Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Методы и подходы вещественного анализа металлов. Задачи вещественного анализа. Металломика 15
1.2. Капиллярный электрофорез в вещественном анализе противоопухолевых препаратов на основе платины 24
1.3. Капиллярный электрофорез в вещественном анализе противоопухолевых препаратов на основе рутения 39
1.4. Аффинный капиллярный электрофорез в определении параметров связывания 46
1.5. Капиллярный электрофорез наночастиц золота 50
1.6. Капиллярный электрофорез в вещественном анализе
неорганических форм благородных металлов 65
Глава 2. Экспериментальная часть 71
2.1. Комплексы платины и рутения с противоопухолевой активностью: объекты исследования, реагенты и условия эксперимента 71
2.2. Наночастицы золота: объекты исследования, реагенты и условия эксперимента 85
2.3. Комплексы платиновых металлов в растворах минеральных кислот: объекты исследования, реагенты и условия эксперимента 88
Глава 3. Капиллярный электрофорез в вещественном анализе противоопухолевых комплексов платины и рутения при их взаимодействии с белками крови 90
3.1. Капиллярный электрофорез со спектрофотометрическим детектором в регистрации форм платиновых комплексов при взаимодействии с альбумином 91
3.2. Капиллярный электрофорез с масс-спектрометрическим детектированием с индуктивно-связанной плазмой в регистрации форм платиновых комплексов при взаимодействии с альбумином 94
3.3. Капиллярный электрофорез с масс-спектрометрическим детектированием с индуктивно-связанной плазмой и формы существования комплекса рутения при взаимодействии с белками крови 100
Глава 4. Сродство комплексов платиновых металлов к белкам крови – определение констант и стехиометрии связывания 111
4.1. Определение констант связывания в варианте аффинного капиллярного электрофореза методом Гумеля-Дрея 111
4.2. Определение констант связывания и стехиометрии платиновых комплексов с противоопухолевой активностью с альбумином 114
4.3. Оценка взаимодействия цисплатина и аминокомплексов с альбумином методом капиллярного электрофореза с масс спектрометрическим детектированием с индуктивно-связанной плазмой 117
Глава 5. Капиллярный электрофорез в сочетании с масс спектрометрией в вещественном анализе противоопухолевого комплекса рутения(III) c компонентами цитозоля 124
5.1. Формы рутения и устойчивость аддуктов с белками в модельных цитозольных условиях 125
5.2. Формы существования рутения при взаимодействии аддуктов альбумина и апо-трансферрина и транс-[тетрахлоридо-бис(1Н индазол)рутенат(III)] индазолиния с цитозольными компонентами 130
5.3. Формы существования рутения при взаимодействии аддукта холо трансферрина и транс-[тетрахлоридо-бис(1Н-индазол)рутенат(III)] индазолиния с цитозольными компонентами 136
5.4. Капиллярный электрофорез с масс-спектрометрическим детектированием с индуктивно-связанной плазмой в оценке состояния рутения в среде цитозоля 150
5.5. Идентификация низкомолекулярных форм рутения продуктов взаимодействия аддукта холо-трансферрина и транс-[тетрахлоридо бис(1Н-индазол)рутенат(III)]индазолиния с цитозольными компонентами методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением 151
5.6. Аффинный капиллярный электрофорез со спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектором в оценке форм рутения при взаимодействии низкомолекулярных соединений рутения с ДНК-олигонуклеотидом 161
5.7 Сочетание ультрафильтрации и масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в оценке форм рутения при взаимодействии с ДНК олигонуклеотидом 170
Глава 6. Капиллярный электрофорез наночастиц золота 174
6.1 Капиллярный электрофорез со спектрофотометрическим и бесконтактным кондуктометрическим типами детектора в регистрации наночастиц золота 175
6.2 Наночастицы золота в капиллярном электрофорезе с масс-спектрометрическим детектированием с индуктивно-связанной плазмой 181
Глава 7. Формы существования благородных металлов в растворах минеральных кислот и их связь с каталитической активностью 185
7.1. Оценка факторов, влияющих на состояние родия(III) и миграционные характеристики его химических форм в капиллярном электрофорезе 185
7.2. Состояние родия(III) в растворах различных кислот 196
7.3. Состояние Pt(IV), Ir(III, IV), Au(III) в растворах различных кислот 202
7.4. Состояние платиновых металлов и их каталитическая активность в реакции окисления N-метилдифениламин-4-сульфокислоты 207
Заключение 214
Список условных обозначение и сокращений 219
Список литературы 220
- Капиллярный электрофорез в вещественном анализе противоопухолевых препаратов на основе рутения
- Капиллярный электрофорез с масс-спектрометрическим детектированием с индуктивно-связанной плазмой и формы существования комплекса рутения при взаимодействии с белками крови
- Идентификация низкомолекулярных форм рутения продуктов взаимодействия аддукта холо-трансферрина и транс-[тетрахлоридо бис(1Н-индазол)рутенат(III)]индазолиния с цитозольными компонентами методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением
- Состояние платиновых металлов и их каталитическая активность в реакции окисления N-метилдифениламин-4-сульфокислоты
Введение к работе
Актуальность проблемы. В XXI веке не ослабевает интерес к практическому применению соединений благородных металлов. Так, препараты на основе платины(II) успешно используются в медицине как средства противоопухолевой терапии. Внедрение в биомедицинские исследования и практику наночастиц золота и платины для диагностики и одновременного лечения различных заболеваний сегодня является многообещающим научным направлением с большим прикладным значением - тераностикой. Благородные металлы и материалы на их основе используются для получения электролитических покрытий, специальных сплавов, в качестве катализаторов органического и неорганического синтеза или для дожигания выхлопных газов автомобилей.
Несмотря на большое число работ, посвященных применению соединений благородных металлов в указанных областях, недостаточными остаются знания об их химических формах в различных биологических, природных и промышленных объектах. В то же время именно индивидуальные формы могут в значительной степени определять реакционную способность, биодоступность, биоактивность, устойчивость или токсичность металлов. Поэтому важным является установление связи между состоянием металла в растворе или биологической среде и его свойствами и поведением. Анализ химических форм особенно актуален для случая благородных металлов, химические соединения которых отличаются большим многообразием вследствие склонности к комплексообразованию и гидролизу в растворах, возможности существования в нескольких степенях окисления, а также кинетической инертности. Получение информации о природе и концентрации форм благородных металлов или, другими словами, их вещественный анализ, невозможен без участия аналитической химии, средства и методы которой позволяют также прослеживать образование и превращение индивидуальных форм металлов, в том числе в составе наноразмерных объектов, и описывать эти процессы в терминах кинетических и равновесных параметров. В вещественном анализе область, связанная с изучением различных форм металла в организме, выделяется в современное и перспективное направление – металломику.
Для решения задач вещественного анализа, наравне с другими гибридными аналитическими методами, широко применяется капиллярный электрофорез (КЭ). К преимуществам метода относятся, прежде всего, высокая эффективность разделения, небольшой объем пробы, необходимый для анализа, простота разделительной системы. За счет отсутствия сорбента, способного изменить состояние форм металлов, КЭ оказывает минимальное влияние на их исходное распределение в объекте анализа. Именно сохранение форм неизменными в процессе определения является основным требованием и условием вещественного анализа. Немаловажно и то, что КЭ хорошо сочетается с биосовместимыми водными средами.
Известно, что благородные металлы в биологических, природных и промышленных объектах часто присутствуют в очень незначительных количествах. Поэтому для их вещественного анализа методом КЭ необходимо использовать высокочувствительные детекторы.
Основная цель работы состояла в разработке методологии вещественного анализа некоторых благородных металлов в модельных средах и в объектах сложного состава с использованием метода КЭ.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
предложить подходы, сочетающие использование КЭ с различными видами детектирования для вещественного анализа благородных металлов, на примере соединений рутения и платины, обладающих противоопухолевой активностью, и в условиях, моделирующих биологические пробы, или в реальных биологических жидкостях;
выявить условия проведения и ограничения аффинного КЭ при разделении несвязанных и связанных с биомолекулами (на примере транспортных белков плазмы) платино-и рутенийсодержащих противоопухолевых комплексов и определении параметров связывания;
на основе данных аффинного КЭ провести сравнительную оценку параметров связывания рутений- и платиносодержащих комплексов с транспортными белками плазмы, а также их устойчивости к воздействию компонентов цитозоля;
оценить аналитические возможности КЭ с детектированием методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (МС-ИСП), МС-ИСП (в сочетании с подготовкой проб методом ультрафильтрации), МС с ионизацией распылением в электрическом поле (МС-ЭРИ) и тандемной МС-ЭРИ форм рутения в процессе их трансформации за счет взаимодействия с биомолекулами (в модельных условиях и биожидкости); оптимизировать параметры интерфейса в КЭ-МС-ИСП и электрофоретические условия, обеспечивающие разделение и детектирование;
разработать методический подход, основанный на сочетании МС-ИСП с КЭ и ультрафильтрацией, для оценки взаимодействия низкомолекулярных (активных) форм рутения с ДНК-олигонуклеотидом в условиях, моделирующих цитозоль онкоклетки;
изучить возможности КЭ с различными видами детектирования (фотометрическим, кондуктометрическим и масс спектрометрическим) и найти условия разделения и чувствительного детектирования наночастиц золота (ЗНЧ) и их конъюгатов с сывороточными белками;
показать возможности метода КЭ для вещественного анализа благородных металлов в среде минеральных кислот; выявить связь между химическими формами родия, иридия, золота и платины и их каталитической активностью с целью определения малых количеств металлов (на основе реакции окисления одного из представителей дифениламинов).
Методы исследования. Для решения поставленных в работе задач использовали методы КЭ-УФ, КЭ-МС-ИСП, МС-ИСП, МС-ЭРИ, МС/МС-ЭРИ, спектрофотометрии, кондуктометрии. Научная новизна результатов настоящего исследования заключается в:
разработке методологии вещественного анализа – в приложении к формам существования благородных металлов, – включающей применение метода КЭ с различными видами детектирования и способами подготовки проб и ее апробации на примере модельных растворов и цитозоля;
оригинальном применении метода КЭ-МС-ИСП для изучения химических превращений противоопухолевых комплексов Pt(II) и Ru(III) при их взаимодействии с транспортными белками крови и подтверждении образования белковых аддуктов;
выявлении форм металлов, образующихся при действии на белковые аддукты комплекса Ru(III) компонентов цитозоля, путем комбинированного использования КЭ-МС-ИСП и МС-ИСП в сочетании с ультрафильтрацией;
определении констант и стехиометрии связывания терапевтических препаратов на основе комплексов Pt(II) (цисплатин и оксалиплатин) и разрабатываемых цитотоксичных комплексов Pt(II) с транспортными белками.
в достижении высокой чувствительности детектирования наночастиц золота (предел обнаружения 210–15 M) за счет применения МС-ИСП и использования электрофоретических условий, предотвращающих агрегацию и сорбцию наночастиц на стенках разделяющего капилляра;
нахождении связи между найденного методом КЭ знаком заряда комплексных форм родия, рутения, золота и платины, присутствующими в растворах разбавленных минеральных кислот, и их каталитической активностью в реакции окисления N-метилдифениламин-4-сульфокислоты, используемой для определения данных металлов.
Практическая значимость работы состоит в том, что автором:
- предложен подход к решению проблемы вещественного анализа в отсутствие
стандартов определяемых веществ, основанный на отнесении электрофоретических пиков с
формами связанного и несвязанного с белком металла в системе, моделирующей образование
аддукта в кровяном русле и его трансформацию во внутриклеточных условиях;
сформулирована концепция последовательного применения методов КЭ-МС-ИСП, КЭ и МС-ЭРИ, тандемной МС-ЭРИ, а также КЭ-МС-ИСП и МС-ИСП с ультрафильтрацией, которая может быть использована для получения многосторонней информации при изучении форм металлов, образующихся в процессе взаимодействия белковых аддуктов металла с биомолекулами, с учетом различий в молекулярной массе участников реакции, скорости их взаимодействия в реакционной смеси;
проведена оценка числа форм металла, знака их заряда и устойчивости к действию веществ с окислительным и комплексообразующим действием методом КЭ при изучении взаимодействий комплексов платины и рутения, обладающих противоопухолевой активностью, с транспортными белками плазмы и внутриклеточными компонентами (глутатион, аскорбиновая и лимонная кислоты) в модельных растворах и в биологических объектах со сложным матричным составом;
дано сравнение возможностей кондуктометрического, УФ- и МС-ИСП методов для детектирования форм наночастиц золота в КЭ;
- в условиях, оптимизированных по данным КЭ, проведено каталитическое
спектрофотометрическое определение родия(III) в платиновом концентрате КП-5 по реакции
окисления N-метилдифениламин-4-сульфокислоты в слабокислой среде.
Разработанные подходы к использованию КЭ-МС-ИСП успешно реализованы в научных группах Варшавского технологического университета и Венского университета при изучении взаимодействий комплексов металлов с противоопухолевой активностью с транспортными белками крови.
На защиту автор выносит:
методологию вещественного анализа комплексов платины и рутения в модельных средах и биологической жидкости методами КЭ-МС-ИСП и МС-ЭРИ;
данные о формах существования платины и рутения в условиях, моделирующих кровяное русло и внутриклеточную среду, полученные с применением метода КЭ-МС-ИСП; подходы к оценке знака заряда, свободных и связанных с белками форм металла при изучении его взаимодействия с био(макро)молекулами.
параметры связывания платино- и рутенийсодержащих комплексов с белками плазмы, рассчитанные по данным метода КЭ со спектрофотометрическим и МС-ИСП детектированием;
комплексное использование результатов КЭ-МС-ИСП, МС-ИСП и МС-ЭРИ в анализе форм рутения, образующихся при взаимодействии с белками, цитозольными компонентами или олигонуклеотидом ДНК в модельных средах и биожидкостях;
результаты применения КЭ с кондуктометрическим, спектрофотометрическим и МС-ИСП детекторами в вещественном анализе ЗНЧ и конъюгатов с белком;
результаты изучения состояния родия(III), платины(II), золота(III) и иридия(IV, III) в растворах хлороводородной, хлорной, азотной и серной кислот методом КЭ и выявленная взаимосвязь между химическими формами металлов и каталитической активностью в реакции окисления N-метилдифениламин-4-сульфокислоты в слабокислой среде, применяемой в кинетических каталитических методах определения этих металлов.
Апробация результатов исследования
Работа выполнялась в рамках следующих проектов: (1) РФФИ, № 98-03-32560 (1998-2000 гг.); (2) РФФИ, № 01-03-32090 (2001-2003 гг.); (3) РФФИ, проект для молодых ученых № 02-03-06287 «Изучение состояния золота в кислых средах методом капиллярного электрофореза» (2002 г.); (4) РФФИ, № 07-03-00468 (2007-2009 гг.); (5) РФФИ, № 10-03-00273а «Развитие капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой как метода биовещественного анализа» (2010-1012 гг.); (6) проект Фонда Миановского «Separation Capillary as a Microreactor to Model Cell Processing of Anticancer Metal-Based Drugs Using Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry» (2011 г.); (7) ДААД, № 11.7187.2013 «Изучение взаимодействий наночастиц золота с белками плазмы и противоопухолевыми средствами на основе комплексов металлов методом капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием» Германия, Регенсбург (2013 г.); (8) РФФИ, № 13-03-00360а «Развитие аналитической методологии для расшифровки металлома человека» (2013-2015 гг.); (9) РФФИ, № 14-03-07011д «Нанообъекты в химическом анализе» (2014 г.); (10) РФФИ, № 16-03-00492а «Развитие аналитической методологии для разработки медицинских средств на основе металлосодержащих наноматериалов» (2016-2018 гг.).
Основные результаты работы представлены на Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 1997), Межвузовской конференции «Молодежь и наука на пороге ХХI века» (Саратов, 1998), Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998), Международном конгрессе по ионообменной хроматографии «ICIC-98» (Япония, Осака, 1998), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (С.-Петербург, 1998), Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999), Межвузовской конференции «Мустафинские чтения» (Саратов, 1999), VII Всероссийской конференции «Органические реагенты в аналитической химии» (Саратов, 1999), Международном симпозиуме по высокоэффективным методам разделения «Балатон Симпозиум-99» (Венгрия, Шиофок, 1999), Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 2000), 10-м Российско-японском симпозиуме по аналитической химии (RJSAC 2000, Москва-С.-Петербург, 2000), Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, 2002), 7-м и 8-м Российско-германско-украинском симпозиумах (ARGUS 2001, Байкальск, Россия; 2003, Гамбург, Германия), Международном рабочем совещании «COST D20 mid-term evaluation meeting» (Триест, Италия, 2003), Международном симпозиуме «Аналитический форум 2004» (Варшава, Польша, 2004), Международной конференции «First European Conference on Chemistry for Life Sciences» (Римини, Италия, 2005), Международном симпозиуме «Novel Approaches for the Discovery and
the Development of Anticancer Agents» (Вена, Австрия, 2005), Международной конференции «European Winter Conference on Plasma Spectrochemistry» (Будапешт, Венгрия, 2005), Всероссийской конференции «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2005), Международном конгрессе о аналитическим наукам (ICAS-2006, Москва, 2006), Всероссийской конференции «Химический анализ», 32 Годичной сессии научного совета по аналитической химии (Москва, 2008), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), XVIII Международном симпозиуме «Electro- and Ligand-Phase Separation Techniques» (Тбилиси, Грузия, 2011), Международной польско-германской конференции масс-спектрометрического сообщества (Познань, Польша, 2012), II и III Всероссийских конференциях «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2013 и 2017), Международной конференции «European Winter Conference of Plasma, Spectrochemistry» (Краков, Польша, 2013), XXIX Международном симпозиуме по хроматографии (Торунь, Польша, 2012), V Форуме по капиллярному электрофорезу (Йена, Германия, 2013), IV Международном симпозиуме по металломике (Овьедо, Испания, 2013), XX Международном симпозиуме «Electro- and Liquid-Phase Separation Techniques» (Тенерифе, Испания, 2013).
Публикации. Соискатель имеет 90 опубликованных работ; по теме диссертации 54 работы, из них 17 научных статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, в том числе 13 работ в зарубежных научных изданиях и одна глава в монографии. Более 30 работ по теме диссертации опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.
Личный вклад автора состоит в постановке основных целей и задач, анализе данных и подготовке обзора литературы, непосредственном участии в выполнении экспериментальных исследований, обработке, обобщении и систематизации полученных результатов, формулировке выводов. Результаты экспериментальных исследований и теоретических обобщений изложены в публикациях и научных докладах, подготовленных как индивидуально, так и в соавторстве с коллегами.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, списка литературы. Работа изложена на 256 страницах, содержит 23 таблицы, 61 рисунок, список литературы из 348 наименований.
Капиллярный электрофорез в вещественном анализе противоопухолевых препаратов на основе рутения
Металлосодержащие противоопухолевые препараты являются одними из перспективных в терапии раковых опухолей, начиная с исторически первого применения цисплатина [53; 54; 120]. Однако высокая токсичность соединений платины(II) и резистентность лекарств остается на сегодня одними из основных проблем [55], инициирующих поиск новых универсальных противоопухолевых неплатиновых препаратов с направленным действием и меньшими побочными эффектами.
Первые систематические исследования рутениевых комплексов и их противоопухолевых свойств проводились в начале 80-х годов с соединениями, содержащими лиганды по аналогии с цисплатином: fac-[RuCl3(NH3)3] cis-[RuCl2(NH3)4]Cl [121]. Дальнейшие попытки получения перспективных рутениевых соединений привели к синтезу таких соединений как: (H2im[trans-RuCl4(Him)(DMSO)] [122] (NAMI-A) (Him=имидазол) (Рисунок 1.2) и КР 1019 (или FFC14А) [54; 122; 123].
Успешное применение КЭ-ИСП-МС для платиновых металлокомплексов дало основание для распространения используемой методологии на системы с рутенийсодержащими металлами. С целью характеристики связывания металлолекарств с биомолекулами был расширен круг изучаемых белков и компонентов плазмы, адаптированы условия, проведено моделирование внутриклеточной среды in vitro и ex vivo анализа комплексов [78].
Стоит отметить, что в работах сделан акцент на изучение взаимодействия рутениевых соединений с транспортным белком трансферрином, аддукт с которым считается основным способом переноса металла через клеточный барьер. Альбумин по причине его доминирования в плазме рассматривали лишь как конкурирующий агент связывания металлолекарств. По-видимому, альбуминовые аддукты не являются активными участниками противоопухолевой терапии. Из работ, посвященных трансферрину, выделяется изучение взаимодействий комплексов с апо-формой белка. В то же время показано, что эффективность подавления роста раковых (human colon cancer) клеток кишечника типа SW 707 выше у рутениевого аддукта холо-трансферрина по сравнению с апо-трансферрином [124]. Это дает основание предположить, что захват клетками Ru(III) происходит по механизму поступления в клетку Fe(III): посредством связывания лекарственного препарата в кровотоке с Fe2Tf, его транспортом до клетки, взаимодействием со специфичным трансферриновым рецептором на поверхности мембраны и перемещением в цитоплазму эндоцитозом рецепторно-опосредованным способом [124]. Следовательно, принимая во внимание факт повышенного содержания рецепторов трансферрина в раковых клетках, по сравнению со здоровыми, наряду с апо-трансферрином, важно изучать взаимодействие холо-трансферрина и соединений Ru(III).
Комплексное соединение транс-[тетрахлоридо бис(1Н-индазол)рутенат(III)] индазолиния - КР1019 (Рисунок 1.2) - является первым перспективным исследуемым в настоящее время рутенийсодержащим препаратом [125] из более чем 100 испытанных комплексов рутения, дошедшим до I стадии клинических испытаний [48; 54; 122; 123; 126]. Он обладает доказанным эффектом в отношении рака толстой кишки [127; 128], раковых клеток, резистентых к цисплатину [129; 130], различных первичных форм рака. Показано, что данный комплекс рутения менее токсичен по сравнению с платиновыми соединениями [130].
Другое соединений - NAMI-A (Рисунок 1.2) - в доклинических испытаниях показал ярко выраженный эффект в подавлении метастаз [122; 131]. В настоящее время большое количество комплексов рутения продолжают синтезироваться, изучаются их свойства (склонность к гидролизу, окислительно-восстановительные характеристики, реакционная способность по отношению к белкам и ДНК) и выявляются зависимости структура-свойство применительно к терапии раковых заболеваний. Для оценки фармакокинетики рутениевых препаратов, вводимых пациентам со скоростью 10 мл/мин общим количеством от 25 до 600 мг, использовали образцы плазмы и ультрафильтрата плазмы с последующим их анализом методом ААС на содержание рутения. По результатам был сделан вывод о преобладании фор препарата в виде аддуктов с белками [48]. Однако, для выявления белков, с которыми идет связывание металлосодержащих препаратов, такой метод анализа не подходит.
В связи с этим были изучены возможности метода КЭ и продемонстрировано его применение в вещественном анализе для ряда противораковых соединений рутения(III) в модельных растворах [90; 132], а затем в in vivo условиях для КР1339 [133]. Методом КЭ-ИСП-МС показано, что в равновесных условиях при моделировании взаимодействий в кровяном русле практически весь рутений (более 98%) находится в связанном с альбумином состоянии [52; 104; 105; 134; 135]. Факт преимущественного связывания комплекса рутения с альбумином объясняется доминирующим присутствием последнего над другими белками в плазме: его в 4 раза больше, чем IgG и в 20 раз –чем трансферринома [136].
Результаты хорошо согласуются с данными, полученными в варианте молекулярно-ситовой хроматографии с ИСП-МС. Они также указывают на связывание только около 1 % общего количества КР1019 с трансферрином [137]. В дальнейшем в ходе клинических испытаний in vivo подтверждено существование рутения преимущественно в виде аддукта с альбумином [126; 52]. Однако, предполагается, что 1-2% от общего введенного количества металлокомплекса, присутствующего в кровяном русле в виде трансферринового аддукта, поставляется в раковую клетку и является достаточным для проявления терапевтического эффекта. Установлено, что образование аддуктов с белками, в частности с альбумином, стабилизирует рутениевый комплекс относительно возможных лигандообменных превращений в присутствии других компонентов крови, например, аскорбиновой кислоты [88]. КЭ-ИСП-МС адаптирован в вещественном анализе свободных и связанных с нуклеозидами форм рутениевых лекарственных комплексов, позволяя оценивать устойчивость соединений к гидролизу [94; 100; 138]. Молекулярно-ситовая хроматография с ИСП-МС и КЭ-ИСП-МС были применены при изучении распределения KP1339 в плазме мышей. Данный комплекс является аналогом КР1019, отличающийся противоионом: вместо катиона индазолия введен катион натрия, повышающий в 35 раз растворимость препарата в водных средах по сравнению с КР1019 [133]. Отмечается, что доля высокомолекулярных белков (более 100 кДа) в плазме растет пропорционально вводимым дозам препарата, что может быть связано с влиянием рутениевого комплекса на процессы агломерации за счет перекрестного сшивания. При этом KP1339, также как и другие рутениевые препараты, преимущественно связывается с альбумином, а содержание трансферринового аддукта находится ниже пределов его определения.
Помимо проблемы с воспроизводимостью результатов, наличие интерфейса приводит к разбавлению образца в КЭ-ИСП-МС подпитывающим раствором (sheath liquid) и росту пределов обнаружения, например, в 12 раз по сравнению с 2-D хроматографией (120 и 10 мг/г для рутения) [138]. Факт потери чувствительности необходимо учитывать при работе с реальными объектами, по причине образовании аддуктов металла с биомолекулами в следовых концентрациях на уровнях, близком к ПрО.
Как уже было отмечено, наиболее вероятной формой переноса КР1019 в цитозоль через липидный бислой считается его аддукт с трансферрином [139, 140]. Далее, окружающая среда цитозоля способствует высвобождению рутениевого комплекса из аддукта с белком и последующему взаимодействию с мишенью, например, ДНК [115] или другими компонентами раковой клетки. По аналогии с механизмом переноса железа, предполагается, что наиболее вероятно идет восстановление рутения(III) до рутения(II) в клетке [141, 142], сопровождающееся отщеплением индазольной группы [143146]. Однако подобному поведению рутения, а именно, его активации через восстановление, на сегодня еще нет подтверждения [147], поскольку нет прямых доказательств протекания восстановительного процесса.
Одним из фактов, косвенно указывающих на гипотезу о действии рутениевого комплекса через этап восстановления металла, является увеличение реакционной способности комплекса рутения по отношению к 5 -гуанозинмонофосфату в присутствии аскорбиновой кислоты и глутатиона [115]. Так, при изучении возможных трансформаций КР1019 методом КЭ-ЭРИ-МС в условиях, моделирующих цитозоль, было установлено восстановление Ru(III) до Ru(II) под действием глутатиона, являющегося мощным антиоксидантом естественного происхождения и представляющего потенциальный интерес в химиотерапии [115]. Восстановление КР1019 протекает в буферных при pH 6,0 и небуферных (pH 3,5) водных растворах и под действием аскорбиновой кислоты [115]. Обращает на себя внимание факт, что в данной работе моделировалась форма рутения, соответствующая исходному комплексу. В реальных же условиях маловероятно существование препарата в цитозоле в неизменном состоянии. Сочетание КЭ с ЭРИ-МС применяли с целью идентификации аддуктов образующихся нуклеотидов и комплекса [115]. Найдено, что цитотоксичность комплекса возрастает в присутствии 50 мкM аскорбиновой кислоты [148].
Капиллярный электрофорез с масс-спектрометрическим детектированием с индуктивно-связанной плазмой и формы существования комплекса рутения при взаимодействии с белками крови
Наряду с платиновыми, к перспективным металлосодержащим противоопухолевым комплексам относят рутениевые соединения, в частности, [транс-тетрахлоробис(1Н-индазол)рутенат(III)] индазолиния (Рисунок 2.1) (КР1019), дошедший до стадии клинических испытаний. Он намного быстрее взаимодействует с белками, по сравнению с платиновыми комплексами [104; 105; 159]. Важность железосодержащего трансферрина в доставке металла в клетку и большой потенциал транспорта КР1019 через мембранный барьер именно с участием холотрансферрина трудно переоценить. Известно, что холо-трансферрин имеет большее сродство к рецепторам трансферрина по сравнению с апо-формой, не содержащей железа, или с одним атомом железа в молекуле [64]. Принимая во внимание факт повышенного содержания рецепторов трансферрина в раковых клетках по сравнению со здоровыми, можно полагать, что при образовании аддукта КР1019 с холо-формой белка повышается вероятность захвата клетками Ru(III).
Однако, взаимодействие КР 1019 с холо-трансферрином на момент проведения экспериментов не изучалось. Применение КЭ-ИСП-МС должно было ответить на ряд вопросов: а) идет ли образование аддукта рутениевого комплекса с холо-трансферрином; б) возможно ли найти дополнительные способы подтверждения связывания белка с металлокомплексом; и в) получить информацию о состоянии железа в процессе аддуктообразования с рутением. Это могло помочь в решении следующих задач: а) изучении трансформации форм рутения в процессе инкубации и оценке параметров связывания с холо-трансферрином; б) проведении сравнительной оценки кинетики образования аддуктов апо- и холотрансферрина с КР1019.
Выбор фонового электролита и среды инкубации
Согласно данным литературы, в физиологическом растворе (0.1 моль/л NaCl, 4 ммоль/л NaH2PO4, 25 ммоль/л NaHCO3 – pH 7,4) реакция между КР1019 и апо-трансферрином протекает за 5 мин [122; 295]. Показано, что присутствие карбонат-иона в инкубирующем растворе необходимо для поддержания высокой скорости взаимодействия белков с противоопухолевым комплексом [122; 301]. Однако недостаток этого раствора состоит в его невысокой буферной емкости при инкубации компонентов реакции [88].
Для оптимизации условий инкубации аддуктов и улучшения условий разделения форм рутениевого комплекса методом КЭ были апробированы биосовместимые буферы Гуда на основе HEPES (pH 7,4) и MES (pH 6,0), применяемые в экспериментах с клеточными культурами. Однако при использовании указанных сред КР1019 детектируется в виде сдвоенных пиков, сигнал аддукта малоинтенсивен и отсутствует воспроизводимость времен миграции. Вероятно это связано с быстрым процессом гидролиза пробы КР1019 в капилляре в процессе КЭ эксперимента за счет различия концентраций хлоридов пробы (100 ммоль/л NaCl) и фонового электролита (4 ммоль/л NaCl) и рН.
Поиск условий инкубации и разделения с привлечением биосовместимых буферов Гуда для проведения реакций между КР1019 и белками не позволил улучшить слабый сигнал образующегося аддукта, эффективность разделения и воспроизводимость времен миграции. Далее в работе для получения аддуктов рутениевого комплекса и изучения изменения форм использовали фосфатный буферный раствор для инкубации, являющийся наиболее часто применяемой модельной средой для платиновых и рутениевых комплексов [88; 89; 104; 132].
Отметим, что КР1019 очень неустойчив в растворах для инкубации, что требует смешивания растворов КР1019 и белка сразу после приготовления. Так, после растворения металлокомплекса в среде фосфатного буфера в присутствии 100 ммоль/л хлорида натрия через 1,5 ч наблюдалось уменьшение площади исходного соединения до 10-20 % от первоначального значения (Рисунок 3.4). На электрофореграммах детектировались продукты гидролиза в виде трех различных форм рутения.
Взаимодействие комплекса рутения с апо- и холотрансферином
Для получения сравнительных характеристик связывания нами в одинаковых условиях получены аддукты апо- и холо-трансферрина с КР 1019 при соотношениях белок:комплекс 1:2, 1:1 и 2:1 и рассмотрена кинетика их образования.
Процесс образования аддукта апо-трансферрина наблюдали в течение 8 ч, регистрируя изменения методом КЭ-ИСП-МС. Помимо основного пика аддукта, образовывались промежуточные соединения рутения, вероятнее всего отвечающие гидролизованным формам или аквакомплексам металла. Для проверки предположения о низкомолекулярных промежуточных соединениях была проведена ультрафильтрация: в надмембранной фракции на электрофореграмме 102Ru присутствовал только один пик, отвечающий высокомолекулярному аддукту (Рисунок 3.5 В).
Образование аддукта КР1019-апо-трансферрин. Условия инкубации: 37 C, 10 ммоль/л фосфатный буферный раствор (pH 7,4, 100 ммоль/л NaCl) при соотношении компонентов реакции KP:апо-трансферрин (1:2)
Как видно из графика на Рисунке 3.6, аддуктообразование КР1019 с апо-трансферрином на 90 % проходит за 4 ч. Далее реакция замедляется и 98 % аддукта регистрируется через 7,5 ч. Каких-либо изменений в последующие 7 ч наблюдения не происходит.
Полученные результаты согласуются с исследованиями [302], в которых указывается время образование связанных форм рутения с белками при взаимодействии KP1019 с сывороткой крови в течение 23 ч в количестве 70-80 % от исходного. В работе [105] образец также инкубировали 4 ч для получения аддукта апо-трансферрина и КР1019, известно проведение реакции менее чем за 1 ч [104; 159]. В последнем случае небольшое время инкубации может объясняться использованием среды, содержащей мицеллы [104], а эффект ускорения реакции взаимодействия за счет микроконцентрирования реагентов внутри мицелл. Кроме того, взаимодействие изучалось непосредственно в капилляре с использованием больших концентраций KP1019 с применением УФ-детектирования [132].
Из Рисунка 3.7 видно, что образование аддукта КР1019 с холо трансферрином в соотношении компонентов KP1019 : холо-трансферрин (1:2)
проходило в течение 1 ч. При этом реагировало 97 % рутения от исходного количества, из чего можно сделать вывод о более быстром (в 4 раза) взаимодействии КР1019 с холо-трансферрином, по сравнению с апо-формой.
Отличие в кинетике взаимодействия комплексов рутения с апо- и холо транферрином в сторону более быстрого образования аддуктов холо трансферрина отмечается в литературе для [RuCl2(6-толуол)(1,3,5-триаза-7 фосфаадамантан)] (RAPTA), что было установлено с использованием метода молекулярной ситовой хроматографии с ИСП-МС [303].
Из литературы известно, что N-гетероцикл остается связанным с рутением при присоединении комплекса KP1019 к апо-трансферрину [301]. Однако, присоединение с сохранением лиганда реализуется не всегда. Так, например, несмотря на схожесть Ru(III) и Fe(III), комплексы Fe-ЭДТА или Fe-нитрилотриацетат при реакции с апо-трансферрином теряют соответствующий лиганд [301]. В случае аддуктообразования холо-трансферрина можно предположить аналогичное апо-трансферрину взаимодействие с комплексом рутения. Более быстрое, по сравнению с апо-формой, присоединение KP1019 может объясняться кооперативным эффектом присутствия железа в молекуле трансферрина, приводящее к конформационным изменениям белка, способствующим ускорению реакции присоединения.
Для полного образования аддукта (реакции КР1019 на 99%) при мольном избытке комплекса над белком (соотношение 2:1), требовалось 2,3 ч инкубации (Рисунок 3.8), т.е. больше времени, по сравнению проведением реакции при двукратном мольном избытке холо-трансферрина над КР1019. Результаты позволяют заключить, что аддуктообразование КР1019 с холо-трансферрином проходит быстрее, чем с апо-формой. На Рисунке 3.8 представлены промежуточные формы рутения, регистрируемые на электрофореграммах в процессе образования аддукта из исходного комплекса металла.
Таким образом, для получения аддукта холо-трансферрина с комплексом рутения требуется от 1 до 2,5 ч инкубации в зависимости от мольного соотношения белок - рутений в растворе. Для оценки реакционной способности была рассчитана константа скорости реакции взаимодействия. Полученное значение /с =0,101±0,008 min- (n=9) соизмеримо с имеющимися данными -1 связывания апо-формы с КР1019: /t=0,093±0,002 min , также рассчитанными с применением метода КЭ-ИСП-МС [159].
Для оценки знака заряда образующихся форм применялся стандартный подход с определением скорости ЭОП по времени миграции нейтрального маркера, в качестве которого использовали ацетон ( дт 262 нм) (Рисунок 3.9 A). Его можно добавлять в пробу в меньших количествах, по сравнению, например, с метанолом ( дт 214 нм).
Идентификация низкомолекулярных форм рутения продуктов взаимодействия аддукта холо-трансферрина и транс-[тетрахлоридо бис(1Н-индазол)рутенат(III)]индазолиния с цитозольными компонентами методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением
Как правило, элементоспецифичные детекторы, к которым относится ИСП-МС, не позволяют идентифицировать химические формы. С помощью КЭ-ИСП-МС мы можем получать информацию о количестве металлсодержащих форм и концентрации металла. Сгорание матрицы в высокотемпературной плазме не позволяет фиксировать окружение металла, поэтому при решении задач идентификации форм элементов привлекают другие методы аналитической химии или прибегают к определенным приёмам для идентификации органических аналитов. В случаях, когда идентификация по временам удерживания невозможна и нет стандартов определяемых веществ, широко используют методы структурного анализа. Например, для этих целей часто применяют масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ЭРИ-МС) [28]. Данный метод позволяет получить информацию о молекулярной массе соединения. Более того, для структурной идентификации химических форм еще более информативна тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ЭРИ-МС/МС) [28].
До настоящего времени нет однозначно доказанного механизма поступления в клетку рутениевых препаратов и их активирования [147; 315]. Согласно наиболее общей концепции транспорта, считается, что рутенийсодержащие препараты могут поступать по трансферриновому пути с участием специфичных к белку рецепторов на поверхности мембраны. И, подобно ионам железа, происходит восстановление освобожденного Ru(III) до Ru(II) - так называемая стадия активирования. В данном разделе описана идентификация и предполагаемый состав низкомолекулярных форм рутения, образующихся в присутствии основных клеточных восстановителей – глутатиона и аскорбиновой кислоты.
ЭРИ-МС и ЭРИ-МС/МС. Образец в масс-спектрометр с ионизацией электрораспылением вводили напрямую после инкубации аддукта с цитозольными компонентами и процедуры ультрафильтрации (10 кДа) без разделения в КЭ. Это связано с тем, что МС с электрораспылением характеризуется меньшей чувствительностью определения по сравнению с ИСП-МС. Поэтому образец вводили напрямую в детектор, избегая тем самым его разбавления. Так, в ЭРИ-МС проба вводится шприцем со скоростью 18 мклмин-1, а при сочетании с КЭ скорость ЭОП равна 2,8102 нлмин-1. При этом элюент, как правило, разбавляется подпитывающим раствором (make-up solution) более чем в 20 раз перед вводом в детектор.
Известно, что для эффективной ионизации в ЭРИ-МС необходимо присутствие летучих растворителей, в числе которых, в основном, используют органические вещества, такие как ацетонитрил и метанол. Поскольку кислотно-основные равновесия, происходящие в жидкой фазе, отражаются на масс-спектре и зависят от используемого растворителя, было оценено влияние метанола и ацетонитрила на получаемый сигнал. Найдено, что метанол образует агломераты с соединениями рутения, приводящие к сложным для интерпретации сигналам масс-спектра. В тоже время ацетонитрил в концентрации 30 % приводил к увеличению отношения сигнал/шум с 11 до 360 для иона [GSH + H]+ с m/z 308 (GSH=глутатион).
В Таблице 5.4 представлены основные ионы, полученные при положительной и отрицательной ионизации, а также в варианте МС/МС. При изучении влияния лимонной кислоты на состояние аддукта холо-трансферрина и КР1019 МС результаты ультрафильтрата не показали наличия в спектрах сигналов изотопного распределения, характерного для рутения. Это говорит об отсутствии низкомолекулярных форм и, следовательно, сохранении целостности аддукта в присутствии лимонной кислоты, что находится в соответствие с КЭ-ИСП-МС данными, согласно которым новых пиков рутения в ультрафильтрате не обнаруживалось.
При изучении влияния аскорбиновой кислоты сигнал с m/z 408 (Рисунок 5.15 (A) регистрировался в режиме положительной ионизации, что подтверждает наличие высвободившегося рутения в низкомолекулярной фракции. Изотопный профиль рутения отвечает однозарядному иону с наиболее вероятной структурной формулой гидролизованного комплекса [Ru(III)Ind2(OH)2(H2O)2]+, отличающейся от исходного соединения [Ru(III)Ind2Cl4]- знаком заряда и координированными лигандами. Второй характеристичный сигнал m/z 291 детектировался в растворе при инкубации аддукта с аскорбиновой кислотой (Рисунок 5.15 (A) и глутатионом.
Как и в первом случае, изотопное распределение рутения отвечает однозарядному иону, образующемуся, вероятно, путем отщепления индазольной группы и сопровождающееся восстановлением рутения с предположительной структурной формулой иона [Ru(II)Ind(OH)(H2O)3]+.
Для сигнала масс-спектра m/z 289, найденного в режиме отрицательной ионизации, форма комплексного иона имеет вид [Ru(II)Ind(OH)(H2O)32H+]-. Для подтверждения структур была применена тандемная ЭРИ-МС/МС ионов с m/z 291 и 408, которые давали фрагменты в масс-спектре с m/z 173 и 290, соответственно (Рисунок 5.15 и Таблица 5.4) за счет отщепления протонированного индазольного лиганда m/z 119 [Ind+H]+. Потеря индазольного лиганда в реакционной ячейке не сопровождалась восстановлением рутения.
Поскольку ион m/z 291 образуется в присутствии аскорбиновой кислоты и глутатиона и характеризуется одинаковой фрагментацией в варианте МС/МС, он может быть отнесен к пику 2 на электрофореграмме КЭ-ИСП-МС (Рисунок 5.13). Сигнал с m/z 291 соответствует продукту распада, который генерируется в процессе ионизации, во время которой нельзя исключить восстановление рутения в ионизационной камере. Отсутствие в спектре сигнала m/z 175, отвечающего окисленной форме аскорбиновой кислоты (дегидроаскорбиновая кислота), косвенно указывает на то, что данный компонент не участвует в восстановлении рутения.
Стоит отметить, что приписываемые структуры сигналов рутениевых образцов в масс-спектрах, полученные в присутствие глутатиона, отличаются от таковых при инкубации с аскорбиновой кислотой. В первом случае ионы содержат хлорид в качестве одного из лигандов, во втором – гидролизованные продукты (Таблица 5.4, Рисунок 5.16).
Три различные группы ионов с изотопным распределением рутения получены в масс-спектре с m/z 335, 487 и 1381 в режиме отрицательной ионизации. В образцах, содержащих рутений, в присутствии глутатиона генерируются двухзарядные ионы, на что указывает разница на единицу (не две единицы) между наиболее интенсивными сигналами изотопного профиля рутения. Принимая во внимание данное наблюдение, ионам с m/z 335 и 487 могут быть приписаны структуры [Ru(II)IndCl4(GSH) и [Ru(II)IndCl4(GSSG) , соответственно, где GSSG - окисленная форма глутатиона. Вывод частично подтверждается экспериментами с МС/МС фрагментацией, при которой исходные ионы с m/z 335 и 487 дают вторичный ион с m/z 181, предположительно [Ru(II)Cl4Ind] ) (MW/2=180.5). Присутствие глутатиона в качестве одного из лигандов в структуре подтверждается наличием сигнала с m/z 306 в режиме MS/MS. Оба сигнала дают также однозарядные ионы при положительной ионизации с m/z 672 и 977 (Таблица 5.4).
При сравнении с результатами ИСП-МС и КЭ-ИСП-МС сигналы с m/z 335 и 487 могут быть соотнесены с пиками 3 и 4 на электрофореграммах (Рисунок 5.13), детектируемыми в течение первых часов инкубации аддукта холо-трансферрина и комплекса рутения в присутствие глутатиона и соответствующие низкомолекулярной фракции с MW 10 кДа. Далее, после 8 ч инкубации, растет сигнал с m/z 1381 с изотопным распределением, соответствующим 1 атому рутения. Это может указывать на процессы агломерации, что также подтверждалось ультрафильтрацией при использовании фильтров с различными размерами пор. Моноизотопный ион 2762 может представлять агломерат [RuIndCl2(OH)(GSSG) + 6GSH + H] . Присутствие окисленной формы глутатиона GSSG подтверждается существованием вторичных ионов с m/z 611 и 1076 в МС/МС спектрах (Таблица 5.4). Другой дочерний ион с m/z 463 получается при отщеплении одной молекулы GSSG и двух глутатиона (Таблица 5.4 и Рисунок 5.16). Нельзя исключить частичное образование окисленного глутатиона процессом автоокисления, количество которого было определено ранее и достигало 26 % через 20 ч при рН 6 и 37 C от исходного значения [115].
Состояние платиновых металлов и их каталитическая активность в реакции окисления N-метилдифениламин-4-сульфокислоты
Изучение состояния родия(III) в кислых растворах методом КЭФ показало, что природа и концентрация кислот оказывают существенное влияние на его химические формы. Последние могут определять реакционную способность растворов родия(III) в процессах ионного обмена, экстракции и комплексообразования, а также его каталитическую активность. Интересным может явиться установление связи состояния родия(III) и некоторых других платиновых металлов именно с каталитической активностью, поскольку это позволит проводить направленный выбор катализатора, регулирование селективности и чувствительности определения металла.
Для выявления связи состояния родия(III) и других металлов в растворах с их реакционной способностью выбрана достаточно хорошо изученная на примере иридия реакция каталитического окисления МДФАСК периодатом калия в слабокислой среде. Нами оценено влияние химических форм металлов, существующих в растворах различных кислот, на скорость указанной реакции (в Таблице 7.5).
Из Таблицы 7.5 следует, что каталитическая активность родия(Ш) уменьшается в ряду кислот: хлорная азотная хлороводородная серная. Таким образом, максимальный каталитический эффект проявляет раствор перхлората родия (III), в котором катализатор, согласно данным, полученным методом КЭ, существует только в виде катионных форм. Снижение доли последних, при одновременном увеличении содержания нейтральной формы в азотнокислом растворе сопровождается уменьшением скорости реакции.
Особенно сильное уменьшение каталитической активности родия(III) характерно для солянокислого раствора, в котором преобладает нейтральная форма. Таким образом, выявлена четкая закономерность: чем меньше концентрация положительно заряженных форм родия (III), тем меньше скорость каталитической реакции.
В растворе родия(III), обработанном концентрированной серной кислотой, обнаружены только отрицательно заряженные формы и полное отсутствие каталитической активности родия(III).
Основной вывод, который следует из сопоставления результатов каталитического и электрофоретического экспериментов состоит в том, что каталитической активностью в реакции окисления МДФАСК в слабокислой среде обладают только катионные формы родия (III).
Полученный результат имеет важное значение, поскольку хорошо согласуется с представлением об электронном строении реакционного центра МДФАСК атоме азота. Наличие на нем неподеленной электронной пары обуславливает, как показывают квантовохимические расчеты молекулярного электростатического потенциала, существование области отрицательного значения потенциала и его контакт с положительно заряженной формой родия(III) весьма вероятен.
Для подтверждения механизма каталитического действия именно катионной формы родия, нами оценивалось влияние на скорость реакции окисления МДФАСК других металлов (марганца, иридия, платины, палладия и золота). По аналогии с растворами родия(III) сопоставляли состояние указанных металлов, оцененное методом КЭ, с их каталитической активностью (Таблица 7.5). Отрицательно заряженные комплексы платины и палладия, иридия и золота вне зависимости от природы кислоты, в которой эти формы существуют, каталитическим действием не обладают. При этом после перевода иридия в положительно заряженные формы обработкой хлорной кислотой достигали высокий каталитический эффект реакции, который на два порядка превышал таковую для хлорнокислых растворов родия (Таблица 7.5). Попытка перевести платину и золото в другие формы путем обработки хлорной кислотой успеха не имела вследствие образования осадков.
Таким образом, сопоставление результатов кинетического и электрофоретического экспериментов, а также квантовохимические данные о состоянии МДФАСК в слабокислой среде, позволили нам сделать заключение о том, что каталитической активностью в данной реакции обладают положительно заряженные формы металла.
Полученный результат позволил нам предложить реакцию окисления МДФАСК в слабокислой среде для каталитического определения родия(III) и указать хлорную кислоту в качестве среды, в которой он проявляет наивысшую активность.
Исследованы факторы, влияющие на скорость каталитической реакции окисления МДФАСК периодатом калия в присутствии перхлоратных комплексов родия(III). Максимальная скорость реакции наблюдается в интервале рН 2,42,7 при 30- и более кратных избытках окислителя (периодата калия) по отношению к МДФАСК.
Методом фиксированного времени показано, что влияние ионной силы на скорость каталитической реакции наблюдается при концентрации индифферентного электролита выше 0,01 моль/ и достигает максимального и практически постоянного значения при концентрации больше 0,3 моль/л.
Показано, что изменение температуры в интервале 2035 0С не оказывает существенного влияния на скорость процесса. Это позволяет исключить термостатирование при проведении реакции.
Интервал определяемых концентраций родия (III), в котором соблюдается линейность градуировочного графика, составляет 0,020,5 мкг/мл.
Найдены факторы селективности определения родия(III) по каталитической реакции окисления МДФАСК для ряда сопутствующих ионов металлов. Установлено, что многие переходные и платиновые металлы, например, Cu(II), Zn(II), Pb(II), Al(III), Cr(III), Ni(II), Co(II), Pt(IV), Pd(II), Ag(I), Au(III) не оказывают мешающего действия при 103104 кратных избытках по отношению к родию. При любых соотношениях мешают иридий и рутений. Однако нами показано, что предварительная обработка раствора хлорной кислотой позволяет устранить мешающего влияния обоих ионов металлов и сделать указанную реакцию определения родия(III) селективной.
Известно, что на каталитическую активность, а, следовательно, и на скорость реакции может оказывать влияние присутствие органических реагентов, способных образовывать комплексы с катализатором. В связи с этим, апробировано влияние о-фенантролина, а,а - дипиридила на указанную каталитическую реакцию. Показано, что о-фенантролин и а,а -дипиридил обладают активирующим действием, причем первый является лучшим активатором. Для выявления компонента реакции, на состояние которого оказывает влияние активатор, методом КЭ проанализированы смеси веществ, содержащие пары родий-активатор, периодат калияактиватор и МДФАСК-активатор. Изменения электроферограмм отдельных компонентов реакции в присутствие активаторов не наблюдалось. Это позволяет сделать предположение, что действие активатора проявляется только в процессе протекания реакции, например, на состояния катализатора в окисленной форме.
Предложенная нами реакция каталитического определения родия(III) апробирована на искусственной смеси и образце сложного состава КП-5 (Таблица 7.6)