Разработка высокочувствительной методики качественного определения гибридного белка эритропоэтина, слитого с Fc-частью иммуноглобулина G человека (ЭПО-Fc), в образцах сыворотки крови с целью антидопингового контроля Постников Павел Викторович

Содержание к диссертации

Введение

1 Аналитический обзор литературных данных 13

1.1 Гибридные Fc-белки с терапевтической активностью 13

1.2 Строение, получение и свойства ЭПО-Fc 20

1.3 Механизм связывания Fc-гибридов с FcRn-рецептором 26

1.4 Механизм FcRn-опосредованного рециклирования и трансцитоза IgG и

Fc-содержащих белков 32

1.5 Сайты взаимодействия молекул IgG с Clq компонентом системы комплемента и FcR-рецепторами 34

1.6 Регуляция IgG-FcRn взаимодействия и направленная Fc-инженерия 37

1.7 Методы идентификации гибридных белков ЭПО-Fc в современном допинг-контроле 40

1.7.1 Полиакриламидный гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата (SDS-PAGE) и лаурилсаркозината (SAR-PAGE) натрия

1.7.2 Полиакриламидный гель-электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (IEF-PAGE) 46

1.7.3 2D – электрофорез ЭПО-Fc 50

1.7.4 Связывание ЭПО-Fc белками А и G, иммобилизованными на магнитных частицах с последующим количественным определением Fc-гибрида в элюате методом ИФА 51

2 Материалы и методы 53

2.1 Основное/вспомогательное оборудование, материалы, реагенты для идентификации запрещенного эритропоэз-стимулирующего агента – ЭПО Fc методами IEF/SDS/SAR-PAGE 53

2.1.1 Средства измерений 53

2.1.2 Испытательные средства 54

2.1.3 Вспомогательное оборудование 54

2.1.4 Химические реактивы и материалы

2.1.4.1 Исследуемые соединения 56

2.1.4.2 Реактивы 56

2.1.4.3 Материалы

2.2 Приготовление растворов и буферов 59

2.3 Формирование полиакриламидного геля 66

2.4 Приготовление образцов контроля качества

2.4.1 Отрицательный контрольный образец сыворотки (бланк) 68

2.4.2 Положительный контрольный образец сыворотки 68

2.4.3 Положительный контроль – –, –рЭПО 69

2.4.4 Положительный контроль – Аранесп (Дарбепоэтин-альфа, NESP)

2.4.5 Положительный контроль – CERA (Mircera, метокси-полиэтиленгликольэпоэтин-бета) 71

2.4.6 Положительный контроль – ЭПО-Fc 72

2.5 Методы 73

2.5.1 Иммуноаффинная очистка ЭПО-Fc 73

2.5.2 Изоэлектрическое фокусирование EPO-Fc 74

2.5.3 SDS/SAR-PAGE электрофорез EPO-Fc 75

2.5.4 Двойной Вестерн блотинг и визуализация 75

2.5.5 Определение различий в электрофоретической подвижности ЭПО-Fc до и после обработки IdeS-протеазой по сравнению с белками сыворотки крови методом SDS–PAGE 77

2.5.6 Подбор оптимального фермента для гидролиза ЭПО-Fc 78

2.5.7 Идентификация ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови и подбор оптимальных условий гидролиза IdeS-протеазой 79

2.5.8 Триптическое расщепление ЭПО-Fc в растворе 80

2.5.9 Выделение Fc-части из раствора, содержащего продукты гидролиза ЭПО-Fc IdeS-протеазой 81

2.5.10 Сверхэффективная жидкостная хроматография – тандемная

масс-спектрометрия высокого разрешения Fc-части молекулы ЭПО-Fc

3 Результаты и обсуждение 82

3.1 Выбор фермента для гидролиза ЭПО-Fc 84

3.2 Анализ возможных причин неудовлетворительного изоэлектрического разделения ЭПО-Fc 89

3.3 Характеризация электрофоретических профилей ЭПО-Fc после IdeS-гидролиза методами IEF/SDS/SAR-PAGE 98

3.4 Определение оптимальных условий гидролиза ЭПО-Fc 107

3.5 Методика идентификации ЭПО-Fc методом IEF-PAGE с последующим двойным Вестерн блоттингом и хемилюминесцентной детекцией сигнала (полный текст)

3.5.1 Пробоподготовка образцов сыворотки крови 109

3.5.2 Гидролиз в присутствии IdeS протеазы 111

3.5.3 Формирование полиакриламидного геля с градиентом рН 2–6 112

3.5.4 Проведение испытания 112

3.5.5 Интерпретация и представление данных 117

3.6 Валидация основных метрологических характеристик качественного определения ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови 118

3.6.1 Специфичность определения 118

3.5.1 Предел обнаружения 122

3.5.2 Влияние матрицы на изоэлектрическое разделение ЭПО-Fc 123

3.5.3 Степень извлечения 124

3.5.4 Стабильность при хранении образцов 127

Выводы 128

Список использованных источников 130

• Сайты взаимодействия молекул IgG с Clq компонентом системы комплемента и FcR-рецепторами
• Положительный контроль – CERA (Mircera, метокси-полиэтиленгликольэпоэтин-бета)
• Анализ возможных причин неудовлетворительного изоэлектрического разделения ЭПО-Fc
• Формирование полиакриламидного геля с градиентом рН 2–6

Введение к работе

Актуальность

Современный этап развития спорта высших достижений

характеризуется ростом спортивных рекордов, превышающих естественные возможности организма. Физические нагрузки исчерпали адаптационные способности спортсменов, изыскиваются способы улучшения физических возможностей организма и увеличения работоспособности с помощью допинговых средств. В последние годы широкое распространение среди спортсменов получили эритропоэз-стимулирующие агенты (ЭСА), прием которых приводит к увеличению количества эритроцитов и как следствие к повышению кислородной емкости крови и выраженной стимуляции обменных процессов. Развитие фармацевтических технологий привело к созданию новых веществ, обладающих улучшенными биологическими и фармакокинетическими характеристиками по сравнению с ныне известными рекомбинантными эритропоэтинами. К таким веществам относится гибридный белок – ЭПО-Fc, состоящий из 2 молекул эритропоэтина (ЭПО), конъюгированных с димерной Fc-частью IgG1, IgG2 или IgG4 человека, обладающих длительным периодом полувыведения из организма. ЭПО-Fc запрещены к применению с 2012 года в соответствии с Запрещенным списком Всемирного антидопингового агентства (ВАДА).

В современном антидопинговом контроле детекция гибридного ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови осуществляется посредством двух схожих методов – полиакриламидного гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата (SDS-PAGE) или лаурилсаркозината натрия (SAR-PAGE) с двойным Вестерн блоттингом и хемилюминесцентной детекцией. Однако сыворотка крови содержит большое количество белков, имеющих молекулярную массу, сходную с таковой у ЭПО-Fc, которые могут уменьшать селективность определения данными методами за счет неспецифического связывания вторичных антител, используемых во время анализа, с альбуминами или тяжелыми цепями антител, что может проявляться в виде дополнительных неспецифических белковых полос, визуализируемых в зоне детекции ЭПО-Fc. При повторном испытании таких «подозрительных образцов» присутствие запрещенного гибридного белка в образце не подтверждается, что приводит к дополнительным затратам реагентов и времени. Кроме того, возрастает вероятность получения ложноположительного результата. Предпринятые попытки идентифицировать гибридный белок другим методом, изоэлектрическим фокусированием в полиакриламидном геле с градиентом рН 2-6 (IEF-PAGE), в котором детектируются все известные на сегодняшний момент ЭСА, также были неуспешны, не было получено четкого распределения на дискретные

гликоформы белка, что является необходимым требованием Технического документа ВАДА TD2014EPO, регулирующего принципы детекции ЭСА.

Таким образом, разработка новой универсальной высокопропускной антидопинговой методики идентификации присутствия ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови спортсменов является актуальной задачей, особенно в свете последних допинговых скандалов, потрясших мир спорта.

Цель работы заключается в разработке новой универсальной высокочувствительной методики качественного определения присутствия ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови человека с целью антидопингового контроля, основанной на введении в методику дополнительной стадии гидролиза для удаления Fc-фрагмента молекулы. Введение этого этапа позволит охарактеризовать профиль гликоформ гибридного белка и дифференцировать его от эндогенного и иных ЭСА методом изоэлектрофокусирования, ранее не использовавшимся для детекции ЭПО-Fc.

Достижение поставленной цели требует решения ряда задач:

Осуществить выбор оптимального фермента, позволяющего эффективно и специфично удалять Fc-фрагмент гибридной молекулы.

Изучить основные факторы, влияющие на характер распределения гликоформ гибридного белка.

Изучить электрофоретические характеристики ЭПО-Fc после удаления Fc-части.

Подобрать оптимальные условия гидролиза гибридного белка.

Провести валидацию разработанной методики качественного определения ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови человека. Определить метрологические характеристики специфичности, предела обнаружения, влияния матрицы, степени извлечения и стабильности.

Предложить критерии идентификации запрещенного гибридного белка с целью его однозначного определения в современном антидопинговом контроле.

Научная новизна работы:

1. Подобран оптимальный фермент, позволяющий специфично и эффективно удалять Fc-часть молекулы ЭПО-Fc с образованием димерного фрагмента ЭПО, конъюгированного с шарнирной областью IgG.

2. Впервые изучены структура и состав гликанов Fc-части гибридного ЭПО-Fc и основные факторы, влияющие на характер электрофоретического разделения гликоформ гибридного белка. Установлено, что гликаны Fc-части не вносят вклада в суммарный отрицательный заряд молекулы ЭПО-Fc ввиду своей нейтральной природы и не влияют на профиль распределения гликоформ.

3. Впервые изучены электрофоретические характеристики димерного фрагмента (ЭПО-шарнир)₂ по сравнению с эндогенным ЭПО и другими ЭСА, используемыми для детекции рекомбинантных эритропоэтинов в современном антидопинговом контроле.

4. Установлены оптимальные условия гидролиза гибридного белка.

5. Впервые определены специфичность, предел обнаружения, влияние матрицы на изоэлектрическое разделение, степень извлечения и стабильность димерного фрагмента (ЭПО-шарнир)₂, полученного вследствие ферментативного расщепления гибридного белка.

6. Разработаны критерии идентификации и новая высокочувствительная методика детекции ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови посредством изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле с градиентом рН 2-6.

Практическая значимость работы:

1. Разработана ультрачувствительная универсальная методика качественного определения ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови при помощи изоэлектрического фокусирования с двойным Вестерн блоттингом и хемилюминесцентной детекцией сигнала. Она позволит достоверно идентифицировать присутствие гибридных белков и предотвратить их использование в качестве допинговых средств.

2. Показан принципиальный подход по удалению Fc-части молекулы гибридного белка, что может быть использовано для характеризации и идентификации иных Fc-содержащих белков электрофоретическими методами, которые могут быть внесены в Запрещенный список ВАДА в ближайшем будущем.

3. Новая методика внесена в область аккредитации (шифр SOP P1.029), внедрена в практику Федерального государственного бюджетного учреждения «Антидопинговый центр» (ФГБУ АДЦ) и успешно применяется для идентификации гибридного белка ЭПО-Fc в реальных образцах сыворотки крови спортсменов.

Положения, выносимые на защиту:

4. Выбор оптимального фермента для удаления Fc-фрагмента ЭПО-Fc.

5. Анализ возможных причин неудовлетворительного изоэлектрического разделения гибридного белка.

6. Характеризация электрофоретических профилей ЭПО-Fc после удаления Fc-фрагмента методами полиакриламидного гель-электрофореза в

присутствии додецилсульфата, лаурилсаркозината натрия и изоэлектрического фокусирования с целью антидопингового контроля.

4. Выбор оптимальных условий гидролиза ЭПО-Fc.

5. Результаты валидации новой методики качественного определения гибридного белка в образцах сыворотки крови.

Степень достоверности и апробация работы:

Достоверность полученных данных подтверждается использованием
современных физико-химических методов исследования и

высокотехнологичной приборной базы. Правильность детекции димерного
фрагмента ЭПО, конъюгированного с шарнирной областью IgG, определяется
путем сравнения его электрофоретических характеристик после гидролиза
чистых препаратов ЭПО-Fc и модельных образцов сыворотки крови с
добавлением гибридного белка в известной концентрации с

электрофоретическими характеристиками эндогенного ЭПО и иных ЭСА методами изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле и гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата и лаурилсаркозината натрия с двойным Вестерн блоттингом и хемилюминесцентной детекцией.

Результаты исследований, проведенных в рамках данной

диссертационной работы, представлены на всероссийских и международных
конференциях: II Международной научно-практической конференции

«Современная химико-токсикологическая экспертиза» («II International scientific conference ACTE`2015», Москва 6-7 октября 2015 г.), Седьмом съезде Всероссийского масс-спектрометрического общества – VI Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (п. Московский, 12-17 октября 2015 г.), 33 Всемирном Симпозиуме ученых в области антидопингового контроля (33^th Manfred Donike Workshop on Dope Analysis, Recent Advances in Doping Analysis, г. Кельн, 1-6 марта 2015 г.) – заняла первое место наряду с разработкой масс-спектрометрического подхода для детекции пептидов гормона роста, предложенного также специалистами ФГБУ АДЦ.

Публикации. По результатам проведенных исследований были опубликованы: 4 статьи в журналах, входящих в список рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией (ВАК РФ) для защиты диссертаций и базу данных Scopus и Web of Science; 3 тезиса докладов на всероссийских и международных научных конференциях.

Личный вклад автора заключался в постановке цели и задач
исследования, проведении научных экспериментов, систематизации и анализе
полученных результатов, подготовке и написании научных статей,

опубликованных в соавторстве.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературных источников (191 источник). Текст работы изложен на 150 страницах компьютерной верстки, содержит 28 рисунков и 5 таблиц.

Сайты взаимодействия молекул IgG с Clq компонентом системы комплемента и FcR-рецепторами

В некоторых патентах отсутствует какая-либо информация о пептидном линкере и молекулы ЭПО и Fc-фрагмента иммуноглобулина соединены напрямую посредством шарнирной области IgG [30]. Также интересен тот факт, что в молекуле ЭПО, входящей в структуру гибридного белка, может присутствовать C-концевой аргинин, соответствующий положению Arg166. Человеческий эндогенный ЭПО состоит из 165 аминокислотных остатков, хотя синтезируется в виде предшественника, состоящего из 166 аминокислот. При попадании в кровоток или при экскреции в мочу предшественник ЭПО лишается концевой аминокислоты путем ферментативного отщепления с помощью специфического фермента карбоксипептидазы (CpB) [50]. CpB также является одним из важнейших ферментов для превращения проинсулина в инсулин [51,52]. За счет действия CpB у антител после синтеза происходит отщепление C-концевого лизина. Fc-фрагмент IgG в составе гибридного белка не является исключением и лишен терминального остатка Lys с С-конца. В ряде работ было установлено, что в CHO-клетках, рекомендованных FDA для производства биологических субстанций, включая моноклональные антитела, обнаруживается высокая активность карбоксипептидазы [53]. Таким образом, лизин удаляется уже на этапе синтеза Fc-гибрида в культуре СНО-клеток.

Учитывая вышесказанное, можно сказать, что структура ЭПО-Fc может варьировать в зависимости от способа получения и модификаций, вводимых в аминокислотную последовательность. На данный момент подробная структура ЭПО-Fc неизвестна и является собственностью фирм-производителей.

Для получения гибридного ЭПО-Fc белка на первой стадии создают генетическую конструкцию для последующей трансфекции в эукариотические клетки. Ген, как правило, получают путем химического синтеза последовательности отдельных компонентов или на основании генетического материала человека путем амлификации гена ЭПО и фрагмента ДНК Fc-части IgG. При необходимости проводят направленный мутагенез, включают последовательности, кодирующие линкерную область и сигнальный пептид (СП), определяющий направление транспорта секреторного белка внутри просвета эндоплазматического ретикулума клетки после трансляции и способствующий проникновению молекулы сквозь мембрану посредством экзоцитоза во внеклеточное пространство. Рядом исследований было установлено, что различные сигнальные последовательности могут приводить к увеличению секреции белка [54-56]. Было обнаружено, что сигнальные пептиды чрезвычайно гетерогенны, и что многие прокариотические и эукариотические СП являются функционально взаимозаменяемыми, даже между различными видами [57-59]. На основании этих наблюдений, СП из различных видов могут использоваться для экспрессии представляющего интерес гена в определенной системе клетки хозяина. Hesketh с соавторами [60] показали, что не всегда нативные СП, входящие в состав IL-2, CD5, легкой цепи иммуноглобулина каппа, трипсиногена, сывороточного альбумина, пролактина и многих других, являются эффективными по сравнению с таковыми других видов, также опосредующих секрецию в СНО-клетках [56]. Суммируя результаты предыдущих исследований, Kober с соавторами [61] идентифицировали сигнальные последовательности, которые могут быть слиты с рекомбинантными белками для улучшения эффективности их секреции. Из 16 пептидов-кандидатов, относящихся к различным белкам, были отобраны два – MKWVTFISLLFLFSSAYS пре-про-белка сывороточного альбумина человека и MTRLTVLALLAGLLASSRA пре-про-белка азуроцидина. Данные СП значительно увеличивают эффективность экспрессии широкого спектра биофармацевтических белков, включая антитела [61]. Для оптимальной экспрессии ЭПО-Fc в клетках млекопитающих, в плазмиду вкючают последовательность Козака [62, 63]. Полную последовательность рекомбинантного ЭПО-Fc выделяли, амплифицировали и клонировали в экспрессирующий вектор эукариотических клеток pCD1 и др. Внедренная последовательность нуклеиновых кислот в составе плазмиды, была подтверждена ДНК секвенированием [64]. Для экспрессии белка часто используются клетки яичника китайского хомячка (СНО) с дефицитом дигидрофолатредуктазы, одобренные FDA для производства биологических субстанций. Fc-гибриды могут быть экспрессированы в других клеточных линиях, например, BHK, NS/0, однако они будут обладать меньшей биологической активностью, ввиду наличия менее разветвленных гликанов и меньшего содержания остатков сиаловых кислот в структуре молекулы [37]. Подробнее процесс биотехнологического производства гибридного белка ЭПО-Fc описан в ряде патентов США [64-65].

ЭПО-Fc был разработан в качестве эритропоэз-стимулирующего препарата нового поколения с пролонгированным действием. Основная цель приема гибридного белка спортсменами, как и иных эритропоэз стимулирующих агентов, заключается в стимуляции продукции красных кровяных клеток, и как следствие, увеличению кислородной емкости крови и выраженной стимуляции обменных процессов организма. Попадая в организм человека, ЭПО-Fc связывается с рецепторами к ЭПО человека (ЭПО-р), на поверхности клеток эритроидных предшественников (КОЕэ, базофильных эритробластах и проэритробластах) костного мозга. При этом ЭПО-рецептор претерпевает конформационные изменения, димеризуется, и происходит активация цитоплазматических тирозинкиназ (JAK2), инициирующих фосфорилирование как аминокислотных остатков тирозина в составе рецептора, так и внутриклеточных сигнальных белков STAT-5 (Signal transducers and activators of transcriptions) [66,67]. Последние диссоциируют от рецептора, димеризуются, проникают в ядро и запускают процесс транскрипции специфических генов, приводящий к пролиферации и дифференцировке клетки-предшественника (Рисунок 3) [68].

Положительный контроль – CERA (Mircera, метокси-полиэтиленгликольэпоэтин-бета)

Приготовление исходного сток раствора. Предварительно готовили 0.1% раствор БСА/ФБ, затем флакон, содержащий 250 мкг лиофилизата а-, /3-рЭПО (BRP Е1515000, Batch 3.3), выдержали при комнатной температуре около 10 мин, сверяли количество стандарта во флаконе по прилагаемому сертификату, вскрывали и добавляли 2.5 мл 0.1% раствора БСА/ФБ. Далее перемешивали на вортексе и аликвотировали по 12 мкл в микропробирки объемом 0.2 мл. Аликвоты хранили при температуре - 20С не более 6 месяцев. Приготовление рабочего раствора-1 (метод IEF-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 990 мкл 0.1% БСА/ФБ и 10 мкл сток-раствора а-, /?-рЭПО, перемешивали на контактном миксере и хранили при температуре - 20С не более 2 недель.

Приготовление рабочего раствора-2 (метод IEF-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 976 мкл 0.1% БСА/ФСБ и добавляли 24 мкл рабочего раствора-1 а-, ytf-рЭПО, перемешивали на вортексе и хранили при температуре - 20С не более 1 недели.

Приготовление рабочего раствора-1 (метод SAR/SDS-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 990 мкл деионизированной воды и 10 мкл сток-раствора а-, /?-рЭПО, перемешивали на контактном миксере и хранили при температуре - 20С не более 2 недель.

Приготовление рабочего раствора-2 (метод SAR/SDS-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 950 мкл деионизированной воды и добавляли 50 мкл рабочего раствора-1 а-, ytf-рЭПО, перемешивали на вортексе и хранили при температуре - 20С не более 1 недели.

Перед пробоподготовкой образцов в аликвоту отрицательной нулевой сыворотки (1 мл) добавляли 15 мкл раствора-2. Пробоподготовку контрольного образца осуществляли так же, как и образцов анализируемых проб сыворотки.

Приготовление исходного сток – раствора. В качестве исходного сток-раствора брали предзалитый шприц с готовым раствором, содержащий 30 мкг Дарбепоэтина- в 0.3 мл препарата (производство Amgen). Концентрация Дарбепоэтина- в шприце может варьироваться (10-500 мкг). Необходимо следить за концентрацией указанной на упаковке препарата для правильного приготовления рабочего раствора. Аликвотирвоали по 11 мкл в микропробирки объемом 0.2 мл (Maximum Recovery, Axygen).

Приготовление рабочего раствора-1 (метод IEF-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 996.8 мкл 0.1% БСА/ФБ, добавляли 3.2 мкл сток-раствора Аранесп (если концентрация Аранесп в шприце 30 мкг), перемешавали на вортексе и хранили при температуре – 20С не более 2 недель. Приготовление рабочего раствора-2 (метод IEF-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 970 мкл 0.1% БСА/ФБ, добавляли 30 мкл раствора-1, перемешивали на вортексе и хранили при температуре – 20С не более 1 недели. Приготовление рабочего раствора-1 (метод SAR/SDS-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 995 мкл деионизированной воды, добавляли 5 мкл сток-раствора Аранесп (если концентрация Аранесп в шприце 30 мкг), перемешавали на вортексе и хранили при температуре – 20С не более 2 недель. Приготовление рабочего раствора-2 (метод SAR/SDS-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 925 мкл деионизированной воды, добавляли 75 мкл раствора-1, перемешивали на вортексе и хранили при температуре – 20С не более 1 недели. Перед пробоподготовкой образцов в аликвоту отрицательной нулевой сыворотки (1 мл) добавляли 20 мкл раствора-2. Пробоподготовку контрольного образца осуществляли так же, как и образцов анализируемых проб сыворотки.

Приготовление исходного сток–раствора. В качестве исходного сток раствора брали предзалитый шприц, содержащий 0.3 мл CERA (производство Roche, Швейцария). Концентрация CERA в шприце 100 мкг/0.3 мл. Необходимо строго следить за концентрацией указанной на упаковке препарата для правильного приготовления рабочего раствора. Аликвотирвоали по 11 мкл в микропробирки объемом 0.2 мл (Maximum Recovery, Axygen). Приготовление рабочего раствора-1 (метод IEF-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 994 мкл 0.1% БСА/ФБ, добавляли 6 мкл сток-раствора CERA (если концентрация CERA в шприце 100 мкг), перемешивали на контактном миксере и хранили приготовленный раствор при температуре – 20С не более 2 недель. Приготовление рабочего раствора-2 (метод IEF-PAGE). В

микропробирку объемом 1.5 мл вносили 980 мкл 0.1% БСА/ФБ, добавляли 25 мкл раствора-1, перемешивали на вортексе и хранили раствор при при температуре – 20С не более 1 недели.

Приготовление рабочего раствора-1 (метод SAR/SDS-PAGE). В микропробирку объемом 1.5 мл вносили 996 мклдеионизированной воды, добавляли 4 мкл сток-раствора CERA (если концентрация CERA в шприце 100 мкг), перемешивали на контактном миксере и хранили приготовленный раствор при температуре – 20С не более 2 недель.

Анализ возможных причин неудовлетворительного изоэлектрического разделения ЭПО-Fc

Нерастворимые агрегаты могут быть удалены из раствора благодаря фильтрации, а растворимые, образующиеся из-за «самослипания» молекул белка, зависят от условий среды. Причин, способствующих данному явлению может быть несколько – резкое изменение рН и температуры среды [186], ионной силы раствора [187], изменение условий хранения препаратов (многократном замораживании/размораживании), изменение конформации молекул (денатурация белка) и др. Исходя из этого, очевидно, что при изоэлектрическом разделении в условиях высокой ионной силы, меняющегося рН и увеличения температуры за счет сил трения о сетку геля высока вероятность формирования агрегатов Fc-гибридов.

Ранее тенденция к образованию агрегатов Fc-гибридов уже была описана Way с соавторами [177]. В ряде работ приведены данные, свидетельствующие о вовлечении СН3-домена Fc-части в процесс образования агрегатов [175-176]. Авторами показано, что восстановление дисульфидных связей СН3-домена Fc-части приводит к формированию видимых агрегатов в растворе [176]. Исходя из того, что СН3-домен многих рекомбинантных моноклональных антител менее стабилен, за счет уменьшенного количества дисульфидных связей в своей структуре, после разрыва –S–S– связей гидрофобность Fc-частей увеличивается, и молекула становится термодинамически неустойчивой, что приводит к образованию олигомерных аддуктов антител [176]. В работе Schriebl [174] при анализе растворов ЭПО-Fc методом эксклюзионной хроматографии установлено, что около 20% молекул ЭПО-Fc в растворе трис-глицинового буфера с рН 7.4 вступает в агрегацию. Souillac [175] показал, что молекулы Fc-гибридов в присутствии 8 М мочевины не солюбилизируют до отдельных молекул и остаются в агрегированном состоянии. В условиях стандартной методики изоэлектрического разделения, принятых в антидопинговых лабораториях используются полиакриламидные гели с конечной концентрацией мочевины 7 М, чего недостаточно для полной солюбилизации ЭПО-Fc. Однако увеличение концентрации мочевины невозможно, поскольку она влияет на буферную емкость геля в диапазоне кислых значений рН. Таким образом, нами было установлено, что гликаны Fc-части в положении Asn297 преимущественно представлены нейтральными биантенными структурами G0F, G1F и G2F, не влияющими на изоэлектрическую точку ЭПО-Fc. По всей видимости, склонность к формированию агрегатов оказывает результирующее влияние на поведение белка при IEF-PAGE в градиенте рН 2–6. На следующем этапе были охарактеризованы электрофоретические свойства ЭПО-Fc после удаления Fc-части IdeS протеазой.

Как уже упоминалось ранее, IdeS является ферментом избирательно расщепляющим молекулы IgG по специфическому мотиву GPSVFLF, находящемуся чуть ниже шарнирной области Fc-части гибридного белка [160]. Ожидается, что посредством IdeS-гидролиза ЭПО-Fc будет удалена Fc-часть молекулы с образованием фрагмента, состоящего из двух молекул ЭПО и двух шарнирных областей, объединенных дисульфидными связями (далее фрагмент (ЭПО-шарнир)2) и двух мономерных Fc-частей (Fc/2), содержащих CH2- и CH3-домены (рисунок 17). На рисунке зеленым цветом отмечены молекулы рЭПО, желтым – СН2- и СН3- домены Fc-части IgG; красными овалами – сайты N-гликозилирования, серым – сайты О-гликозилирования.

Для гидролиза ЭПО-Fc, в соответствии с инструкцией производителя [188], IdeS протеазу добавляли к раствору гибридного белка в соотношении 1:1 и инкубировали в течение 1 часа при 37C в фосфатном буфере. После анализа гидролизованного ЭПО-Fc методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле с градиентом рН 2–6, последующим двойным Вестерн блотингом и хемилюминесцентной детекцией фрагмент (ЭПО-шарнир)2 показал уникальный изоэлектрический профиль, отличающийся от любого из известных на сегодняшний день аналогов ЭПО (Рисунок 18, выделен синим пунктиром). Изопрофили являются уникальными для каждого препарата рЭПО и используются в антидопинговом контроле для идентификации неизвестных образцов на наличие ЭПО рекомбинантной природы. На рисунке 18 изображен результат анализа IEF-PAGE референсных стандартных образцов ЭСА (слева направо): эндогенного ЭПО, Мирцера, смеси биологического эталонного препарата (BRP) -, -рЭПО (эквимолярная смесь эпоэтина- и -, третий трек верхние 6 полос) и дарбэпоэтина-альфа (NESP, третий трек 4 полосы снизу), гибридного белка после IdeS-гидролиза. Изоэлектрические профили стандартных образцов ЭПО -, -рЭПО, Мирцера и полученного после гидролитического расщепления ЭПО-Fc IdeS протеазой фрагмента (ЭПО-шарнир)2 детектируются в основной области геля. Изопрофиль препарата NESP при изоэлектрофокусировании виден в кислой области, что соответствует нижней части геля. Для упрощения процедуры характеризации гликоформ ЭПО и оценки результатов анализа IEF-PAGE сотрудниками антидопинговой лаборатории г. Зайберсдорф (Австрия) был предложен унифицированный подход и разработана специализированная компьютерная программа GASepo для анотирования изоэлектрических профилей [143]. В соответствии с данной программой, гликоформы основной области геля обозначаются арабскими цифрами, кислой области – заглавными латинскими буквами. Основная и кислая области геля разделены в соответствии с позицией белковых полос – -, -рЭПО (BRP) из Европейской фармакопеи по первой интенсивной белковой полосе и NESP – по наиболее интенсивной белковой полосе препарата. Эндогенная область находится между кислой и основной областями. Изопрофиль образца эндогенного эритропоэтина представлен в эндогенной области на первом треке и его изоформы обозначаются буквами греческого алфавита. Изоэлектрический профиль полученного димерного фрагмента заметно отличается по характеру распределения гликоформ относительно других ЭСА. Он включает 10-12 хорошо различимых дискретных гликоформ, наиболее интенсивные из которых расположены в области между изопрофилями стандартных препаратов -, -рЭПО и Мирцера. Было установлено, что расстояние между гликоформами изоэлектрического профиля фрагмента (ЭПО-шарнир)2 существенно меньше, чем между гликоформами Мирцера. Несмотря на то, что в структуре фрагмента (ЭПО-100 шарнир)2 к молекуле рЭПО с С-конца присоединена шарнирная область IgG и вследствие гидролиза IdeS протеазой не произошло изменения конформации молекулы, то первичные антитела к эритропоэтину, используемые в процессе анализа, клон AE7A5, связываются и с (ЭПО-шарнир)2, поскольку они были получены к линейному эпитопу N-конца молекулы ЭПО.

Формирование полиакриламидного геля с градиентом рН 2–6

Интерпретацию данных определения эритропоэз-стимулирующих агентов методом IEF-PAGE в настоящее время проводят в соответствии с критериями, установленными техническим документом ВАДА TD2014EPO «Гармонизация и представление данных по анализу эритропоэз-стимулирующих агентов электрофоретическими методами» (TD2014EPO Harmonization of analysis and reporting of Erythropoiesis Stimulating agents (ESAs) by Electrophoretic techniques) на основании рекомендаций экспертов [132]. В случае одобрения разработанная методика станет обязательной процедурой для качественного определения ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови всеми аккредитованными ВАДА антидопинговыми лабораториями мира. Ниже предложены новые критерии идентификации изоэлектрического профиля ЭПО-Fc, после гидролиза IdeS, которые в ближайшее время будут рассмотрены ВАДА и внесены поправки в технический документ TD2014EPO.

При обработке результатов анализа на наличие ЭПО-Fc следует анотировать гликоформы исследуемых и контрольных образцов, используя инструменты программного продукта GASepo.

Проба считается положительной если выполняются следующие критерии: изоэлектрический профиль ЭПО пробы сыворотки крови визуализируется в основной области геля и содержит от 9 до 12 гликоформ. Изоэлектрический профиль ЭПО пробы должен соответствовать таковому у положительного контрольного образца, заведомо содержащего ЭПО-Fc. Первая белковая полоса изопрофиля должна находиться на уровне второй белковой полосы изопрофиля а-, yg-рЭПО, а последняя не выше 5-6 белковой полосы Мирцера. Расстояние между гликоформами изоэлектрического профиля ЭПО пробы должно быть меньше такового, чем у положительного контрольного образца Мирцера. Проба будет считаться отрицательной, если изоэлектрический профиль ЭПО образца сыворотки крови соответствует профилю гликоформ эндогенного ЭПО и 2 или более из вышеперечисленных критериев не удовлетворяются.

Для проведения экспертизы уполномоченные органы как правило используют готовые аттестованные методики, либо разрабатывают их самостоятельно и определяют основные метрологические характеристики (валидируют) и аккредитуют для установления соответствия методики общепринятым ГОСТам. В случае антидопингового контроля лаборатория руководствуется ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий» [190] и Международным стандартом для лабораторий (ISL) [191]. Согласно ISL для качественных методов должны быть установлены следующие метрологические характеристики: специфичность/селективность, предел обнаружения, стабильность, степень извлечения и влияние матрицы образца. Эксперименты по определению каждой из характеристик были проделаны несколько раз.

Под специфичностью понимают способность метода точно измерять или определять анализируемое вещество в присутствии иных компонентов матрицы образца (подобных химических соединений, продуктов разложения и т. д.). Для изучения специфичности детекции ЭПО-Fc проводили анализ IEF-PAGE препаратов а-, у -рЭПО, NESP, Мирцера, эндогенного ЭПО и

ЭПО-Fc, после гидролиза IdeS протеазой, добавленных к 1 мл сыворотки, с двойным Вестерн блоттингом и хемилюминесцентной детекцией. Пробоподготовка проводилась по стандартной схеме с помощью колонок МАЛА. После проведения IEF-PAGE сравнивали изоэлектрические профили препаратов в специализированной компьютерной программе для анотирования изоэлектрических профилей GASepo [143] (рисунок 24 а, б) -расположение в геле, количество белковых полос и интенсивность их хемилюминесцентного сигнала (наибольшая/наименьшая).

Как уже отмечалось ранее, профиль гликоформ фрагмента (ЭПО-шарнир)2, полученный после гидролиза ЭПО-Fc IdeS протеазой, заметно отличается от остальных эритропоэтинов, представленных на рисунке, как по характеру распределения, так и количеством гликоформ (рисунок 24 б). В отличие от изопрофилей NESP и эндогенного ЭПО, профиль гликоформ фрагмента (ЭПО-шарнир)2 (а 4) расположен в основной области геля и состоит из 12 четких дискретных изоформ. Например, NESP имеет 4 белковые полосы (а 3, внизу), а эндогенный ЭПО (а 1) - 13 и захватывает все три области геля. Изопрофили а-, у -рЭПО (а 3, вверху) и Мирцера (а 2), так же так и димерного фрагмента (ЭПО-шарнир)2 детектируются в основной области, однако имеют иной характер распределения и содержат различное количество гликоформ. Так, изопрофиль Мирцера состоит из 6 гликоформ, находящихся в непосредственной близости друг от друга по сравнению с профилем гликоформ а-, у -рЭПО, состоящего также из 6 гликоформ, однако белковые полосы последнего находятся на заметном расстоянии друг от друга. Изоэлектрический профиль (ЭПО-шарнир)2 отличается от них большим количеством гликоформ и их расположением между второй белковой полосой а-, у -рЭПО и шестой белковой полосой Мирцера. Наиболее интенсивный хемилюминесцентный сигнал в изопрофиле димерного фрагмента (ЭПО-шарнир)2 дают белковые полосы под номерами 5 и 7 (рисунок 24 б, 4). Таким образом, изоэлектрический профиль фрагмента (ЭПО-шарнир)2 является уникальным и существенно отличается от профилей 119 как эндогенного ЭПО, так и иных ЭСА, за счет чего может быть специфично детектирован в образцах сыворотки крови спортсменов.