Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Порфирины и фталоцианины как модификаторы в высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярном электрофорезе 10
1.2. Определение водорастворимых витаминов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза 29
Глава 2. Исходные вещества, подвижные фазы, рабочие буферные растворы, сорбенты, методика работы, аппаратура, расчетные формулы 42
Глава 3. Гетерогенизация порфиринов и фталоцианинов на сорбентах для высокоэффективной жидкостной хроматографии
3.1. Адсорбция из растворов на гидрофобизированных силикагелях и ионообменниках низкой емкости 50
3.2. О механизмах адсорбции модификаторов 56
Глава 4. Модифицированные сорбенты как неподвижные фазы в ВЭЖХ
4.1. Удерживание фенолов на гидрофобизированных силикагелях и ионообменниках на основе полиметакрилатной матрицы...64
4.2. Поведение водорастворимых витаминов на ионообменниках на основе силикагеля и полиметакрилатных матриц 80
4.3. Анализ фармацевтических препаратов 94
Глава 5. Порфирины и фталоцианины как модификаторы в КЗЭ
5.1. Выбор оптимальных условий разделения водорастворимых витаминов (рН, концентрация буферного раствора) 98
5.2. Поведение витаминов в динамически модифицированном кварцевом капилляре 104
5.3. Анализ фармацевтических препаратов 107
Выводы 117
Список литературы 120
Приложение 134
- Определение водорастворимых витаминов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза
- О механизмах адсорбции модификаторов
- Поведение водорастворимых витаминов на ионообменниках на основе силикагеля и полиметакрилатных матриц
- Поведение витаминов в динамически модифицированном кварцевом капилляре
Введение к работе
Актуальность темы. В работе исследовано влияние водорастворимых порфиринов и фтапоцианинов на селективность разделения в высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярном электрофорезе. При постановке работы мы учитывали, что ВЭЖХ и КЭ дополняют друг друга, используются практически в одних и тех же областях науки и техники и для повышения селективности хроматографического и электрофоретического разделения применяются аналогичные приемы. Перспективно получение простыми методами новых адсорбентов на основе известных матриц для внедрения их в аналитическую практику.
В качестве модификаторов неподвижных фаз и буферных растворов нами использованы водорастворимые порфирины и фталоцианины, которые сравнительно мало изучены, однако, благодаря уникальности строения молекул способны к взаимодействиям с активными центрами поверхностей, сорбатами, пол и электролитам и, подвижными фазами, их состояние в растворе существенно зависит от рН.
В качестве сорбатов были выбраны, с одной стороны, хорошо изученные фенолы, как для уточнения механизма их сорбции на модифицированных сорбентах, так и для тестирования колонок; с другой стороны - водорастворимые витамины, проблема определения которых в объектах все еще актуальна ввиду сложности, недостаточной экспрессности и селективности существующих методик. Данных по удерживанию водорастворимых витаминов на модифицированных порфиринами и фтало цианинам и колонках в литературе нет. Нет данных также по электрофоретическому поведению витаминов в кварцевых капиллярах при использовании рабочих буферных растворов, содержащих эти модификаторы.
Цель работы: исследование селективности хроматографического и электроф еретического разделения, на примере фенолов и водорастворимых витаминов, при использовании порфиринов и фталоцианинов в качестве модификаторов неподвижных фаз и буферных растворов.
Конкретные задачи исследования: изучить адсорбцию модификаторов в статических и динамических условиях, оценить устойчивость модифицированных сорбентов в условиях ВЭЖХ рассмотреть механизмы закрепления модификаторов на поверхности сорбентов спектроскопически исследовать взаимодействия модификаторов с полиэлектролитом и водорастворимыми витаминами в растворах и на поверхности сорбента для интерпретации экспериментальных данных в разработать методики получения модифицированных сорбентов за счет физической адсорбции сравнить селективность разделения сорбатов на модифицированных и немодифицированных колонках оценить воспроизводимость коэффициентов емкости на модифицированных колонках оценить селективность разделения витаминов в динамически модифицированных кварцевых капиллярах
Научная новизна. Получены новые адсорбенты путем физической иммобилизации порфиринов и фталоцианинов на сорбентах на основе различных матриц. Модифицировали Silasorb-C18, Diaspher-110-C|8, Diasorb-130-Сь Diasorb -130-С4, Diasorb -130-C16l Spheron 100 (LC), Spheron С 1000, НЕМА S 1000 QL, Nucleosil SB в статических и динамических условиях. Адсорбцию проводили в присутствии полиэлектролита хлорида полидиаллилдиметиламмония. В условиях
ВЭЖХ на модифицированных сорбентах исследовано поведение ряда водорастворимых фенолов и витаминов. Данные по хроматографическому удерживанию сорбатов на Spheron С 1000 и Diaspher-110-Cis обработаны согласно моделям Скотта-Кучеры, Снайдера-Сочевинского. Рассчитаны изотермы адсорбции ряда витаминов из данных ВЭЖХ. Предложена теоретическая интерпретация полученных результатов, рассмотрены возможные механизмы удерживания модификаторов на сорбентах и сорбатов на модифицированных сорбентах.
Водорастворимые порфирины и фталоцианины предложены в качестве модификаторов для динамического модифицирования капилляра в капиллярном зонном электофорезе. Исследована зависимость скорости и направления электроосмотического потока, электрофоретической подвижности, селективности и эффективности разделения водорастворимых витаминов от природы и количества модификатора.
В динамически модифицированном капилляре показана возможность селективного разделения никотинамида и цианокобал амина, увеличение чувствительности определения цианокобаламина. В классическом капиллярном зонном электрофорезе названные витамины не разделяются.
Практическая значимость. Предложены простые методики получения новых адсорбентов на основе известных матриц. Представлены примеры разделения модельных смесей замещенных фенолов и водорастворимых витаминов. Возможно разделение пяти витаминов за 20 мин в изократическом режиме на модифицированном Nucleosil SB и шести витаминов за 15 мин на Diaspher-110-Сщ. Выполнено разделение смеси никотинамида и цианокобаламина методом КЗЭ в присутствии модификаторов. Проанализированы фармацевтические препараты, содержащие водорастворимые витамины, на модифицированных сорбентах в условиях ВЭЖХ и в динамически модифицированных капиллярах методом КЗЭ. В препарате «Пентовит» определен витамин В12. На защиту выносятся:
Результаты исследования адсорбции окта-4,5-карбоксифталоцианата цинка и 3,8-ди(1 -метоксиэтил)дейтеропорфирина IX в статических и динамических условиях, устойчивости модифицированных сорбентов в условиях ВЭЖХ и механизмов закрепления модификаторов на поверхности сорбентов.
Результаты спектроскопического исследования взаимодействия модификаторов с полиэлектролитом хлоридом полидиаллилдиметиламмония и водорастворимыми витаминами в растворах и на поверхности сорбента.
Данные по изучению адсорбции водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ, расчету изотерм адсорбции и термодинамических параметров адсорбции.
Выводы о применимости моделей Скотта-Кучеры и Снайдера-Сочевинского к описанию удерживания фенолов на Diaspher-HO-CigHSpheronC 1000.
Данные по разделению сорбатов на модифицированных и немодифицированных колонках, а также в динамически модифицированных окта-4,5-фталоцианином, д и гидрохлоридом гематопорфирина, 3,8-ди(1-метоксиэтил)дейтеропорфирином IX кварцевых капиллярах.
Условия и результаты количественного определения водорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах методами ВЭЖХ и КЗЭ.
Выводы о селективности хроматографического и электрофоретического разделения фенолов и водорастворимых витаминов при использовании порфиринов и фталоцианинов в качестве модификаторов неподвижных фаз и буферных растворов.
Апробация работы. Результаты работы доложены на международных конференциях «Ломоносов-2003», «Ломоносов-2004», «Ломоносов-2005» (Москва, 2003, 2004, 2005), «100 years of chromatography» (Moscow, Russia, 2003), IX Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (Суздаль, Россия,
2003), всероссийских конференциях «Аналитика России» (Клязьма,
2004), VI Школе-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи:
Брыкина Г.Д., Жарикова B.C., Пирогов А.В., Шпигун О.А. // Адсорбция окта-4,5-карбоксифталоцианата цинка в присутствии полиэлектролита на сорбентах для ВЭЖХ. Вестн. МГУ. Сер.2. Химия. 2003. 44. №6. С.409-411.
Брыкина Г.Д., Жарикова B.C., Матусова СМ., Шпигун О.А. Хроматографические свойства сорбентов для ВЭЖХ, модифицированных окта-4,5-карбоксифталоцианатом цинка. // Журн. аналит. химии. 2005. Т.60. №11. С. 1170-1175.
Мочалова B.C., Брыкина Г.Д., Шпигун О.А. // ВЭЖХ водорастворимых витаминов на модифицированных сорбентах. Вестн. МГУ. Сер.2. Химия. 2006. Т.47. № 3. С. 180-185 и 7 тезисов докладов.
Определение водорастворимых витаминов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза
Витамины привлекают внимание исследователей, в том числе хроматографистов, уже несколько десятилетий. Однако, как следует из анализа литературы за последние пять лет, проблема определения витаминов в пищевых, фармацевтических, биологических и других объектах также актуальна. Молекулы водорастворимых витаминов могут содержать алифатические цепи, ароматические кольца, ионогенные группы и др., поэтому для их разделения и определения применяют методы обращенно-фазовой [29-40], ионообменной [41] и ион-парной [42-49] ВЭЖХ (табл. 3). К разделению смесей водорастворимых витаминов приводят взаимодействия их молекул с поверхностью неподвижной фазы. К изменению удерживания витаминов приводит также состояние их в подвижной фазе. Согласно литературным данным, оно существенно зависит от их концентрации, рН и ионной силы раствора. В качестве сорбентов, как правило, используют гидрофобизированные силикагели Сі8. Среди ПФ хорошо зарекомендовали себя фосфатные и боратные буферные растворы (с рН 2,6-9,7), а также водно-органические смеси в ряде случаев с добавлением уксусной кислоты. В качестве органических добавок обычно применяют метанол, ацетонитрил, бутанол и др. В работах [43, 47] установлено влияние природы и содержания ион-парных реагентов и органических добавок на параметры удерживания водорастворимых витаминов. Ион-парные реагенты (гексан-, гептан-, октансульфонат натрия, додецилсульфат натрия и др.) и градиентное элюирование повышают качество разделения витаминов. Так, при повышенной температуре в подвижной фазе 16 мМ ДЦС-20 мМ фосфатный буфер-бутанол (3,5%), рН 3,6 удалось разделить стандартную смесь 8 витаминов и определить в поливитаминном препарате 7 водорастворимых витаминов. Однако время анализа в изократическом режиме составило 3, а в градиентном - 1,5 часа [48]. Как правило, удается разделение менее сложных смесей, состоящих из 3-5 водорастворимых витаминов.
Отметим, что данных в литературе по разделению смесей витаминов на модифицированных сорбентах практически нет, хотя фталоцианины и порфирины, обладающие многочисленными реакционными центрами, возможно, могут вступать в специфические взаимодействия с витаминами. Вышеизложенный материал показывает, что, с одной стороны, актуально изучение свойств полученных простыми методами новых адсорбентов на основе известных матриц для внедрения их в аналитическую практику, с другой стороны, остается актуальным определение витаминов в конкретных объектах (поливитаминных препаратах, премиксах и др.). Метод капиллярного электрофореза. Определение витаминов методом КЭ весьма перспективно, так как позволяет проводить разделение смесей ионогенных соединений в сильно кислых и щелочных средах, исключить влияние окислительно-восстановительных свойств анализируемых веществ. Обычно используют капиллярный зонный электрофорез и мицеллярную электрокинетическую хроматографию. Хотя известны работы по определению витаминов методом капиллярного гель-электрофореза и изоэлектрической фокусировки [50]. Последний метод может быть использован для предварительного концентрирования аналитов перед разделением методом КЭ.
Капиллярный зонный электрофорез. На результаты анализа в КЗЭ влияет скорость электро осмотического потока, которая в свою очередь зависит от концентрации и рН буферного раствора, температуры, значения приложенного электрического поля и пр. Из-за низкой селективности метода КЗЭ необходим тщательный подбор условий для более эффективного разделения смеси витаминов (табл. 4) [51-61]. Как видно, разделение смеси водорастворимых витаминов протекает наиболее эффективно в диапазоне рН 7,6 - 9,0 при использовании водных рабочих буферных растворов фосфата или бората натрия. Для увеличения скорости ЭОП в буферный раствор добавляют органический растворитель. Большинство витаминов в щелочной среде присутствует в виде анионов с различной электрофоретической подвижностью. Их детектируют чаще всего в интервале длин волн 200 — 266 им, поскольку максимумы поглощения большинства витаминов располагаются в УФ-диапазоне. Для разделения нейтральных молекул, например витамина В]2 и никотинамида, движущихся с одинаковыми скоростями вместе с ЭОП, используют капилляры с модифицированной поверхностью (статическое модифицирование капилляра), применяют добавки органических растворителей в буферные растворы (динамическое модифицирование капилляров) или используют мицеллярную электрокинетическую хроматографию. Мицеллярная . электрокинетическая хроматография. Для разделения витаминов, незаряженных в водной среде, широкое применение нашла мицеллярная электро кинетическая хроматография (табл. 5) [62-74].
Это связано с тем, что, если в раствор, содержащий ПАВ в мицеллярной форме, ввести смесь подлежащих разделению веществ, то они распределяются между гидрофобной мицеллярной средой и водной фазой в соответствии с индивидуальными коэффициентами распределения. При этом медленно движущиеся в электрическом поле крупные мицеллы играют роль хроматографії чес кой неподвижной фазы по отношению к молекулам разделяемых веществ, продвигающихся в водной фазе с существенно большей скоростью электроосмотического потока. По существу, при этом реализуется процесс обращешю-фазовой хроматографии, в которой мицеллы ПАВ выполняют роль псевдостационарной фазы. Метод не лишен недостатков. Так, поскольку физико-химические свойства водорастворимых витаминов могут существенно различаться, возникают затруднения с выбором детергента, подходящего для каждого из компонентов смеси. Кроме того, вводимое ПАВ может взаимодействовать со стенками капилляра (или с иммобилизованным на ней модификатором), что также может негативно сказаться на результатах анализа. К недостаткам МЭКХ можно отнести и сложность методики: часто для повышения селективности разделения приходится использовать рабочие растворы сложного состава, создавать в капилляре градиент рН или концентрации детергента. Иногда возникает необходимость дополнительно исследовать взаимодействия между органическим модификатором буферного раствора и детергентом. Оба рассмотренных метода (КЗЭ и МЕКХ) в 30-100 раз менее чувствительны, чем ВЭЖХ. Это делает перспективным поиск и исследование новых модификаторов для разделения водорастворимых витаминов в условиях капиллярного электрофореза. Электрофоретическое поведение витаминов при использовании буферных растворов, содержащих порфирины и фталоцианины, раннее не изучалось.
О механизмах адсорбции модификаторов
Одним из факторов, влияющих на величину адсорбции, является состояние соединений в растворе [85-89]. Следует отметить, что данные о состоянии водорастворимых порфиринов и фталоцианинов в растворе немногочисленны и противоречивы. Состояние зависит от природы ЦАМ (Со, Си, Zn) [90], периферийных заместителей, в частности SO3H", СОО", и их числа [91-93], полярности растворителя [94], присутствия ПАВ и др. [95]. Электронное строение порфиринов и фталоцианинов позволяет исследовать взаимодействия их молекул с растворителями, полиэлектролитами и другими компонентами растворов (сорбатами) как в растворе, так и на поверхности сорбента соответственно спектрофотометрическим методом и методом ДО [78]. Остановимся на взаимодействиях ZnPc в растворе. Исследование электронных спектров поглощения индивидуальных фталоцианинов, а именно: октакарбоксизамещенного безметального лигаида и его комплекса с цинком в водных растворах и в смеси с полиэлектролитами (ПДА, ЦПБ, 3,6-ионен), показало, что наиболее чувствительная к различным взаимодействиям в растворах фталоцианатов полоса Соре, расположенная на границе УФ и видимой области спектра, уширяется и смещается батохромно относительно соответствующей полосы в спектре индивидуального ZnPc на 10-20 нм; полоса в спектре безметалыюго основания в присутствии полиэлектролитов смещается гипсохромно на 20-30 нм (табл. 9). Чтобы подтвердить наличие взаимодействий фталоцианата цинка с ПДА, записывали также ЭСП индивидуальных соединений и их смесей с разными соотношениями компонентов гпРс:ПДА от 1:0,5 до 1:6 в интервале рН 2-8,5 и выявляли изменения в спектре ZnPc.
При постоянной концентрации ZnPc 0,5x10"5М ЭСП существенно зависит как от соотношения компонентов, так и от рН (рис. 12). Так, при рН 5 Q-полоса в спектре ZnPc (640 нм) расщепляется в присутствии ПДА на две с максимумами 690 и 630 нм, а полоса Соре (350 нм) батохромно смещается на 10 нм. Изменяется интенсивность всех полос поглощения. В кислых средах при рН 4 в присутствии полиэлектролита Q-полоса и полоса Соре смещаются гипсохромно на 20 и 10 нм соответственно. Ниже приведены максимумы полос в ЭСП растворов с соотношением 2пРс:ПДА=1:4 в зависимости от рН: Влияние рН на интенсивность и положение полос поглощения в ЭСП может быть связано с тем, что при рН 5 происходит протонирование карбоксильных групп и процесс ассоциации за счет образования межмолекулярных водородных связей усиливается. В интервале рН 6-8 равновесие мономер - димер смещается влево, как и в присутствии полиэлектролита и ДМФА. Таким образом, изменения в ЭСП могут быть связаны с образованием комплекса фталоцианата с ПДА преимущественно за счет электростатического взаимодействия многозарядного аниона фталоцианата, карбоксильные группы которого диссоциированы (рН 7) [91], с поликатионами ПДА. Кроме того, координационно-ненасыщенный атом цинка фталоцианата может координировать ПДА по атому азота.
Эти процессы, как и присутствие ПДА, смещают равновесие мономер - димер в сторону образования мономера, что облегчает образование комплекса. Для взаимной нейтрализации зарядов достаточен 2-4 кратный избыток ПДА в зависимости от рН (рис. 13, 14). Отсутствие изобестической точки (рис. 13) можно объяснить более сложным равновесием в растворе, чем мономер - димер [95]. Наши исследования показали, что при мольном отношении ZnPc и ПДА 1:2 в растворе между формами мономер - д и мер наступает равновесие. При этом соотношении реагентов наблюдается наибольшая адсорбция ZnPc из раствора в присутствии полиэлектролита. Видимо, образующийся комплекс, более гидрофобный, чем исходные соединения, адсорбируется на поверхности за счет неспецифических гидрофобных взаимодействий неполярных фрагментов макроцикла и полиэлектролита с алкильными углеводородными радикалами неполярных сорбентов. Отметим, что повышение адсорбции модификатора из раствора в присутствии органических растворителей, например ДМФА, может быть связано с мономеризацией ZnPc, что способствует образованию комплекса ZnPc с ПДА. Эти факты указывают на преимущественно гидрофобный характер ассоциации, которой препятствует электростатическое отталкивание карбоксильных групп. Исследование спектров ДО адсорбатов также позволило сделать некоторые выводы о механизме адсорбции. Известно, что химическая адсорбция модификаторов на поверхности сорбентов сопровождается заметными спектральными изменениями. Так, закрепление феофитина «а» на аминированном кремнеземе приводит к исчезновению в спектре ДО полос при 510 и 545 нм и появлению в спектре интенсивной полосы в области 500 нм. Положение красного максимума в спектрах ДО феофитина «а» на аминированном кремнеземе смещено в сторону более коротких волн (665 нм) по сравнению с кремнеземом (670 нм). Полученные результаты позволили авторам предположить, что феофитин химически взаимодействует с аминогруппами поверхности [97]. Отсутствие подобных спектральных изменений в спектре ДО адсорбатов - модификаторов на гидрофобизированных сорбентах в присутствии ПДА - подтверждает физический характер адсорбции. Рассмотрим механизм адсорбции модификаторов на других сорбентах. Следует отметить, что сорбция модификаторов на ионообмешшках дополняется катионным и анионным обменом, обусловленным электростатическими взаимодействиями, происходит как в отсутствие, так и в присутствии полиэлектролита. При адсорбции из раствора на поверхности Spheron С 1000 присутствие ПДА в растворе снижает адсорбцию пигмента, видимо, за счет конкуренции молекул полиэлектролита и модификатора за адсорбционные центры поверхности.
После предварительного модифицирования поверхности ПДА появляются новые адсорбционные центры - функциональные группы полиэлектролита, непосредственно не участвующие в адсорбционном взаимодействии с поверхностью Spheron С 1000. В данном случае вероятно одновременное взаимодействие молекулы модификатора как с адсорбционным центром поверхности адсорбента, так и с функциональными группами адсорбированного ПДА. Необратимая адсорбция ZnPc и H2DP на анионобменниках НЕМА S 1000 QL и Nucleosil SB возможна в отсутствие ПДА за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий (рис. 15). Сравнение спектров ДО модификаторов до и после работы в условиях ВЭЖХ в различных подвижных фазах (ацетонитриле, воде, их смесях, в том числе содержащих NaCl (0,1 М) и фосфорную кислоту (0,1%), а также фосфатном буферном растворе (рН 6,86; 8,00), боратном буферном растворе (рН 9,18; 10,00), растворе карбоната и гидрокарбоната натрия (рН 8,0)) показывает, что ZnPc и H2DP практически не десорбируются с поверхности (см. Приложение). Это доказывает стабильность полученного покрытия и подтверждает возможность использования полученных сорбентов в условиях ВЭЖХ.
Поведение водорастворимых витаминов на ионообменниках на основе силикагеля и полиметакрилатных матриц
Коэффициенты емкости водорастворимых витаминов зависят от природы и концентрации буферного раствора, содержания АН и природы модификатора (табл. 14). Они изменяются в достаточно широких пределах (рис. 29, 30). Введение в ПФ ацетонитрила (до 8 об.%) незначительно влияет на удерживание витаминов. Как видно из рис. 29, удерживание витаминов закономерно уменьшается при росте концентрации элюента, что вполне согласуется с теоретическими представлениями. Коэффициенты емкости витаминов Вь В!2, НА 1; витаминов РР, В2, Вс 1 изменяются в интервале 1,3-13,0; для витаминов С, В6 коэфициенты емкости изменяются от 0,37 до 3,32 в различных подвижных фазах и колонках (табл. 14). Отметим, что при использовании фосфатного буферного раствора удерживание витаминов меньше, чем при использовании боратного буфера, поскольку рН фосфатного буферного раствора меньше, чем боратного. При использовании фосфатного буферного раствора невозможно разделение витаминов Вь В$, С, НА. исследуемых витаминов уменьшается при увеличении количества модификатора.
Это может быть связано с экранированием большого количества групп четвертичного аммониевого основания на поверхности сорбента. Селективность и порядок выхода витаминов зависят от используемого модификатора, неподвижной фазы и состава элюента (см. Приложение). В данных условиях на колонке НЕМА S 1000 QL - ZnPc возможно разделение шести витаминов Bi2, НА, С, В6, РР, В2 до базовой линии при скорости элюента 0,3 мл/мин (рис. 31). Время выхода В2, на хроматограмме не показанного, при этом составляет 1час 40 мин. Удерживание витамина В!2 мало ( к «1), что, вероятно, связано с наибольшим размером гидратированного иона этого витамина. Далее ряды удерживания обусловлены уменьшением радиусов гидратированных ионов, а также индивидуальными особенностями витаминов, в частности, их кислотно-основными свойствами и склонностью к гидрофобным взаимодействиям. Наибольшая селективность разделения витаминов наблюдается на колонке НЕМА S 1000 QL - ZnPc. Это, вероятно, связано с более сложным строением модификатора, наличием центрального атома металла и карбоксильных периферийных заместителей в молекулах фталоцианата, т.е. возможны к—к- взаимодействия, аксиальное связывание аналитов с ЦАМ, электростатические взаимодействия между ионами модификаторов и витаминов. На Nucleosil SB хроматографическое поведение витаминов изучали в колонке, немодифицированной и модифицированной ZnPc в статических условиях. В качестве подвижной фазы был выбран хорошо зарекомендовавший себя на НЕМА S 1000 QL фосфатный буферный раствор (рН 6,86), концентрации буферного раствора и содержание ацетонитрила варьировали (табл. 15). Также использовали кислые растворы КН2Р04 (рН 4,8) в присутствии органического растворителя (ацетонитрила). Порядок выхода витаминов в ПФ АН (8%) - фосфатный буферный раствор (рН 6,86) на модифицированном и немодифицированном Nucleosil SB совпадает, за исключением РР и В2, выходящих в обратном порядке (табл. 15): Nucleosil SB: В, В12 В6 НА С В2 РР
При увеличении элюирующей силы подвижной фазы на Nucleosil SB-ZnPc (ЗО мМ — 50 мМ фосфатный буферный раствор) удерживание витаминов изменяется: коэффициенты емкости В], Ві2, В6, НА, С увеличиваются, РР - не изменяется, В2 - уменьшается. Селективность разделения соединений в подвижной фазе с рН 6,86 на модифицированном и немодифицированном Nucleosil SB изменяется незначительно. Возможно разделение до базовой линии 4-х витаминов, например Вь В]2, В , PP. В отличие от других модифицированных сорбентов на Nucleosil SB - ZnPc при увеличении элюирующей силы буферного раствора (рН 6,86) коэффициенты емкости витаминов изменяются неодназначно (табл. 15). При смещении рН элюента в кислую область на Nucleosil SB - ZnPc удалось разделить пять витаминов. В оптимальных условиях на Diaspher-110-С18 получена хроматограмма, содержащая шесть пиков витаминов (рис. 32). Параметры хроматографического разделения приведены в табл. 16. Согласно литературным данным чаще всего удается разделение смесей, состоящих из 3-5 водорастворимых витаминов за 20-40 мин в градиентном режиме или в условиях ион-парной ВЭЖХ. Поэтому наша методика определения витаминов не уступает, а ряде случаев и превосходит по селективности, эффективности и экспрессности известные из литературы методики определения и разделения водорастворимых витаминов.
Известно, что спектры поглощения тетрапиррольных молекул чрезвычайно чувствительны к взаимодействиям, происходящим в центре и на периферии молекулы. Поэтому для исследования эффектов слабых взаимодействий были сняты спектры модификаторов в отсутствие и в присутствии витаминов (см.
Поведение витаминов в динамически модифицированном кварцевом капилляре
Отметим, что выбранные нами модификаторы существуют в щелочной среде в виде анионов, поэтому практически не взаимодействуют с отрицательно заряженной поверхностью кварцевого капилляра, т.е. формирование узких зон витаминов в КЗЭ происходит непосредственно в среде электролита без участия каких-либо взаимодействий с внутренней поверхностью капилляра. При использовании порфиринов в качестве модификаторов скорость ЭОП может, как увеличиваться, так и уменьшаться, согласно данным [22-27]. Направление ЭОП сохраняется. Скорость его, как видно из рис. 38, независимо от длины капилляра и природы модификатора уменьшается при увеличении концентрации порфирина. Влияние дейтеропорфирина IX на скорость электроосмотического потока слабее, чем влияние д и гидрохлорида гематопорфирина. Но при увеличении концентрации фталоцианина скорость ЭОП увеличивается (рис. 38), что, вероятно, обусловлено большим количеством диссоцированных карбоксильных групп у фталоцианина. Данных по разделению водорастворимых витаминов в капиллярах, модифицированными порфиринами, в литературе нет. Однако, можно предположить, что в этом случае будут иметь место взаимодействия тех же типов, которые описаны для аминокислот, пептидов и органических фосфатов, а именно: гидрофобные взаимодействия (для витаминов, содержащих ароматические системы - Вь В2, В6, Bi2, Be, РР, НА), электростатическое притяжение (между положительно заряженным атомом металла модификатора и анионами витаминов) и аксиальная координация безметальных модификаторов центральным атомом металла витамина (например, цианокобаламин) и др. Также свой вклад в формирование комплексов может внести образование водородных связей между аминогруппами витаминов и пиррольными атомами азота с неподеленными электронными парами молекулы порфирина. Это позволяет предположить, что при динамическом модифицировании капилляра порфиринами возрастет селективность определения витаминов [11].
При исследовании влияния модификаторов на селективность разделения водорастворимых витаминов в качестве модельной смеси использовали смесь витамина Bi2 и никотинамида, поскольку разделение других витаминов в отсутствие модификатора удовлетворительно. При использовании гемина для разделения водорастворимых витаминов получены невоспроизводимые результаты; при использовании фталоцианата цинка - пики витаминов НА и Bi2 размываются, возможно, лишь их неполное разделение. При разделении других витаминов при введении в электролит этого модификатора получены невоспроизводимые результаты, зависимость скорости ЭОП при увеличении концентрации фталоцианата цинка не найдена (рис. 38). При использовании дигидрохлорида гематопорфирина, диметоксиэтилдейтеропорфирина и фталоцианина — возможно селективное разделение смеси из восьми витаминов (рис. 39-41), в том числе никотинамида и цианокобаламина, порядок выхода витаминов практически не изменяется:
При динамическом модифицировании селективному разделению витамина В]2 и НА, вероятно, способствует конкурирующий процесс образования межмолекулярного ассоциата никотинамида и модификатора посредством водородных связей между амидной группой НА и заместителями в порфириновом кольце модификатора типа NH»»«OH или N» H-0. Наличие взаимодействий, затрагивающих порфириновое кольцо, подтверждается сдвигом полосы Соре в электронном спектре поглощения (см. Приложение). Молекулы дигидрохлорида гематопорфирина, диметоксиэтилдейтеропорфирина и фталоцианина также содержат карбоксильные группы, образование ассоциатов никотинамида (в отличие от цианокобаламина) с молекулами безметальных модификаторов более выгодно, чем с металлированными. Кроме того, эти модификаторы имеют различные донорные заместители, чем и объясняется их различное влияние на разделение витаминов. Так, пики витаминов на электрофореграмме, полученной при использовании капилляра, динамически модифицированного дигидрохлоридом гематопорфирина, разрешаются хуже за счет большего размывания. Кроме того, в связи с особенностями структуры гематопорфирина дигидрохлорида его молекулы проявляют склонность к ассоциации в растворе [108], что ухудшает базовую линию электрофореграммы и, в конечном счете, предел обнаружения и воспроизводимость результатов. Основные параметры разделения НА и В2 в динамически модифицированном капилляре представлены в табл. 25. Порфирины и фталоцианиновое основание были использованы при разделении стандартной смеси восьми витаминов (рис. 39-41). Оптимальные результаты: пики соединений симметричны, разделение всех витаминов полное, получены при использовании 3,8-ди(1-метоксиэтил)дейтнропорфирина IX.
На основании экспериментальных данных были рассчитаны электрофоретические подвижности и коэффициенты селективности витаминов (табл. 26). Чувствительность определения Ви в присутствии модификаторов дигидрохлорида гематопорфирина, диметоксиэтилдейтеропорфирина, фталоцианина зависит от длины волны (210, 254, 360 нм) и природы модификатора. Максимальная чувствительность определения Ві2 наблюдается в присутствии дигидрохлорида гематопорфирина с детектированием при 360 нм (рис. 42). Данные условия были использованы при определении В2 в фармацевтическом препарате «Пентовит».
