Содержание к диссертации
Введение
Раздел 1. Обзор литературы 19
1.1. Современные представления о функциональной морфологии и энергетическом балансе сократительного кардиомиоцита 19
1.2. Морфофункциональные особенности кардиомиоцитов в условиях гипоксии 25
1.2.1. Особенности развития митохондриальной дисфункции и ее роль в активации апоптоза кардиомиоцитов при гипоксических состояниях 33
1.2.2. Адаптационные изменения миокарда беременных в условиях гипоксии 38
1.2.3. Влияние перинатальной гипоксии на неонатальный миокард и процессы апоптоза 41
1.3. Этиология и основные механизмы развития наиболее распространенных типов гипоксии 47
1.3.1. Промышленные экзогенные токсиканты как индукторы гипоксических состояний 47
1.3.2. Прерывистая гипобарическая (высотная) гипоксия и низкие температуры как факторы повреждения миокарда 55
1.4. Обзор фармакологических средств, повышающих устойчивость к гипоксии 61
1.4.1. Полифенолы винограда как перспективные кардиопротекторы 68
1.4.2. Препарат «Цитофлавин» как потенциальный кардиопротектор и антигипоксант 73
Раздел 2. Материал и методы исследования 79
2.1. Схема эксперимента, экспериментальные модели, доза и кратность введения корректоров 79
2.2. Характеристика потенциальных кардиопротекторов 84
2.3. Морфологические методы исследования миокарда 85
2.4. Биохимическое исследование плазмы крови и электрокардиографическое исследование 91
2.5. Статистические методы 92
Раздел 3. Морфофункциональные изменения миокарда крыс различных возрастных групп в условиях гемической гипоксии с последующей оценкой проводимой коррекции 94
3.1. Морфофункциональные особенности миокарда крыс, возникающие в условиях гемической гипоксии без коррекции 94
3.1.1. Морфологическая характеристика миокарда половозрелых крыс в условиях гемической гипоксии 94
3.1.2. Морфологические изменения в миокарде новорожденных крыс на фоне гемической гипоксии 107
3.2. Морфологические изменения у крыс, возникшие на фоне гемической гипоксии при введении антиоксиданта 119
3.2.1. Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гемической гипоксии при введении антиоксиданта 119
3.2.2. Морфологические изменения у новорожденных крыс, возникшие на фоне гемической гипоксии при введении антиоксиданта 125
3.3. Морфологические изменения у крыс, возникшие на фоне гемической гипоксии при введении антигипоксанта 132
3.3.1. Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гемической гипоксии при введении антигипоксанта 132
3.3.2. Морфологические изменения у новорожденных крыс, возникшие на фоне гемической гипоксии при введении антигипоксанта 141
3.4. Оценка индекса иммуногистохимического окрашивания основных саркомерных белков у крыс в условиях гемической гипоксии и на фоне введения корректоров 148
3.5. Исследование сердечного ритма крыс в условиях гемической гипоксии и на фоне введения корректоров 153
3.6. Концентрация малонового диальдегида при гемической гипоксии и на фоне введения корректоров 155
Раздел 4. Морфофункциональные преобразования миокарда крыс различных возрастных групп в условиях гистотоксической гипоксии с последующей оценкой проводимой коррекции 158
4.1. Морфологические изменения у крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии 158
4.1.1. Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии 158
4.1.2. Морфологические изменения у новорожденных крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии 173
4.2. Морфологические изменения у крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии при введении антиоксиданта 181
4.2.1. Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии при введении антиоксиданта 181
4.2.2. Морфологические изменения у новорожденных крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии при введении антиоксиданта 191
4.3. Морфологические изменения у крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии при введении антигипоксанта 196
4.3.1. Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии при введении антигипоксанта 196
4.3.2. Морфологические изменения у новорожденных крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии при введении антигипоксанта 205
4.4. Оценка индекса иммуноокрашивания основных саркомерных белков у крыс в условиях гистотоксической гипоксии и на фоне введения корректоров 213
4.5. Исследование сердечного ритма крыс в условиях гистотоксической гипоксии и на фоне введения корректоров 217
4.6. Концентрация малонового диальдегида при гистотоксической гипоксии и на фоне введения корректоров 219
Раздел 5. Морфофункциональные изменения миокарда крыс в условиях гипобарической холодовой гипоксии с последующей оценкой проводимой коррекции 221
5.1. Морфологические изменения у крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии 221
5.1.1. Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии 221
5.1.2. Морфологические изменения у новорожденных крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии 230
5.2. Морфологические изменения у крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии при введении антиоксиданта 235
5.2.1. Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии при введении антиоксиданта 235
5.2.2. Морфологические изменения у новорожденных крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии при введении антиоксиданта 241
5.3. Морфологические изменения у крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии при введении антигипоксанта 248
5.3.1. Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии при введении антигипоксанта 248
5.3.2. Морфологические изменения у новорожденных крыс, возникшие на фоне гипобарической холодовой гипоксии при введении антигипоксанта 254
5.4. Оценка индекса иммуноокрашивания основных саркомерных белков у крыс в условиях гемической гипоксии и на фоне введения корректоров 260
5.5. Исследование сердечного ритма крыс в условиях холодовой гипобарической гипоксии и на фоне введения корректоров 264
5.6. Концентрация малонового диальдегида при холодовой гипобарической гипоксии и на фоне введения корректоров 265
Раздел 6. Обсуждение полученных результатов исследования 268
Выводы 290
Практические рекомендации 294
Список основных сокращений 295
Список литературы 296
Приложения 338
- Современные представления о функциональной морфологии и энергетическом балансе сократительного кардиомиоцита
- Препарат «Цитофлавин» как потенциальный кардиопротектор и антигипоксант
- Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии
- Оценка индекса иммуноокрашивания основных саркомерных белков у крыс в условиях гемической гипоксии и на фоне введения корректоров
Современные представления о функциональной морфологии и энергетическом балансе сократительного кардиомиоцита
Cократительный кардиомиоцит (КМЦ) представляет собой сложноорганизованную клетку, компонентами которой является целый ряд мультифункцинальных белков, обеспечивающих передачу сигнала, процесс сокращения и расслабления, поддержание клеточной формы, взаимодействие между внеклеточным матриксом и внутриклеточными органеллами, а также образующими особые межклеточные контакты, обеспечивающие ритмичность сокращений. Форма сократительных желудочковых кардиомиоцитов приближена к призматической, длина КМЦ в среднем составляет 50-120 мкм, а ширина варьирует в диапазоне 8-20 мкм [65, 97].
Процесс электрохимического сопряжения начинается на сарколемме, что обусловлено ее особым строением [65]. На ультрамикроскопическом уровне выявлено, что сарколемма состоит из трех слоев: внутреннего листка – плазмалеммы толщиной 7,5-9,0 нм, представляющую собой жидкостно мозаичную структуру, которая довольно четко визуализируется электронномикроскопически. Далее находится средний слой, состоящий из гликопротеидов толщиной около 50 нм, хорошо окрашивающийся коллоидным железом или коллоидным лантаном. Углеводные части мембранных комплексов этого слоя, обращенные наружу, составляют поверхностный слой гликокаликса толщиной около 20 нм. Этот слой, в свою очередь, покрыт более толстым внешним толщиной до 30 нм. Внешний компонент сарколеммы (коллаген IV типа) – более рыхлое, чем гликокаликс вещество, покрывающее клетку непрерывным слоем толщиной 50-500 нм [273]. Значительную часть саркоплазматического объема заполняют миофибриллы, представленные филаментами сократительных белков, упакованных параллельно друг другу плотными рядами и вплетащихся в подмебранные пространства сарколеммы. Концевые участки КМЦ бывают зигзагообразной формы, поскольку вставочные диски, состоящие из нексусов и десмосом, демонстрируют характерные интердигитации и нередко имеют разную длину [65]. Классической единицей продольного деления миофибриллы является саркомер. В состав саркомера входят актиновые и миозиновые филаменты [246].
Эти сократительные структуры формируются из актиновых стресс-волокон премиофибрилл, возникающих на периферии мышечных клеток.
Премиофибриллы постепенно приобретают более упорядоченный вид и, наконец, созревают до миофибрилл [27, 361]. Одним из белков вставочных дисков и промежуточных филаментов является десмин, находящийся рядом с Z-линией в саркомерах и обеспечивает целостность клетки при механической работе в процессе сокращения-растяжения. Десмин играет ключевую роль в стабилизации и поддержания целостности миофибрилл, а также обеспечивает их поперечное прилегание [33, 280, 357].
Около 35% объема сократительных клеток занимает очень важный компонент миокарда – митохондрии (М), что отражает высокую интенсивность энергетических процессов. М расположены между миофибриллами, в перинуклеарной зоне и под сарколеммой, и состоят из мембран в виде наружного и внутреннего слоев толщиной до 7 нм [348, 325, 358]. В зависимости от источника и конформационного состояния структура крист может варьировать от простых трубчатых образований до сложных ламеллярных структур, прикрепленных к границе внутренней части сарколеммы посредством трубчатых образований диаметром 28 нм [325, 260]. В миокарде превалируют митохондрии овальной или округлой форм. Кристы присутствуют в большом количестве, плотно упакованы и расположены перпендикулярно их длинной оси. Длина органелл варьирует от 1 до 4,8 мкм, а толщина – от 0,8 до 2,7 мкм [285, 346, 365]. Ядра КМЦ, как правило, имеют овальную форму, кариолемма может приобретать слабовыраженные фестончатые контуры с крупными порами, эухроматин существенно преобладает над гетерохроматином. Количество петлистых ядрышек варьирует от одного до трех. С каждым ядерным полюсом ассоциирован с небольшой конусообразной частью саркоплазмы, где выявляются небольшие пузырьки пластинчатого комплекса Гольджи, центриоли, митохондрии, гранулярный и гладкий саркоплазматический ретикулум (СПР), а также лизосомы и липидные включения. Сарколемма образует глубокие впячивания или так называемые поперечные трубочки (Т-система), связанные с СПР и являющиеся внутриклеточным резервуаром ионов кальция [284, 341].
Эндомизий покрывает кардиомиоциты в виде сетчатого футляра из коллагеновых волокон (диаметром 30-70 нм). Эти волокна упакованы в небольшие тяжи (диаметром 120-150 нм), закрепленные в базальной мембране кардиомиоцитов между фестонами сарколеммы на уровне Z-дисков [180]. Направляясь от одного волокна к другому, коллагеновые фибриллы объединяют их в пучок. Таким же способом осуществляется связь кардиомиоцитов с капиллярами. Вместе с тем, эндомизий не является непрерывной изолирующей оболочкой мышечного волокна. Кардиомиоциты соединяются между собой межмембранными контактами – вставочными дисками. Внутри пучка КМЦ описаны участки плотных контактов и нексусов между мышечными клетками. Доказано также наличие щелевых соединений между КМЦ и фибробластами [56, 354, 398].
В перимизии коллагеновые волокна формируют толстые извитые пучки, которые выполняют функции демпферной системы, защищающей кардиомиоциты от чрезмерного растяжения. Среди фибриллярных белков в строме преобладают коллаген I и коллаген III типов. Причем около 80% стромально компонента образовано коллагеном I типа, входящего в состав толстых волокон миокарда, обеспечивающих его механическую прочность. Около 11% стромальных волокон принадлежит коллагену III типа, с которым связывают растяжимость миокарда [113]. Среди интерстициальных клеток наиболее часто встречаются фибробласты (90-95%) и тучные клетки (4-9%). Коллагеновые и эластические волокна межклеточного вещества формируют трехмерный каркас, на протяжении сердечного цикла постоянно меняющий пространственную архитектонику [26]. Основное, или аморфное вещество с полианионными свойствами обеспечивает трофическую и метаболическую функции и содержит большое количество гликозаминогликанов и протеогликанов. Качественный и количественный состав стромальных компонентов миокарда, их соотношение и взаимодействие регулируются достаточно жестко на всех слоях организации миокарда. Нарушения этого баланса существенно отражаются на функциональных возможностях миокарда, а также определяют вариант патоморфоза заболеваний сердца [187, 357, 358].
Элементы сосудистой стенки кровеносных сосудов миокарда также являются важной частью его стромального компонента. Гладкие миоциты синтезируют и активно выделяют компоненты внеклеточного матрикса (гликозаминогликаны, коллаген III типа, эластин). Эндотелиоциты также выделяют факторы, активирующие синтез проколлагеназы клетками фибробластического ряда [336, 357]. В состав базальной мембраны, образованной эндотелиальными клетками, входят такие белки, как фибронектин, ламинин и коллаген IV типа, которые придают ей гидрофобность и механическую стабильность. Уникальное расположение эндотелиальных клеток на границе между циркулирующей кровью и тканями делает их наиболее уязвимыми для разнообразных патогенных факторов, присутствующих в системном и регионарном кр овотоке [366]. Именно эти клетки впервые контактируют с активными формами кислорода (АФК), с окисленными липопротеинами низкой плотности, с высоким гидростатическим давлением внутри выстилаемых артериол и т.п. [133].
Сердце является сокращается непрерывно и характеризуется малой утомляемостью, поэтому его метаболизм в норме сбалансирован и адаптирован к постоянному воспроизводству энергетических субстратов в достаточных количествах для поддержания сократительной функции, что отличает его от такового в скелетной мускулатуре [343]. Циклы синтеза макроэргов в сердце, как и в других органах и тканях, может происходить двумя основными путями: за счет анаэробного гликолиза и аэробного окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи митохондрий [322, 329, 344, 389].
Для обеспечения нормальной работы целого органа в клетках должно существовать тесное взаимодействие между митохондриями и саркоплазматическими окислительными системами [327, 329]. Так, известно, что модулятором силы сокращения сердечной мышцы является система креатинфосфата, осуществляющая челночный трансфер энергии от митохондрий к миофибриллам. В физиологических условиях АТФ, синтезированный в митохондриях КМЦ, практически полностью используется для фосфорилирования креатина, в результате чего образуется макроэргическая молекула креатинфосфата [322]. В таком виде происходит транспорт энергии от митохондрий к миофибриллам. Высвобождающийся креатин вновь может подвергаться фосфорилированию в митохондриях. Благодаря существованию такого челночного пути энерготранспорта сохраняется стационарный уровень и эффективность сердечной сократительной деятельности, а также регулируется скорость поступления Са2+ через плазматическую мембрану [388, 389].
Препарат «Цитофлавин» как потенциальный кардиопротектор и антигипоксант
В связи с неуклонно возрастающим влиянием разнообразных гипоксантов на жизненедеятельность современного человека особую актуальность приобретает разработка антиоксидантов метаболического типа действия, эффекты которых будут обеспечивать восстановление активности митохондриальных ферментных комплексов с целью поддержания аэробного синтеза энергии и других энергозависимых процессов [123, 132]. В связи с этим, особый интерес представляет внедрение в клиническую практику производных янтарной кислоты, которые улучшают тканевое дыхание посредством активации электронного транспорта в митохондриях и практически не обладают токсическим или тератогенным эффектом. Интерес исследователей к сукцинат-содержащим препаратам связан с изучением работы митохондриальных ферментов при различных патофизиологических состояниях, а также открытием гипоксией-индуцибельного фактора HIF-1 в сочетании с исследованиями генома человека, благодаря которым были обнаружены G-протеин-зависимые рецепторы, способные избирательно связываться с сукцинатом.
Согласно результатам отечественных и зарубежных экспериментальных работ, помимо участия в реакциях биологического окисления, сукцинат играет важную роль в регуляции физиологических, метаболических и генетических процессов [58, 164, 165, 243]. Хорошо известно, что сукцинат активирует синтез регенераторных цитокинов. Доказан феномен быстрого окисления сукцината в клеточной цитоплазме при участии фермента сукцинатдегидрогеназы (СДГ), который сопровождается восстановлением пула динуклеотидов. Наблюдаемый при введении во внутреннюю среду избытка янтарной кислоты (ЯК) эффект известен как «монополизация сукцинатом дыхательной цепи окисления», что проявляется ускорением ресинтеза клетками АТФ и возрастанием их антиоксидантного потенциала [58, 234].
Опубликованные экспериментальные данные указывают на то, что, кроме участия в реакциях тканевого дыхания, меняющаяся концентрация сукцината в клетках и в интерстиции способна играть роль метаболического сигнала, запускающего важные адаптационные механизмы [203]. При условии нормальной оксигенации основное количество сукцината накапливается в митохондриальном матриксе, где он окисляется сукцинатдегидрогеназой II и служит донором дополнительного количества электронов для дыхательной цепи [44, 58, 64].
Исследования на животных еx vivo доказали, что в результате развития окислительного и нитрозативного стресса, на пример, на фоне сепсиса, возникает стойкое нарушение функции митохондриального комплекса I. Вследствие этого в клетках наблюдается критическое падение уровня окислительного фосфорилирования, что проявляется резким понижением утилизации кислорода даже при его достаточном парциальном давлении и тканевом напряжении. Развивающийся при этом дефицит АТФ играет фундаментальную роль в формировании полиорганной недостаточности. В таких условиях сукцинат способен восстанавливать работу дыхательной цепи, поддерживая поступление электронов через комплекс II [164].
В эксперименте сукцинат увеличивал митохондриальное потребление кислорода в скелетных мышцах у крыс с перитонитом, что позволило рассматривать применение сукцината в качестве потенциальной стратегии по улучшению митохондриальных функций. Снижение активности митохондриального комплекса I и способность экзогенного сукцината улучшать работу дыхательной цепи были продемонстрированы также на моделях ишемии-реперфузии у экспериментальных животных при временной ишемии сердца [99, 201, 203]. Согласно экспериментальным данным в клетках, подвергшихся воздействию мощного оксиданта третбутилгидропероксида, добавленный сукцинат не только увеличивал синтез АТФ, но и приводил к снижению образования малонового диальдегида (МДА) – диагностического маркера перекисного окисления липидов. Антигипоксический эффект сукцината пролонгируется его влиянием на стабильность и активность гипоксия-индуцибельного фактора HIF-1, описанного ранее в данном обзоре, реализуется порседством ингибирования протеолиза его альфа-субъединицы пролилгидроксилазой [241, 243, 300].
Вышеуказанные свойства сукцината дали убедительное основание для его терапевтического использования при целом ряде социальнозначимых патологий [46, 114, 203, 234]. К сожалению, почти все зарубежные публикации о сукцинате основаны сугубо на экспериментальных данных и практически не подкрепляются клиническим опытом [391]. При этом в Pоссийской Федерации cукцинат довольно давно является компонетом различных препаратов вполне успешно применяется в качестве субстратного антигипоксанта и органопротектора в клинической практике [44, 114, 234]. К числу известных сукцинат-содержащих препаратов следует отнести «Цитофлавин» (НПЦ «Полисан», Санкт-Петербург), имеющий соответствующую доказательную базу. Метаболическая энергокоррекция, антигипоксическая, а также антиоксидантная активность которого обусловлены взаимодополняющим действием эссенциальных компонентов цикла Кребса: двух метаболитов янтарной кислоты и инозина (рибоксина), а также двух витаминов никотинамида и рибофлавина [114, 201].
По мнению создателей препарата эффекты янтарной кислоты максимально проявляются при его комбинации с рибоксином – агонистом пуринэргических рецепторов, запускающих гликолиз. Вызываемая рибоксином активация гликолиза в свою очередь способствует появлению относительно стабильного клеточного энергетического пула [167]. Важным аспектом действия рибоксина является его участие в синтеза оксида азота (NO) – мощного вазодилятатора, повышающего биодоступность кислорода и энергетического субстрата путем улучшения микроциркуляции. Это обусловлено способностью рибоксина освобождать из химических связей аденозин, который задействован в синтезе оксида азота, за счет чего и реализуется вышеупомянутая системная вазодилятация, регулируемая через активацию NO-синтаз. Основной задачей аденозина является улучшение кислородного транспорта по капиллярному руслу, а также снижение кислородной потребности тканей за счет снижения энергетических потребностей клеток, в которых имеются аденозиновые рецепторы [114, 372]. Кроме этого, антиоксидантный ээфект рибоксина реализуется посредством взаимосвязанных метаболических путей: 1) активацией синтеза NAD в митохондриях из никотинамида – компонента «Цитофлавина». Рибоксин в этом плане выступает как донор рибозы; 2) cтимуляцией анаэробного гликолиза с образованием лактата и NAD; 3) ингибированием фермента ксантаноксидазы и подавлением радикальных процессов [43, 200].
Еще один компонент препарата амидный метаболит никотиновой кислоты – никотинамид служит прекурсором коферментов дегидрогеназ и способен регулировать два жизненно важных процесса: механизм цикла трикарбоновых кислот и в меньшей степени окислительное фосфорилирование. Роль данного субстрата особенно велика в поддержании структурно-функциональных свойств клеточных мембран. В частности, никотинамид способен воздействовать на гликопротеины клеточных мембран, повышая экспрессию антиапоптотических факторов в условиях гипоксии [201].
Антиоксидантный эффект следующего компонента рибофлавина объясняется способностью препарата обеспечивать сохранность глютатионредуктазы, восстанавливающей пул глутатиона – важнейшего компонента антиоксидантной системы клеток [375]. Следует подчеркнуть, что помимо антиоксидантного эффекта, рибофлавин способен оказывать мощное антигипоксантное действие за счет активации флавиновых ферментов. Таким образом, комбинация фармкомпонетов в «Цитофлавине» осуществлена не по принципу суммирования их эффектов, а по принципу взаимопотенцирования с учетом синергизма их механизмов действия [201, 220].
Клинические исследования доказали, что «Цитофлавин» улучшает состояние фетоплацентарного комплекса, в основе чего лежит снижение активности ПОЛ и нормализация коагуляционных свойств крови. Использование препарата наряду с общепринятой терапией фетоплацентарной недостаточности, позволяет пролонгировать беременность, избежать развития декомпенсации, повысить адаптационные резервы в системе мать-плацента-плод и улучшить перинатальные исходы [226]. Согласно данным В.В. Ковальчук и соавторов, у новорожденных детей с постгипоксическим повреждением сердца, отягощенным церебральной ишемией I-II степени, выявлено, что инфузии препарата в составе комплексной терапии сопровождалось более быстрой, по сравнению с контролем, положительной динамикой сократительной и насосной функций миокарда, устранением явлений гипоксии и электрической нестабильности миокарда, а также энергодефицита КМЦ не только в первые пять дней стационарной терапии, но и при катамнестическом наблюдении за детьми с первого по шестой месяц жизни [165].
Морфологические изменения у половозрелых крыс, возникшие на фоне гистотоксической гипоксии
Полученные в ходе исследования данные свидетельствовали о том, что гистотоксическая гипоксия оказывала выраженное патологическое воздействие на миокард половозрелых крыс. Значительная токсичность хлорида кобальта приводила к существенному снижению массы тела самок на 15,52% (р 0,001), при этом масса сердца снижалась на 4,81% (р 0,05) относительно значений интактного контроля. Относительная масса сердца на фоне общей весовой потери возрастала на 3,00% (таблица Б.1, Б.2).
Анализ полученных данных, касающихся морфометрии КМЦ после окончания внутрижелудочного введения хлорида кобальта, позволил установить наличие весьма выраженных изменений. Сократительные кардиомиоциты всех подопытных животных значительно укорачивались и истончались. Так, длина КМЦ левого желудочка на 16,52% (р 0,001) была ниже контрольной. Диаметр КМЦ укорачивался на 13,32% (р 0,001), при этом площадь КМЦ уменьшалась на 43,95% (р 0,001).
Ядра КМЦ часто приобретали неправильную форму, их диаметр был меньше контроля на 8,24% (р 0,001), соответственно, площадь ядер достоверно уменьшалась на 11,9% (р 0,001) ниже контрольных значений (таблица Б.3).
Длина КМЦ правого желудочка уменьшалась по сравнению с контролем на 14,61% (р 0,001). Диаметр КМЦ ПЖ снижался на 10,73% (р 0,001), а площадь КМЦ сократилась на 44,28% (р 0,001). Диаметр и площадь ядер уменьшались по сравнению с контролем на 7,55% и 10,69% (р 0,001). Таким образом, миокард правого желудочка был относительно резистентным к воздействию гистотоксической гипоксии.
Морфологическая картина миокарда самок на фоне гистотоксической гипоксии характеризовалась наличием участков с частичной или полной потерей поперечной исчерченности вплоть до полного миоцитолизиса (рисунок 4.1.а).
При обзорном окрашивании гематоксилином и эозином выявлялись признаки дистрофии, гомогенизации и повышенной ацидофилии саркоплазмы, явления геморрагий и глыбчатого распада. Сосуды микроциркуляторного русла были резко полнокровны, что нередко являлось причиной эритроцитарного диапедеза, отечны, в их стенке выявлялись явления фибриноидного набухания (рисунок 4.1.b).
Число и распространенность повреждений в разных отделах миокарда чрезвычайно варьировало. Чаще всего они встречались в левом желудочке (рисунок 4.2.a), несколько реже в стенке правого желудочка (рисунок 4.2.b).
Повреждения КМЦ преимущественно носили характер мелкоочаговых, нередко рассеянных и множественных. Лимфогистиоцитарные инфильтраты и скопления лейкоцитов формировались преимущественно вокруг зон миоцитолизиса и рядом с полнокровными сосудами (рисунок 4.3.а, b). При поляризационной микроскопии прослеживались контрактурные изменения II-III степени, разволокнения миофибрилл, гиперрелаксация саркомеров, поперечная исчерченность была слабо выражена. Отмечалась локальная волнообразная деформация КМЦ, что может служить морфологическим проявлением нарушения ритма (рисунок 4.4).
Многие КМЦ содержали большое количество липидных включений, что являлось признаком жировой дистрофии и дисметаболии (рисунок 4.5).
При окрашивании ГОФП-методом были выявлены обширные зоны КМЦ с интенсивной фуксинофилией саркоплазмы. Крупные фуксинофильные очаги в миокарде левого желудочка окрашивались интенсивным малиновым цветом и имели довольно четкие границы (рисунок 4.6.a). В миокарде правого желудочка наблюдалось более диффузное распределение мелких фуксинофильных очагов, иногда наблюдалось их слияние в более крупные (рисунок 4.6.b).
Характерным признаком гистотоксической гипоксии была активация процессов апоптоза в миокарде половозрелых крыс, что практически не встречалось при гемической гипоксии. Под влиянием ионов Co2+ в саркоплазме 3 4 соседних КМЦ, обычно имеющих дистрофические изменения, экспрессировался проапоптотический белок p53 (рисунок 4.7.a). Вблизи таких клеток часто наблюдались скопления CD95+- лимфоцитов (рисунок 4.7.b).
При гистотоксической гипоксии также обращало на себя внимание наличие довольно обширных участков пролиферации соединительной ткани в местах гибели КМЦ. Окрашивание азокармином (рисунок 4.8.a) и методом Маллори (рисунок 4.8.b) выявило избыточное количество коллагеновых волокон в интерстиции, по ходу капилляров, в стенках артериол и в расширенных паравазальных пространствах (рисунок 4.9.а). Стенки венул были разрыхлены и отечны (рисунок 4.9.b).
На некоторых препаратах выявлялись признаки очагового кардиосклероза, что проявлялось в виде замещения довольно больших участков миокарда соединительной тканью. Об активации в целом неблагоприятных процессов ремоделирования внеклеточного матрикса свидетельствовало большое количество клеток, экспрессировавших маркер ремоделирования MMП-9 в интерстиции (рисунок 4.10.а) и инфильтратах (рисунок 4.10.b), а также активация клеток фибробластического ряда, экспрессировавших -SMA. Причем в некоторых кардиомиоцитах очевидно происходила их так называемая дедифференцировка. В их саркоплазме появлялись так называемые стресс фибриллы, состоящие из филаментов альфа-гладкомышечного актина (рисунок 4.11).
Моделирование гистотоксической гипоксии также приводило к формированию более выраженных изменений гемомикроциркуляторного русла у самок по сравнению с воздействием нитрита натрия, наиболее выраженных в миокарде левого желудочка (таблица Б.5). Наружный диаметр артериол левого желудочка возрастал на 6,43% (р 0,05), а внутренней диаметр превышал контрольный показатель на 9,18% (р 0,001). Толщина стенки артериол была меньше контроля на 8,81% (р 0,001). Площадь просвета артериол соответственно возрастала на 9,03% (р 0,001). Количественная плотность капилляров существенно уменьшалась и была на 18,13% (р 0,001) ниже контрольных значений.
Наружный диаметр артериол ПЖ у самок также возрастал на 6,38% (р 0,05), а внутренний превышал контрольные значения на 6,49% (р 0,05). Толщина стенки артериол уменьшалась на 7,07% (р 0,05), таким образом, площадь просвета артериол превышала контрольные значения на 6,16% (р 0,05). Плотность капилляров равнялась таковой в миокарде левого желудочка, уменьшаясь на 19,02% (р 0,001) по сравнению с контрольными показателями.
При этом наблюдались участки, где экспрессия маркеров эндотелия практически отсутствовала (рисунок 4.12). Кроме этого, выявлялись признаки повсеместного нарушения гемодинамики, что проявлялось неравномерным капиллярным и венозным полнокровием, запустеванием и спазмом ряда сосудов микроциркуляторного русла, что сопровождалось периваскулярным отеком. Повреждение эндотелия сопровождалось сладжированием форменных элементов, суживающих эффективный просвет сосуда. Повышенная проницаемость сосудистой стенки проявлялась обильными депозитами нитей фибрина в периваскулярном пространстве (рисунок 4.13. a, b).
При проведении электронной микроскопии основные морфологические признаки кобальтового повреждения миокарда у самок были представлены преимущественно необратимыми изменениями, основными признаками которых являлись выраженный отек и вакуолизация саркоплазмы, лизис миофибрилл, митохондрий и прочих органелл, формирование ригорных комплексов вплоть до тотального некроза и аутолиза КМЦ.
В КМЦ ядра преимущественно располагались в центре саркоплазмы и отличались полиморфизмом – их кариолемма формировала большое количество остроконечных инвагинатов (рисунок 4.14.а) за счет саркоплазматического отека, который иногда смещал их в субсарколеммальную зону. Вблизи ядер с преобладанием эухроматина нередко наблюдались кластеры мелких электронноплотных митохондрий, наружные мембраны которых, по-видимому, формировали тесные контакты с кариолеммой (рисунок 4.14.b).
Оценка индекса иммуноокрашивания основных саркомерных белков у крыс в условиях гемической гипоксии и на фоне введения корректоров
Экспозиция крыс в условиях гипобарической холодовой гипоксии также оказывала существенное влияние на иммуногистохимическую экспрессию саркомерного актина (рисунок 5.33.а,b). При этом повреждение сократительного аппарата было менее выраженным по сравнению с другими сериями, что, видимо, было обусловлено дополнительным повреждающим воздействием побочных продуктов биохимических реакций с участием ксенобиотиков. В группе без коррекции ИМО SA у самок был на 14,29% (р 0,05) ниже контроля, у новорожденных – на 23,40% (р 0,05), а ИМО десмина снижался на 28,89% (р 0,05) и на 29,63% (р 0,05) (рисунок 5.34.а,b, таблица 5.1).
Введение антиоксиданта продемонстрировало довольно выраженный цитопротекторный эффект на состояние миофибрилл, поскольку ИМО SA был недостоверно ниже контроля на 7,79% (р 0,05) у самок и на 12,76% (р 0,05) у новорожденных. По сравнению со второй группой без коррекции ИМО SA достоверно возрастал на 7,04% и 12,20% (р 0,05) соответственно (рисунок 5.35.а,b).
Миокард НР крысы на фоне ГХГ. а. Кардиомиоциты ЛЖ с низкой и сохраненной экспрессией саркомерного актина. b. Дезорганизация и исчезновение Z-полос в саркоплазме КМЦ ЛЖ. Desmin-Free зоны. ИГХ х 400.
Аналогично ИМО десмина недостоверно отличался от контроля на 15,56% у самок и на 14,81% у новорожденных (р 0,05) соответственно, также несущественно возрастая по сравнению с предыдущей группой без коррекции на 12,83% и 17,39% (р 0,05).
Введение антигипоксанта в группе III.4 практически полностью нивелировало токсические эффекты холодовой гипобарической гипоксии, однако в некоторых КМЦ экспрессия саркомерного актина была низкоинтенсивной.
Так, значения ИМО SA и десмина были недостоверно ниже интактного контроля у самок на 7,41% и 6,38% (р 0,005), у новорожденных – на 4,44% и 3,90% (р 0,05), при этом довольно существенно возрастая по сравнению с группой без коррекции на 10,81% (р 0,05) и 25,58% (р 0,05) у самок, и на 12,20% и 24,0% (р 0,05) у новорожденных.
От показателей предыдущей группы ИМО обоих показателей практически не отличался, превышая значения для SA на 4,05% и 6,82% (р 0,05), а десмина на 11,62% и 8,00% (р 0,05) соответственно.
Саркоплазма большинства КМЦ имела отчетливо выраженную темно-коричневую поперечную исчерченность, обусловленную высокой экспрессией саркомерного актина (рисунок 5.36, 5.37a). Большая часть кардиомиоцитов была разделена хорошо контурируемыми вставочными дисками темно-коричневого цвета (рисунок 5.36, 5.37.b).
Интенсивная упорядоченная экспрессия саркомерного актина в саркоплазме КМЦ. b. Нормальная экспрессия десмина чередуется с интенсивной в гипертрофированных КМЦ. ИГХ х 400.