЖ в условиях экспериментальной патологии (Топало В. Г., 1986; Киселев В. В., 2008; Абсеттарова А. И., 2014; Беляева Е. А., 2014; Кривенцов М.А., 2015).
Таким образом, прикладные проблемы радиобиологии, связанные с изучением реакции тимуса на воздействие ионизирующего излучения и поиском новых субстратов для коррекции его негативных последствий, а также фундаментальные вопросы выяснения механизмов межсистемной интеграции указывают на актуальность установления закономерностей морфологических преобразований тимуса после облучения при введении ксеногенной спинномозговой жидкости.
Цель исследования – установить онтогенетические закономерности и особенности морфологических преобразований тимуса под воздействием тотального облучения в сублетальной дозе и на фоне введения ксеногенной спинномозговой жидкости.
Задачи исследования:
-
Изучить онтогенетические особенности морфологии тимуса у крыс периода новорожденности, ювенильного, зрелого и предстарческого возрастов.
-
Определить возрастные закономерности структурно-функциональных преобразований тимуса при многократном парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости.
-
Установить динамику структурных преобразований тимуса после однократного тотального воздействия ионизирующего излучения в сублетальной дозе.
-
Выявить особенности структурной организации тимуса после облучения при однократном введении ксеногенной спинномозговой жидкости в большой дозе (10 мл/кг).
-
Выявить особенности структурной организации тимуса после облучения при многократном введении ксеногенной спинномозговой жидкости в малых дозах (2 мл/кг).
-
Провести сравнительный анализ и выявить закономерности морфологических изменений гисто- и цитоархитектоники тимуса на фоне различных схем применения ксеногенной спинномозговой жидкости в постлучевом периоде.
Научная новизна исследования. Впервые в экспериментальном
исследовании установлены онтогенетические закономерности
морфологических преобразований тимуса крыс на органном, тканевом, клеточном и субклеточном уровнях организации при многократном парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости.
Впервые в рамках интегративного анализа, включающего
органометрический, гистологический, гисто-, цитоморфометрический,
иммуногистохимический и ультрамикроскопический методы исследования,
установлены особенности реакции стромально-сосудистого и
паренхиматозного компонентов тимуса в различные сроки экспериментальной модели однократного тотального воздействия фотонного ионизирующего излучения в сублетальной дозе 5 Гр. Прослежены закономерности преобразований гисто- и цитоархитектоники тимуса, а также динамика пролиферативной и макрофагальной активности по данным уровня экспрессии маркеров Ki-67 и CD68.
Впервые в комплексном экспериментальном исследовании использовали
ксеногенную спинномозговую жидкость с целью коррекции негативных
последствий лучевого поражения тимуса, проведен сравнительный анализ
эффективности двух схем применения ксеногенного ликвора для
нивелирования гистопатологических преобразований тимуса в постлучевом периоде – однократно в большой дозе (10 мл/кг) и многократно в малых дозах (2 мл/кг). На основании полученных данных представлена морфологическая оценка регуляторного потенциала ксеногенной спинномозговой жидкости в контексте восстановления гистоархитектоники и клеточной популяции тимуса.
Сформулированная на основании полученных собственных
экспериментальных данных и обобщения данных литературы концепция роли спинномозговой жидкости в качестве транспортно-регуляторного звена в нейрогуморальной регуляции и интеграции нервной, эндокринной и иммунной систем организма является также приоритетной.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты,
полученные в данном анатомо-экспериментальном исследовании, в
значительной степени расширяют имеющиеся представления о морфогенезе тимуса в онтогенетическом аспекте и его структурно-функциональных преобразованиях после однократного воздействия фотонного ионизирующего излучения в сублетальной дозе.
Представленные материалы формулируют представление о
закономерностях биологических эффектов парентерального введения
ксеногенной спинномозговой жидкости на тимус в норме и после облучения, позволяя оценить регуляторный потенциал ликвора и перспективы его применения в качестве средства для коррекции негативных последствий воздействия ионизирующего излучения. Полученные данные морфологически обосновывают наличие у ксеногенного ликвора иммуностимулирующего эффекта для интактных крыс молодого и предстарческого возраста, а также для ювенильных крыс в постлучевом периоде эксперимента.
Сформулированная концепция регуляторного воздействия
спинномозговой жидкости и оценка ее роли в межсистемной интеграции открывает перспективы дальнейших исследований в ликворологии с возможностью использования ксеногенной спинномозговой жидкости в качестве сырья для высокоэффективного и безопасного иммунотропного препарата для здравоохранения и ветеринарии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Тимус в постнатальном онтогенезе претерпевает изменения, характеризующиеся признаками возрастной инволюции, начиная у крыс молодого возраста и приобретая наибольшую выраженность у крыс предстарческого возраста.
-
Структурно-функциональные преобразования в тимусе на фоне многократного введения ксеногенного ликвора имеют четкую зависимость от возраста крыс и характеризуются: у крыс периода новорожденности – явлениями акцидентальной инволюции, а у крыс молодого и предстарческого возраста – замедлением возрастной инволюции.
-
Морфофункциональные преобразования тимуса крыс после однократного воздействия ионизирующего излучения в сублетальной дозе 5 Гр носят ярко выраженный характер. Пик морфологических изменений деструктивного характера в постлучевом периоде приходится на 3-и сутки эксперимента и характеризуется инверсией слоев тимуса, выраженной реакцией сосудов микроциркуляторного русла с отеком интерстициального пространства, значительным снижением плотности и изменением состава клеточной популяции, разнонаправленными изменениями пролиферативной и макрофагальной активности в различных структурно-функциональных зонах тимуса.
-
Морфологическая картина тимуса на 7-е, 14-е и 30-е сутки после облучения характеризуется все еще имеющими место деструктивно-дистрофическими изменениями и процессами восстановления гисто- и цитоархитектоники тимуса. Динамика репарации тимуса в постлучевом периоде носит двухволновой характер со спадом на 14-е сутки после облучения, что подтверждается данными гистологического, гисто-, цитоморфометрического и иммуногистохимического методов исследования. К 30-м суткам эксперимента восстановление гисто- и цитоархитектоники тимуса носит неполный характер.
-
Однократное парентеральное введение ксеногенной спинномозговой жидкости в большой дозе на 3-и сутки после облучения приводит к выраженной супрессии иммунопоэза в тимусе. В последующие сроки наблюдения структурно-функциональные преобразования тимуса носят репаративный характер с отсутствием двухволновой кинетики. Эффект однократного парентерального введения ликвора в большой дозе на морфологию облученного тимуса крыс является чрезмерным и кратковременным.
-
Многократное парентеральное введение ксеногенной спинномозговой жидкости в малых дозах оказывает стимулирующее воздействие на процессы пролиферации и дифференцировки в облученном тимусе во все сроки наблюдения, ускоряя процесс постлучевого восстановления его гисто- и цитоархитектоники.
Апробация результатов. Основные результаты, научные положения и
выводы данного анатомо-экспериментального исследования апробированы на:
85-й международной научно-практической конференции студентов и молодых
ученых "Теоретические и практические аспекты современной медицины"
(Симферополь, 2013), IV Всеукраинском симпозиуме с участием
международных специалистов "Морфогенез органов и тканей под влиянием
экзогенных факторов", посвященном 140-летию со дня рождения основателя
Крымской морфологической школы Р. И. Гельвига (Симферополь–Алушта,
2013), 86-й международной научно-практической конференции студентов и
молодых ученых "Теоретические и практические аспекты современной
медицины" (Симферополь, 2014), IV Международной научно-практической
конференции "Современные достижения фармацевтической технологии и
биотехнологии" (Харьков, 2014), Международной научной конференции
студентов и молодых учных "Актуальные вопросы современной медицины"
(Харьков, 2014), XVII Всероссийской медико-биологической конференции
молодых исследователей "Фундаментальная наука и клиническая медицина –
человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2014), XVI Всероссийской научной
конференции студентов и молодых ученых с международным участием
"Молодежь и медицинская наука в ХХI веке" (Киров, 2015), VІ Конгрессе
анатомов, гистологов, эмбриологов и топографических анатомов Украины
(Запорожье, 2015), а также на расширенном заседании кафедры нормальной
анатомии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО
"Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского"
(Симферополь, 2015).
Публикации. Основные результаты проведенного анатомо-
экспериментального исследования, научные положения и выводы изложены в 29 научных работах, из которых 11 – в рецензируемых научных журналах и изданиях, входящих в перечень ВАК Российской Федерации (9 без соавторов), раздел в монографии, 2 – патента на полезную модель (Украина) и 15 – в материалах конгрессов, съездов и научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена в соответствии с существующими требованиями ГОСТ Р 7.0.11 – 2011 на 445 страницах компьютерного текста и включает в себя введение, обзор литературы, материал и методы, два раздела результатов собственных исследований, анализ и обобщение результатов собственных исследований, выводы, практические рекомендации, список условных сокращений и обозначений, список литературы и приложения. В диссертационной работе представлено 59 таблиц (включая 22 таблицы в приложениях) и 180 рисунков, из которых 97 – микрофотографии. Список литературы содержит 119 отечественных и 209 иностранных источников.
Ионизирующее излучение и общие механизмы развития его биологических эффектов
Тимус - первичный орган иммуногенеза, который отвечает за продукцию аутотолерантных иммунокомпетентных клеток. Функционально, тимус участвует в формировании и поддержании популяции периферических Т-лимфоцитов, обеспечивая процесс антигеннезависимой дифференцировки костномозговых предшественников Т-лимфоцитов и их созревание [8, 29, 90, 107, 119, 133, 227, 253, 306]. Несмотря на то, что тимус был впервые описан Галеном [276], его функциональное значения оставалось неясным на протяжении многих столетий. Долгое время тимус рассматривали в качестве эндокринного органа или даже в качестве рудимента без какого-либо функционального значения [276]. Иммунологическая функция тимуса была впервые описана в начале 1960-х годов Миллером [124, 177, 233, 243, 280].
Органы представляют собой больше, чем просто сумму их отдельных компонентов. Функциональная компетенция требует, чтобы структурные компоненты органа были представлены не только в определенной пропорции по отношению друг другу, но и были бы функционально организованы для выполнения совместной специфической функции. Тимус - это прекрасный пример взаимосвязи между клеточной организацией и функцией органа. В отличие от других органов, таких как легкие или почки, в тимусе отсутствуют такие структурно-функциональные единицы как ацинусы или нефроны. Учитывая это, клеточные популяции тимуса разнородны и включают в себя развивающиеся Т-лимфоциты или тимоциты, а также многочисленные субпопуляции клеток микроокружения, среди которых эпителиальные (или эпителиоретикулярные) клетки, дендритные клетки, макрофаги, нейроэндокринные клетки, тканевые базофилы, клетки сосудов микроциркулярного русла, а также мезенхимальные клетки [89]. Эти типы клеток составляют многообразное по своему функциональному значению микроокружение, которое ограничивает миграцию лимфоидных клеток-предшественников в области их активной дифференцировки и пролиферации, направляет и поддерживает процесс созревания тимоцитов. Формирование тимуса в эмбриональном периоде и его функционирование в постнатальном онтогенезе обеспечивается автономными клеточными механизмами тимических эпителиоцитов и сложными межклеточными взаимодействиями. На протяжении формирования и периода активного функционирования тимуса эпителиоциты продуцируют факторы роста и дифференцировки, которые необходимы для созревания тимоцитов и экспрессии различных специфичных рецепторов, играющих роль в "позитивной" и "негативной" селекции клеточной популяции [213]. Таким образом, развитие Т-лимфоцитов в тимусе не является автономным клеточным процессом, а требует взаимодействия с тимическим микроокружением, которое формирует сигналы, регулирующие выживание, пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток. Постоянный выход Т-лимфоцитов из тимуса является необходимым условием для оптимального функционирования периферических органов иммуногенеза и напрямую связан с размером тимуса, а также с морфологическими и функциональными характеристиками его клеток микроокружения. При этом в отличие от красного костного мозга в тимусе нет самовозобновляющейся популяции гемопоэтических стволовых клеток, поэтому отсутствует и специфическое для гемопоэтических стволовых клеток микроокружение [124]. Вместе с тем, существуют данные, указывающие на наличие в тимусе одного или нескольких типов тимических эпителиальных клеток-предшественников или стволовых клеток, которые, вероятно, участвуют в восстановлении собственной популяции эпителиоцитов [109, 142].
Особенности строения тимуса и межклеточных взаимодействий в нем тесно связаны с развитием данного органа. У грызунов тимус развивается из эндодермы 3 и 4 глоточных карманов и окружающей мезенхимы [164]. Глоточный карман соединятся с полостью глотки посредством тимофарингеального протока, остатки которого могут быть инкорпорированы в развивающийся тимус, давая начало эпителиальным кистозным структурам. В ходе развития тимус, наряду со щитовидной железой, которая развивается из того же глоточного кармана, мигрирует в каудальном направлении. Данные железы разделяются приблизительно на 15-й день гестации, когда тимус мигрирует в грудную полость. После завершения миграции эпителиальные клетки и развивающиеся сосуды микроциркуляторного русла формируют широкопетлистую сеть. После быстрого заселения тимуса клетками-предшественниками лимфоцитов из развивающихся гемопоэтических органов (у мышей - на 11-12 день гестации) тимус становится лимфоэпителиальным органом. Тимус является первым лимфоидным органом, который формируется и растет сразу после рождения в ответ на постнатальную антигенную стимуляцию и потребность в большом количестве зрелых Т-лимфоцитов. У крыс и мышей тимус достигает максимального размера в период полового созревания, после чего начинается его постепенная возрастная инволюция [20, 42, 76, 129, 130, 189].
Отдельно следует отметить, что клетки микроокружения в тимусе также имеют гетерогенное происхождение. Эпителиоциты коркового и мозгового вещества тимуса имеют эндодермальное происхождение, тогда как дендритные клетки (в основном, в мозговом веществе тимуса и кортико-медуллярной зоне) и макрофаги представляют собой не фагоцитирующие и фагоцитирующие клетки-микроокружения костномозгового происхождения, соответственно [280].
Схема эксперимента, экспериментальная модель, доза и кратность введения спинномозговой жидкости
Как продемонстрировано в таблице и на рисунке выше, выявлено статистически достоверное отклонение практически всех гистоморфометрических показателей тимуса экспериментальных крыс в 119 сравнении с контролем. Общая направленность данных изменений, вне зависимости от срока эксперимента, характеризовалась снижением относительной площади коркового вещества, увеличением относительной площади мозгового вещества и соответствующим снижением значения кортико-медуллярного индекса. При этом степень выраженности указанных преобразований возрастала с увеличением кратности введения СМЖ. Так, на 7-е, 30-е и 90-е сутки эксперимента снижение относительной площади коркового вещества тимуса в сравнении с контролем составляло 9,37%, 17,86% и 18,88%, а уменьшение показателя КМИ - 23,98%, 32,36% и 28,06%, соответственно. Следует отметить, что параллельно с этим отмечали увеличение доли капсулы и междольковых перегородок, достигавшее уровня статистической достоверности на 30-е и 90-е сутки эксперимента (на 49,06 % и 30,74 %, соответственно).
Данные количественной оценки клеточного состава различных структурно-функциональных зон тимуса, также как и в контроле, указывают на преобладание клеток лимфоидного ряда как в корковом, так и в мозговом веществе тимуса. Также, выявили закономерное превышение плотности общей клеточной популяции в субкапсулярной зоне и внутренней зоне коркового вещества в сравнении с мозговым веществом. В субкапсулярной зоне обнаруживали наибольшее количество клеток, находящихся на различных стадиях митотического деления (4,22 ± 0,40 %, 4,56 ± 0,35 % и 3,12 ± 0,26 % на 7-е, 30-е и 90-е сутки эксперимента, соответственно), наряду с высоким процентным количеством клеток с признаками деструкции (16,04 ± 1,23 %, 18,48 ± 1,46 % и 18,30 ± 1,55 % на 7-е, 30-е и 90-е сутки, соответственно) (табл. В.1). Примечательно, что в мозговом веществе подобных клеток было меньше (14,56 ± 1,11 %, 14,30 ± 0,67 % и 16,04 ± 1,36 % на 7-е, 30-е и 90-е сутки эксперимента, соответственно), чем в субкапсулярной зоне или внутренней зоне коркового вещества, что, вероятно, связано, во-первых, с преимущественной локализацией процесса селекции тимоцитов в корковом веществе, а также с большей устойчивостью 120 тимоцитов мозгового вещества к действию различных факторов, включая и факторы эндогенного происхождения (например, глюкокортикоидов). Отклонение данных клеточного состава субкапсулярной зоны коркового вещества, внутренней зоны коркового вещества и мозгового вещества тимуса от контроля представлено на рисунке 3.26, 3.27 и 3.28, соответственно.
Процентное отклонение показателей клеточного состава субкапсулярной зоны коркового вещества тимуса экспериментальных крыс периода новорожденности от контроля. - р 0,05 в сравнении с контролем.
Среди выявленных отклонений от контроля в субкапсулярной зоне тимуса следует отметить однотипные изменения, независящие от срока эксперимента, которые заключались в уменьшении общей плотности клеточной популяции (статистически достоверные отклонения от контроля при значении р 0,05 на 30-е и 90-е сутки эксперимента составляли -23,19 % и -28,64 %, соответственно), увеличение процентного количества клеток с признаками деструкции (на 7-е, 30-е и 90-е сутки эксперимента на 19,61 %, 20,63 % и 22,82 %, соответственно).
Аналогичные отклонения от контроля наблюдали во внутренней зоне коркового вещества и в мозговом веществе тимуса. Начиная с 30-х суток эксперимента, отмечено статистически достоверное уменьшение плотности клеточной популяции (во внутренней зоне коркового вещества - на -29,70 % и -20,49 % на 30-е и 90-е сутки эксперимента, соответственно; в мозговом веществе - на -33,82 % и -40,33 %, соответственно). Помимо этого, как в корковом веществе, так и в мозговом веществе тимуса во все сроки эксперимента отмечено значительное и статистически достоверное уменьшение процентного количества митотически делящихся клеток. Вместе с тем, следует отметить, что большие цифры процентного отклонения от контроля в некоторых случаях обусловлены очень небольшим количеством делящихся клеток на изученных гистологических препаратах, в частности, мозгового вещества тимуса.
Также, во внутренней зоне коркового вещества тимуса на 30-е сутки эксперимента выявили статистически достоверное (р 0,05) увеличение по сравнению с контролем процентного количества клеток микроокружения (на 27,80 %), а также значительное, хоть и не достигающее уровня статистической значимости, аналогичное увеличение данного типа клеток на 7-е сутки эксперимента (на 14,68 %). Эти наблюдения подтверждают увеличение количества фагоцитарно активных клеток, выявленное при проведении описательного гистологического анализа. Более того, вероятна закономерная взаимосвязь между увеличением количества клеток с признаками деструкции и количества макрофагов.
В мозговом веществе, в отличие от других изученных структурно-функциональных зон тимуса, не выявили каких-либо статистически достоверных отклонений от контроля в отношении процентного количества клеток с признаками деструкции, что опять же подтверждает наблюдения описательного гистологического анализа и обосновывается более резистентной популяцией тимоцитов в мозговом веществе. Полученные результаты согласовывались с данными распределения субпопуляций лимфоцитов в зависимости от площади ядра клетки (табл. Г.1). Графическое представление выявленных отклонений от соответствующих контрольных показателей в субкапсулярной зоне, внутренней зоне коркового вещества и в мозговом веществе тимуса представлено на рисунках 3.29, 3.30 и 3.31, соответственно.
Закономерности морфологических преобразований тимуса крыс периода новорожденности при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости
Клеточный состав внутренней зоны коркового вещества на 3-й сутки после облучения был практически идентичен по количественным показателям клеточному составу субкапсулярной зоны, поскольку на данном сроке эксперимента различия между внешней и внутренней корой тимуса полностью стирались и анализ проводили по условной границе. Аналогично этому, на 7-е сутки эксперимента количественные данные лишь незначительно отличались от таковых, полученных в отношении субкапсулярной зоны тимуса. При этом, также как в субкапсулярной зоне, начиная с 7-х суток после облучения, наблюдали постепенное восстановление процентного количества клеток лимфоидного ряда (на 7-е сутки - 47,17 ± 1,85 %; на 14-е сутки - 43,55 ± 2,15 %; на 30-е сутки - 59,74 ± 2,59 %) на фоне уменьшения доли клеток микроокружения и клеток с признаками деструкции.
Наконец, клеточный состав мозгового вещества тимуса на 3-й сутки после облучения был подвержен изменениям в наименьшей степени. Несмотря на это, в данной зоне также существенно снижалась плотность клеточной популяции (до 13,56 ± 0,33 клеток на 1000 мкм ), возрастала доля деструктивно измененных клеточных элементов (40,05 ± 2,12 %), клеток микроокружения (24,12 ± 0,50 %) на фоне падения процентного количества клеток лимфоидного ряда (до 29,79 ± 0,95 %). Особенностью клеточного состава мозгового вещества на 3-й сутки эксперимента было нетипично высокое процентное количество клеток, находящихся в состоянии митотического деления (6,04 ± 0,15 %), чего не наблюдалось ни в субкапсулярной зоне, ни во внутренней зоне коркового вещества. Это указывает на задействование более устойчивой к действию радиации клеточной популяции мозгового вещества в качестве резерва для восстановления утраченного пула клеток. На 7-е, 14-е и 30-е сутки после облучения наблюдали восстановление плотности клеточной популяции за счет увеличения, в первую очередь, доли клеток лимфоидного ряда (до 52,18 ± 1,88 %, 57,02 ± 2,00 % и 64,36 ± 1,96 %, соответственно). Параллельно с этим снижалось процентное количество клеток с признаками деструкции и клеток микроокружения, при сохранении относительно высокой доли клеток в стадии митотического деления вплоть до 30-х суток эксперимента.
В соответствии с кардинальными изменениями клеточного состава тимуса практически на всех сроках эксперимента, за исключением 30-х суток, выявили значительные и статистически достоверные отклонения от необлученного контроля. Так, в субкапсулярной зоне тимуса на 3-й, 7-е и 14-е сутки после облучения плотность клеточной популяции достоверно снижалась в сравнении с 1-й серией опытов на 67,87 %, 26,12 % и 33,60 %, соответственно (во всех случаях, р 0,05) (рис. 4.25), что было обусловлено массовой гибелью и миграцией клеток лимфоидного ряда.
Процентное отклонение показателей клеточного состава субкапсулярной зоны коркового вещества тимуса контрольных крыс 2-й серии опытов от необлученного контроля. - р 0,05 в сравнении с контролем 1-й серии опытов. 222 Это подтверждалось выраженным уменьшением доли лимфоцитов на 82,10 %, 28,02 % и 34,08 %, соответственно (во всех случаях, р 0,05), на фоне значительного возрастания процентного количества клеток с признаками деструкции (на 3-й, 7-е, 14-е сутки - на 389,05 %, 87,23 % и 120,36 %, соответственно [во всех случаях, р 0,05]). Клетки микроокружения, по всей видимости, характеризуются большей устойчивостью к действию ионизирующего излучения, поэтому их процентное количество возрастало на всех сроках эксперимента (на 3-й, 7-е, 14-е сутки - на 47,07 %, 40,49 % и 61,17 % в сравнении с необлученным контролем, соответственно [во всех случаях, р 0,05]). Процентное количество митотически делящихся клеток на 3-й сутки после облучения статистически достоверно снижалось по отношению к 1-й серии опытов на 57,09 % (р 0,05), а на 7-е сутки эксперимента - наоборот, возрастало на 43,51 % (р 0,05), что отражает переход от фазы деструкции к фазе первичного восстановления клеточной популяции. Аналогичная тенденция перераспределения клеточной популяции наблюдалась и во внутренней зоне коркового вещества (рис. 4.26) На 3-й, 7-е и 14-е сутки после облучения плотность клеточной популяции снижалась в сравнении с необлученным контролем на 78,80 %, 26,64 % и 39,62 %, соответственно (во всех случаях, р 0,05). На всех сроках эксперимента выявили разнонаправленные отклонения от необлученного контроля доли клеток лимфоидного ряда и клеток микроокружения: процентное количество лимфоцитов на 3-й, 7-е, 14-е и 30-е сутки после облучения снижалось на 79,65 %, 35,70 %, 40,64 % и 18,57 %, соответственно; доля клеток микроокружения в аналогичные сроки эксперимента возрастала на 135,17 %, 45,62 %, 44,31 % и 20,34 %, соответственно (во всех случаях, р 0,05). Отличительной особенностью данной зоны тимуса было сохранение статистически достоверного увеличения доли клеток с признаками деструкции и возрастания процентного количества клеток, находящихся на стадии митотического деления, вплоть до 30-х суток после облучения. Это 223 указывает на то, что внутренняя зона коркового вещества, начиная с 7-х суток, берет на себя часть пролиферативной активности, направленной на восполнение утраченной популяции тимоцитов.
Структурно-функциональные преобразования тимуса крыс после однократного облучения без коррекции
В настоящее время концепция регуляторной функции спинномозговой жидкости (СМЖ) как таковая не сформирована, хотя в отечественной и зарубежной литературе имеется множество указаний на ее трофическую, метаболическую, транспортную, выделительную и защитную роль в нормальном функционировании центральной нервной системы (ЦНС) [199, 275, 311]. Будучи отделенной от системного кровотока полунепроницаемым с биохимической и иммунологической точки зрения гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), ликвор находится в тесной взаимосвязи со всеми структурами головного мозга и, в особенности, с перивентрикулярными образованиями, которые, зачастую, выполняют важную эндокринную или нейрогуморальную регуляцию как когнитивных, так и соматических функций [149, 159, 232, 235]. Открытие в ЦНС т.н. "глимфатической" системы [128, 223] предполагает ещё более тесное взаимодействие между интерстициальной жидкостью головного мозга и ликвором, являющимся гуморальной средой, циркулирующей по желудочкам мозга, субарахноидальному и периневральным пространствам [108, 110, 173, 199].
В этой связи, перед фундаментальной медицинской наукой встает актуальный вопрос: какова роль спинномозговой жидкости в качестве неотъемлемого звена в транспортно-регуляторной системе ЦНС в обеспечении аутокринных, паракринных и дистантных регуляторных воздействий? Безусловно, рассматривать СМЖ в качестве автономной и самоорганизующейся регуляторной системы нельзя - весь спектр биологически активных веществ (БАВ), содержащийся в ликворе, попадает в него из перивентрикулярных органов, интерстициальной жидкости головного и спинного мозга, центральных и периферических органов эндокринной системы [6, 28, 41, 46, 67, 110, 148, 151, 229]. Более того, сам состав и регуляторный потенциал СМЖ в полной мере зависит от функционального состояния ЦНС и организма в целом - от состояния тех основных и общепризнанных регуляторных систем, которые обеспечивают надсистемную интеграцию [137, 138, 158, 195, 199]. Вместе с тем, вопрос того, модулирует ли СМЖ регуляторное воздействие и можно ли перенести данные эффекты в организм реципиента с ликвором, остается открытым. Парентеральное введение СМЖ в организм реципиента в норме и при различных экспериментальных патологических состояниях представляет интерес не только с точки зрения выяснения непосредственных эффектов на те или иные органы и системы с перспективой дальнейшего использования гуморальной среды ЦНС в качестве лекарственного сырья, но и с точки зрения обоснования физиологической роли ликвора в самом организме.
Как указывалось ранее, предпосылкой к началу использования ксеногенной СМЖ в качестве корригирующего средства послужил ряд клинико-экспериментальных исследований, в которых была продемонстрирована активность ликвора, как in vitro, так и in vivo [5, 93, 108, 168]. Подобная активность ликвора обусловлена наличием в нем широкого спектра биологически активных веществ центрального и периферического происхождения, являющихся действующим началом каскада физиологических реакций различной направленности [110, 274, 309].
Более того, в многочисленных экспериментальных исследованиях с использованием ксеногенной СМЖ была продемонстрирована ее малая антигенность и отсутствие каких-либо реакций сенсибилизации на однократное или многократное введение. Подобный феномен, вероятно, обусловлен низким уровнем содержания белка, наличием в составе ликвора протеолитических ферментов и способом консервации (сверхбыстрое замораживание в жидком азоте при температуре -196С) [194, 208].
Помимо этого необходимо отметить и перспективу получения лекарственного сырья, обладающего различными свойствами, обусловленными состоянием донора (беременность, лактация, сезонность и т.д.), а также удобство получения, хранения и обработки ксеногенной СМЖ и ее обширную сырьевую базу [32, 33]. С другой стороны, существуют и факторы, представляющие собой теоретические ограничения использования ксеногенного ликвора, как в целом, так и применительно к данному экспериментальному исследованию. Из факторов, которые относятся к подобному использованию ксеногенной СМЖ, что является, по сути, межвидовой трансплантацией, следует отнести отсутствие окончательного определения иммуногенности ликвора, а также парентеральное (внутримышечное) введение ликвора, т.е. в неестественный для него бассейн циркуляции.
Учитывая это, на этапе планирования экспериментальная часть исследования была разделена на два блока, в рамках которых преследовали различные цели. В 1-м блоке целью являлось, по сути, изучение вопросов безопасности парентерального введения ксеногенной СМЖ на основании оценки морфологических преобразований тимуса у крыс различных возрастных групп, в том числе, и при длительном многократном введении ликвора (вплоть до 90 суток). Во 2-м блоке эксперимента изучали уже эффекты различных схем применения ксеногенного ликвора на конкретной экспериментальной модели с сублетальным облучением. Подобные этапы в проведении комплексного морфологического исследования использовали в силу необходимости четкого разграничения особенностей действия СМЖ в качестве субстрата на организм и, в частности, тимус в нормальных условиях и при патологических изменениях. С этой точки зрения, в контексте регуляторной роли СМЖ, проведенное экспериментальное исследование, посвященное установлению закономерностей структурно-функциональных преобразований тимуса при парентеральном введении ксеногенного ликвора, предоставляет данные особенностей и возможных механизмов воздействия ликвора на центральный орган иммуногенеза в норме и в условиях постлучевой иммуносупрессии.