Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Антиоксиданты как объекты электроаналитической химии (Литературный обзор) 18
1.1 Антиоксиданты, их классификация и свойства 19
1.1.1 Биодоступность фенольных антиоксидантов в сложных объектах 28
1.2 Электрохимические методы определения индивидуальных антиоксидантов в продуктах питания и лекарственных средствах 39
1.2.1 Гальваностатическая кулонометрия 40
1.2.2 Вольтамперометрические методы определения антиоксидантов
1.2.2.1 Применение химически модифицированных электродов в вольтамперометрии антиоксидантов 52
1.2.2.2 Вольтамперометрическое определение антиоксидантов в присутствии поверхностно-активных веществ 73
1.3 Электрохимические способы оценки интегральных антиоксидантных показателей 81
Глава 2 Экспериментальная часть 91
2.1 Оборудование 91
2.2 Электроды и способы их модификации 92
2.3 Реагенты и материалы 93
2.4 Методики проведения эксперимента 98
Глава 3 Вольтамперометрия индивидуальных антиоксидантов на электродах, модифицированных углеродными наноматериалами 104
3.1 Определение фенольных антиоксидантов 104
3.1.1 Синтетические водорастворимые производные гидрохинона, пирокатехина и пирогаллола . 104
3.1.2 Природные фенольные антиоксиданты
1 3.2 Определение серосодержащих антиоксидантов 129
3.3 Определение -токоферола и ретинола 136
Глава 4 Гальваностатическая кулонометрия индивидуальных антиоксидантов 142
4.1 Реакции природных фенольных антиоксидантов с электрогенерированными титрантами и их аналитическое применение 142
4.1.1 Кулонометрическая оценка взаимодействий фенольных антиоксидантов с протеинами 148
4.2 Определение синтетических фенольных антиоксидантов 152
4.2.1 Ди-, тригидроксибензолы и их производные 152
4.2.2 Пространственно-затрудненные фенолы 156
Глава 5 Электрохимическая оценка антиоксидантной емкости продуктов питания ..
5.1 Антиоксидантная емкость специй 160
5.2 Антиоксидантная емкость чая и кофе
5.2.1 Интегральная антиоксидантная емкость и железовосстанавливающая способность напитков 171
5.2.2 Вольтамперометрическая оценка антиоксидантной емкости чая и кофе
5.3 Комплексная электрохимическая оценка антиоксидантных свойств и качества коньяков и бренди 186
5.4 Хронокулонометрическая оценка антиоксидантной емкости вин 213
Глава 6 Электроанализ антиоксидантов в присутствии ПАВ 221
6.1 Гальваностатическая кулонометрия антиоксидантов в ПАВ-содержащих средах 221
6.2 Вольтамперометрия антиоксидантов в присутствии ПАВ
6.2.1 -Токоферол 229
6.2.2 Ретинол 234
6.2.3 -Каротин 240
6.2.4 Эвгенол 247
6.2.5 Менадион 252
6.2.6 Пространственно-затрудненные фенолы 258
6.3 ПАВ-модифицированные электроды для определения антиоксидантов
6.3.1 Амперометрический сенсор для определения морина 267
6.3.2 Определение ванилина и сиреневого альдегида 277
6.3.3 Определение пространственно-затрудненных фенолов 291
Заключение 305
Список сокращений и условных обозначений 309
Список литературы
- Вольтамперометрическое определение антиоксидантов в присутствии поверхностно-активных веществ
- Синтетические водорастворимые производные гидрохинона, пирокатехина и пирогаллола
- Определение синтетических фенольных антиоксидантов
- Комплексная электрохимическая оценка антиоксидантных свойств и качества коньяков и бренди
Введение к работе
Актуальность темы. Антиоксиданты (АО) играют ключевую роль в системе антиоксидантной защиты живых организмов, защищая клетки от вредного воздействия свободных радикалов. Основными экзогенными источниками АО для человека являются продукты питания и лекарственные средства. Проявляемые ими антиоксидантные свойства зависят от структуры соединений, входящих в их состав, химической формы существования (нахождения) и концентрации, а также от природы объекта или среды, в которой АО находятся. Поэтому становится важной оценка антиоксидантных свойств продуктов питания и лекарственных средств, которая связана также и с контролем их качества. Это, в свою очередь, требует разработки доступных и экспрессных способов надежного определения антиоксидантных характеристик объектов.
Реакции АО со свободными радикалами включают перенос электронов, что позволяет использовать для их определения методы электроанализа, характеризующиеся высокой чувствительностью, быстротой процедуры и относительно невысокой стоимостью анализа, возможностью миниатюризации, что делает их весьма привлекательными для решения подобного рода задач. Кроме того эти методы могут сочетаться с детектированием в различных типах жидкостной хроматографии и капиллярном электрофорезе.
Реакционная способность АО проявляется в двух типах процессов: окислении на поверхности электродов в условиях вольтамперометрии и взаимодействии с возникающими на электроде окислителями в растворе, в частности, с кулонометрическими титрантами. Поэтому подходы на принципах вольтамперометрии и гальваностатической кулонометрии для определения индивидуальных АО в продуктах питания и объектах фармации и оценки их антиоксидантных свойств через обобщенные показатели, несомненно, следует рассматривать как перспективные.
Для решения такого рода задач представляет интерес использование одноэлектронных электрогенерированных окислителей, в частности, гексацианоферрат(III)-ионов. В общем случае при таком подходе могут исключаться побочные и конкурирующие реакции, влияющие на результаты определения, а с другой стороны, в какой-то степени моделироваться реакции, протекающие in vivo. В последнее время в органической вольтамперометрии большое внимание уделяют химически модифицированным электродам, в том числе на основе углеродных наноматериалов и их сочетаний с поверхностно-активными веществами (ПАВ). Кроме того, ПАВ обеспечивают солюбилизацию липофильных соединений в водных средах, что может быть использовано в электроанализе жирорастворимых АО.
Цель работы заключалась в разработке новых электрохимических способов определения индивидуальных АО в продуктах питания и объектах фармации и оценки их антиоксидантных свойств через интегральные характеристики с применением химически модифицированных электродов на основе углеродных наноматериалов и организованных сред на основе ПАВ.
В соответствии с целью исследования в работе поставлены следующие задачи:
разработать способы вольтамперометрического определения индивидуальных
АО различных классов на электродах, модифицированных углеродными
нанотрубками, в продуктах питания и лекарственных формах;
разработать способы кулонометрического определения природных и
синтетических фенольных АО, основанных на реакциях с электрогенерированными гексацианоферрат(III)-ионами;
оценить возможность применения гальваностатической кулонометрии с
электрогенерированными бромом и гексацианоферрат(III)-ионами для исследования взаимодействия природных фенольных АО с протеинами;
разработать способы электрохимической оценки интегральных антиоксидантных
параметров (антиоксидантной емкости (АОЕ) и железовосстанавливающей способности (ЖВС)) продуктов питания;
оценить возможность электрохимической генерации кулонометрических
титрантов в присутствии ПАВ различной природы и разработать способы кулонометрического определения липофильных АО в лекарственных формах;
установить характеристики электрохимического окисления индивидуальных АО
в ПАВ-содержащих средах и разработать способы их экстракционно-вольтамперометрического определения в продуктах питания и лекарственных формах;
создать электроды, модифицированные соиммобилизованными углеродными
наноматериалами и ПАВ, для определения природных и синтетических
фенольных АО в растительном сырье и продуктах питания.
Научная новизна работы состоит в том, что предложена единая методология применения комплекса электрохимических методов для оценки антиоксидантных свойств продуктов питания и лекарственных средств.
Установлены закономерности электрохимического окисления природных и синтетических фенольных (ди- и тригидроксибензолов, флавоноидов, галловой и гидроксикоричных кислот) и серосодержащих АО (аминокислот, унитиола и -липоевой кислоты), а также -токоферола и ретинола на электродах, модифицированных углеродными нанотрубками. Показано, что тип наноматериала и
способ его получения влияют на проявляемые электрокаталитические свойства электрода.
Найдены стехиометрические коэффициенты для природных и синтетических фенольных АО в реакциях с электрогенерированными титрантами и предложены схемы их взаимодействий. Показана применимость кулонометрического титрования с электрогенерированными бромом и гексацианоферрат(III)-ионами для оценки in vitro биодоступности фенольных АО в присутствии протеинов. Молочные протеины (казеин, бычий сыворотный альбумин и -лактоглобулин) связывают рутин, кверцетин и таксифолин, переводя их в неактивную форму, причем рутин в рассматриваемом ряду связывается в меньшей степени.
Разработан способ оценки ЖВС напитков и специй, основанный на реакциях их АО с электрогенерированными гексацианоферрат(III)-ионами.
Получены характеристики окисления компонентов специй, коньяков, бренди и вин на электродах из углеродистых материалов в условиях циклической (ЦВА) и дифференциально-импульсной вольтамперометрии (ДИВ). Показано, что аналитические сигналы продуктов питания носят интегральный характер и обусловлены окислением их фенольных АО (гидроксикоричных кислот кофе, катехинов и танинов чая и вин, а также гидроксибензойных кислот и ароматичеких альдегидов в коньяках и бренди).
Найдены рабочие условия электрохимической генерации галогенов и гексацианоферрат(III)-ионов в присутствии ПАВ различной природы, обеспечивающие количественный выход по току. Установлено, что концентрация ПАВ до 1 мМ не оказывает влияния на генерацию гексацианоферрат(III)-ионов, а для галогенов приемлемы лишь достаточно низкие концентрации ПАВ.
Показано, что липофильные АО (-токоферол, ретинол, -каротин, эвгенол, пространственно-затрудненные фенолы (ПЗФ)) и менадион, выполняющий функцию редокс-медиатора в живых системах, электрохимически активны в ПАВ-содержащих средах. Оценено влияние природы и концентрации ПАВ на вольтамперометрический отклик аналитов и предложены соответствующие схемы реакций.
Найдены условия количественной экстракции липофильных АО и менадиона из лекарственных форм, растительного сырья и продуктов питания.
Созданы новые химически модифицированные электроды на основе соиммобилизованных углеродных наноматериалов и ПАВ для определения природных (морина, ванилина и сиреневого альдегида) и синтетических (трет-бутилгидрохинона и трет-бутилгидроксианизола) фенольных АО. Способ модификации поверхности электрода, природа и концентрация ПАВ влияют на вольтамперные характеристики АО, предложены схемы реакций окисления. Показана
возможность одновременного определения структурно родственных соединений на примере ароматических альдегидов и ПЗФ.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанная методология определения индивидуальных АО и их суммарного содержания в реальных объектах расширяет области применения электрохимических методов в органическом анализе.
Предложены способы вольтамперометрического определения природных фенольных (рутина, кверцетина и таксифолина), серосодержащих (метионина, -липоевой кислоты и унитиола) АО, ретинола и -токоферола в лекарственных формах на электродах, модифицированных углеродными нанотрубками. Величина относительного стандартного отклонения не превышает 6 %.
Разработаны способы кулонометрического определения ряда АО в моно- и поликомпонентных лекарственных формах, основанного на их взаимодействии с электрогенерированными титрантами, в том числе в ПАВ-содержащих средах.
Оценена ЖВС экстрактов специй, чая и кофе. Показано, что ЖВС напитков значительно снижается в присутствии молока за счет взаимодействия его протеинов с фенольными АО чая и кофе.
Разработаны вольтамперометрические способы оценки АОЕ специй, чая и кофе, основанные на окислении их АО на стеклоуглеродном электроде (СУЭ) и модифицированном многослойными углеродными нанотрубками СУЭ (МУНТ/СУЭ) в условиях ЦВА и ДИВ. Установлены корреляции с общепринятыми антиоксидантными параметрами.
Гальваностатическая кулонометрия с электрогенерированными бромом и гексацианоферрат(III)-ионами, ДИВ и хроноамперометрия впервые применены для оценки антиоксидантных свойств и качества коньяков и бренди. Разработанный комплекс подходов характеризуются простотой, доступностью, надежностью получаемых результатов и может применяться для контроля качества бренди, позволяя установить факт грубой фальсификации напитков с применением пищевого или технического спирта и вкусоароматических добавок, имитирующих органолептические свойства качественных бренди.
Предложен способ хронокулонометрической оценки АОЕ вин, основанный на окислении их фенольных компонентов на МУНТ/СУЭ, характеризующийся простотой и экспрессностью и позволяющий значительно уменьшить объем образца, необходимый для проведения анализа.
Разработаны комбинированные способы экстракционно-вольтамперометрического определения липофильных АО (-токоферола, ретинола, -каротина, эвгенола и ПЗФ) и менадиона в лекарственных формах, косметических
средствах и продуктах питания в ПАВ-содержащих средах; величина относительного стандартного отклонения не превышает 8.2 %.
Созданы амперометрические сенсоры на основе соиммобилизованных углеродных наноматериалов и ПАВ для определения природных и синтетических фенольных АО в растительном сырье и продуктах питания. Оценена возможность одновременного определения структурно родственных ПЗФ, а также ванилина и сиреневого альдегида. Полученные аналитические характеристики сенсоров превосходят таковые для существующих аналогов.
Показано, что применение модифицированных электродов на основе углеродных наноматериалов и организованных сред на основе ПАВ в электроанализе АО значительно улучшает аналитические характеристики их определения. В случае ПАВ-содержащих сред можно существенно снизить долю органического растворителя или в некоторых случаях полностью перейти к определению в водной среде.
Методология и методы исследования. В рамках проведенных исследований были использованы методы гальваностатической кулонометрии с электрогенерированными титрантами, ЦВА и ДИВ, хроноамперо- и хронокулонометрии. Для характеристики поверхности электродов применяли сканирующую электронную (СЭМ) и атомно-силовую микроскопию (АСМ), а для сопоставления результатов анализа - спектрофотометрию.
Положения, выносимые на защиту:
способы вольтамперометрического определения АО различной природы на электродах, модифицированных углеродными наноматериалами и их применение в анализе реальных объектов;
кулонометрические способы определения природных и синтетических фенольных АО, основанные на их реакциях с электрогенерированными галогенами и гексацианоферрат(III)-ионами;
результаты кулонометрической оценки взаимодействий фенольных АО природного происхождения с молочными протеинами;
способы электрохимической оценки антиоксидантных свойств продуктов питания (специй, чая, кофе, коньяков и бренди, вин) методами гальваностатической кулонометрии, вольтамперометрии, хроноамперо- и хронокулонометрии, их сопоставление со стандартными методиками и аналитическое применение;
результаты применения ПАВ в гальваностатической кулонометрии с электрогенерированными титрантами и способы определения липофильных АО в лекарственных формах с применением ПАВ-содержащих сред;
вольтамперные характеристики АО и менадиона, способы их экстракционно-вольтамперометрического определения в реальных объектах (лекарственных формах и продуктах питания) в присутствии ПАВ;
вольтамперометрические способы определения природных и синтетических фенольных АО с применением электродов, модифицированных углеродными наноматериалами и ПАВ, их аналитические и метрологические характеристики.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность полученных результатов подтверждается большим объемом экспериментального материала с применением методов электроанализа на современном сертифицированном оборудовании и сопоставлением результатов определений с данными независимых стандартных методов и литературы.
Результаты работы представлены в многочисленных устных и стендовых докладах на всероссийских и международных конференциях: 10th Analytical Russian-German-Ukrainian Symposium “ARGUS’2007 - Nanoanalytics” (Saratov, 2007), Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Москва, 2007, Волгоград, 2011), Всероссийских конференциях «Аналитика России» (Краснодар, 2007, 2009), “Химический анализ” (Москва, 2008), конференциях по электрохимическим методам анализа с международным участием “ЭМА” (Уфа, 2008, 2012), International Conference on Electroanalysis “ESEAC” (Prague, 2008, Malm, 2014), “Аналитика Сибири и Дальнего Востока” (Томск, 2008, Красноярск, 2012), Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ “Материалы и технологии XXI века” (Казань, 2009, 2011, 2012), “Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции” (Москва, 2009), International Seminar on Modern Electrochemical Methods (Jetichovice, 2010), съездах аналитиков России (Москва, 2010, 2013), Республиканской научной конференции по аналитической химии с международным участием “АНАЛИТИКА РБ-2010” (Минск, 2010), XI Medzinrodn konferencia "SASN STAV A PERSPEKTVY ANALYTICKEJ CHMIE V PRAXI" (Bratislava, 2010), симпозиуме с международным участием “Теория и практика электроаналитической химии” (Томск, 2010), международных конференциях “Экстракция органических соединений” (Воронеж, 2008, 2010), International Conference “Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine” (St. Petersburg, 2011), International Congress on Organic Chemistry (Kazan, 2011), международном научном форуме “Бутлеровское наследие” (Казань, 2011, 2015), всероссийских симпозиумах “Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии” (Краснодар, 2011, 2014), V Всероссийской конференции “Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья” (Барнаул, 2012), Heyrovsky Discussions (Brno, 2012, Te, 2014), 4th EuCheMS Chemistry Congress (Prague, 2012), Annual
Meetings of the International Society of Electrochemistry (Prague, 2012, Lausanne, 2014), всероссийской конференции “Химия и медицина” (Уфа-Абзаково, 2013), международной научно-технической конференции “Нигматуллинские чтения - 2013” (Kazan, 2013), European Conference on Analytical Chemistry “Euroanalysis” (Warsaw, 2013, Bordeaux, 2015) и 26th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis “PBA 2015” (Tbilisi, 2015).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 92 работы, в том числе глава в коллективной монографии, 37 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК, из них 19 в зарубежных изданиях, и тезисы 54 докладов (общее число публикаций автора – 259, из них 3 главы в монографиях, 124 статьи (5 обзоров), 11 патентов, 3 методических пособия).
Диссертация выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 09-03-00309-а “Новые электрохимические сенсоры и биосенсоры на основе медиаторных систем для обобщенной оценки объектов сложного состава”, № 12-03-00395-a “Мицеллярные и предорганизованные медиаторные системы для электрохимического определения органических соединений”, № 14-03-31173-мол_а “Новые аспекты применения электрохимических методов в оценке антиоксидантных свойств пищевых продуктов и лекарственного растительного сырья”), Госбюджетной темы “Антиоксиданты как объекты биоэлектроанализа: новые подходы (2013 г., № 01201364003)” и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету, для выполнения проектной части государственного задания в сфере научной деятельности (тема “Электрохимический анализ сложных многокомпонентных систем с помощью толстопленочных микрогетерогенных медиаторных систем для контроля качества пищевой продукции”, 2014-2016 гг., № 114090970011).
Личный вклад автора заключается в постановке и решении задач, получении экспериментальных данных, их обсуждении, интерпретации и систематизации результатов исследований.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из предисловия, введения, шести глав, заключения, списка литературы и приложения. Она изложена на 380 страницах, содержит 102 таблицы, 85 рисунков и библиографию из 608 наименований.
Вольтамперометрическое определение антиоксидантов в присутствии поверхностно-активных веществ
Катехины достаточно быстро всасываются в тонком кишечнике. Присутствие галлатных остатков не оказывает влияния на их in vivo биодоступность, которая примерно одинакова для всех мономерных катехинов. Однако для их димерных форм наблюдается снижение in vivo биодоступности [42].
Изофлавоны обладают самой высокой in vivo биодоступностью среди всех подклассов флавоноидов. Она не зависит от формы их существования. Абсорбция агликонов и гликозидов протекает достаточно медленно, то есть процесс идет в толстом кишечнике. Это хорошо согласуется с низкой активностью фермента лактазной флоридзин-гидролазы по отношению к гликозидам изофлавонов [46].
Антоцианы достаточно быстро всасываются, но при этом обладают самой низкой in vivo биодоступностью среди всех флавоноидов, что подтверждается низкими концентрациями в биологических жидкостях человека [47]. Возможно, это объясняется недостаточной чувствительностью определения антоцианов в плазме крови и моче с одной стороны, а с другой – разнообразием структур антоцианов, а, следовательно, и их метаболитов в исcледуемых объектах [48]. Кроме того, нельзя исключать возможность образования неустойчивых метаболитов, которые разрушаются в ходе пробоподготовки [49].
Фенольные кислоты, входящие в состав широкого круга продуктов питания, также биодоступны. В форме агликона они обычно всасываются в верхней части желудочно-кишечного тракта. Показано, что галловая, кофейная, феруловая, кумаровая и хлорогеновая кислоты могут всасываться в желудке уже через 1-2 часа после приема пищи [50, 51]. Другие участки, абсорбирующие фенольные кислоты расположены в тонком кишечнике. Всасывание агликонов может характеризоваться различной интенсивностью, например для кофейной и феруловой кислот in vivo биодоступность составляет 19.1 и 56.1%, соответственно [52]. Эфиры фенольных кислот характеризуются очень низкой in vivo биодоступностью (около 0.3-0.4% от поступивших в организм), поскольку необходимо предварительное превращение их в агликоны, а ферменты клеток кишечника не обеспечивают достаточно эффективный гидролиз эфирных связей [53]. Однако большая часть эфиров фенольных кислот поступает в толстый кишечник, где подвергается метаболизму, а соответствующие метаболиты определяются в плазме крови через 7-8 часов после приема пищи. Необходимо отметить, что для различных эфиров кофейной кислоты – хлорогеновой, кафтаровой или розмариновой кислот – схема метаболизма сходная и приводит к образованию одинаковых метаболитов (м-кумаровой, фенилпропионовой и бензойной кислот). Таким образом, различные варианты этерификации кофейной кислоты не влияют на метаболический путь под действием микрофлоры кишечника [54]. Другие вопросы, касающиеся in vivo биодоступности гидроксибензойных и гидроксикоричных кислот, в том числе и в контексте аналитики, рассмотрены в обзорной статье [52].
В рамках обсуждения биодоступности следует принимать во внимание возможность прямого взаимодействия фенольных АО с липидами, полисахаридами и протеинами [55, 56]. С этой точки зрения протеины представляют особенный интерес, так как их взаимодействие с фенольными АО изменяет свойства обоих типов соединений. С одной стороны, оно приводит к понижению усваиваемости (биодоступности) протеинов в организме и их связыванию, в том числе с образованием осадков, а также к ингибированию активности ферментов. Другими словами, взаимодействие протеинов с фенольными АО оказывает влияние на свойства протеинов, что приводит к изменению их функций в живых системах [57, 58].
С другой стороны, протеины, находящиеся в пищевом продукте могут образовывать комплексы с фенольными АО [59]. Это приводит к изменению биологической активности фенольных АО [60], в том числе и in vivo и in vitro биодоступности [61]. Антиоксидантые свойства природных фенольных соединений также изменяются в присутствии протеинов [62]. Тем не менее, на сегодняшний день доказательства их влияния на фенольные АО остаются под вопросом. С одной стороны, показано, что антиоксидантная емкость (АОЕ) какао снижается на 30% при добавлении молока за счет связывания фенольных АО с его протеинами [61]. С другой стороны, установлено, что in vivo биодоступность мономерных флавоноидов (эпикатехина) не уменьшается при поступлении какао с молоком в организм [63]. В то же время протеины слюны связывают фенольные АО, что приводит к выпадению нерастворимых комплексов и появлению терпкого вкуса [64]. Более того, фенольные АО с высокой молекулярной массой могут вступать в сильные взаимодействия с протеинами. Фенольные АО не только связываются с протеинами слюны, но и с протеинами продуктов питания, а также пищеварительными ферментами, которые, в свою очередь, могут повлиять на их транспортировку и активность поглощения [65]. Таким образом, присутствие протеинов в продуктах питания и пищеварительной системе может влиять на оба типа биодоступности фенольных АО.
Фенольные АО могут взаимодействовать с протеинами за счет ковалентных или межмолекулярных связей. Нековалентное связывание происходит вследствие образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий между молекулами фенольных АО и различными функциональными группами протеинов [66]. Также в некоторых случаях возможно ионное связывание [67]. Механизм связывания зависит от структуры протеина.
Так, при образовании водородных связей между карбонильной группой пептидной связи и гидроксильными группами фенольных АО определяющую роль играет структура и подвижность протеина [68].
Синтетические водорастворимые производные гидрохинона, пирокатехина и пирогаллола
Для объектов сложного состава, например продуктов питания, отклик биосенсоров зависит от присутствия других соединений, например, фенольной природы, что ограничивает область применения этого типа устройств в анализе индивидуальных АО. Кроме того, зачастую для концентрирования аналитов необходима предварительная твердофазная экстракция [267].
Как уже отмечалось выше, для селективного определения АО в объектах сложного состава успешно применяется сочетание предварительного хроматографического или электрофоретического разделения с электрохимическим детектированием. При этом используются как классические, так и все вышеупомянутые типы химически модифицированных электродов.
Так, ВЭЖХ с электрохимическим детектированием при 0.8 В применена для совместного определения в биологических жидкостях биоханина А, формононетина, сиссотрина, дайдзеина, глицитина, глицитеина и генистеина. Диапазон определяемых содержаний составляет 50-1000 нг/мл [268]. Обращено-фазовая хроматография на колонке Restek Allure C18 и смесью CH3OH/СН3COOH (60:40) в качестве элюента с электрохимическим детектированием при 0.95 В позволяет проводить определение фенольных АО в ягодах [269]. Для определения цистеина предложена ВЭЖХ с толстопленочным золотым углероволоконным электродом. Диапазон определяемых содержаний оставляет 0.5-5.0 мг/л с ПрО 0.06 мг/л [270].
Для определения фенольных АО (ванилина, эвгенола, тимола и карвакрола) в эфирных маслах использован метода ВЭЖХ с амперометрическим и кулонометрическим детектированием на СУЭ и пористом ГЭ при 0.925 и 0.500 В, соответственно. Диапазоны определяемых содержаний АО составляют 0.01-10.0 мг/л для амперометрического детектирования и 0.001-2.0 мг/л для кулонометрического. Кулонометрический детектор характеризуется большей чувствительностью, а достигнутые ПрО (0.81, 3.0, 3.1 и 1.4 мг/л для ванилина, эвгенола, карвакрола и тимола, соответственно) значительно превосходят получаемые с применением УФ- и амперометрического детектирования [271].
ВЭЖХ с электрохимическим детектированием на СУЭ, модифицированном фталоцианином никеля(II), предложена для определения синтетических фенольных АО (трет-бутилгидроксианизола, трет-бутилгидрокситолуола и пропилгаллата) в жевательной резинке [272]. Диапазоны определяемых содержаний составляют 0.2-10 мг/л с ПрО 0.11, 0.6 и 0.15 мг/л для трет-бутилгидроксианизола, трет-бутилгидрокситолуола и пропилгаллата, соответственно.
Комбинация капиллярной жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием на ГЭ при 0.9 В использована для одновременного определения цистеина, глутатиона и допамина в моче. Разделение аналитов проводится на колонке Zorbax 300SB-C8 с 0.2 М фосфатным буферным раствором рН 3.0 в качестве подвижной фазы. Градуировочные зависимости линейны в диапазонах 0.5-200 мкМ для цистеина и допамина и 1.0-200 мкМ для глутатиона с ПрО 0.2 и 0.5 мкМ, соответственно [273].
Сочетание электрофоретического разделения с электрохимическим детектированием на дисковом ГЭ при 0.85 В позволяет проводить определение транс-ресвератрола в винах и препаратах китайской медицины (Polygonum cuspidatum и Zijin). Диапазон определяемых содержаний составляет 0.50-100 мкг/мл с ПрО 59.6 нг/мл [274].
Одновременное определение флавоноидов (гесперидина, геспередина, нарингина, нарингенина, рутина) и аскорбиновой кислоты в соке и цедре грейпфрута возможно с применением капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием на дисковом ГЭ при 0.95 В. Установлено, что в среде 60 мМ боратного буферного раствора pH 9.0 можно провести разделение аналитов за 25 мин. ПрО для аналитов находятся в интервале 0.14-1.0 мкг/мл. Динамический диапазон концентраций составляет 1.0-100 и 5.0-100 мкМ для флавоноидов и аскорбиновой кислоты, соответственно [275]. Для одновременного определения феруловой, кофейной, протокатехиновой кислот и протокатехинового альдегида в китайских таблетках предложен метод капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием на угольном дисковом электроде при 0.95 В. В оптимальных условиях (20 мМ боратный буферный раствор рН 7.6, Е=18 кВ) разделение аналитов достигается за 18 мин. Градуировочные зависимости линейны в диапазонах 0.05-5.0 мкг/мл для феруловой кислоты и протокатехинового альдегида и 0.1-10.0 мкг/мл для кофейной и протокатехиновой кислот с ПрО 0.01, 0.006, 0.03 и 0.03 мкг/мл, соответственно [276].
Зонный капиллярный электрофорез с ГЭ, модифицированном электрополимеризованным витамином В12, использован для определения глутатиона, аскорбиновой, ванилиновой, хлорогеновой и кофейной кислот в апельсинах и томатах [277]. Диапазоны определяемых содержаний составляют 1.0-100 мкМ для глутатиона и хлорогеновой кислоты, 0.5-100 мкМ для аскорбиновой и ванилиновой кислот и 0.25-50 мкМ для кофейной кислоты. ПрО равны 0.29, 0.22, 0.16, 0.39 и 0.078 мкМ для глутатиона, аскорбиновой, ванилиновой, хлорогеновой и кофейной кислот, соответственно.
В последнее время все большее внимание уделяется вопросам автоматизации аналитических методик. Одним из подходов к решению этой задачи является применение проточно-инжекционного анализа, обладающего рядом преимуществ по сравнению с регистрацией сигнала в стационарных условиях, важным из которых является высокая производительность. Появление последовательного инжекционного анализа позволило значительно уменьшить объемы растворов носителей, пробы или реагента, необходимых для проведения анализа.
Определение синтетических фенольных антиоксидантов
В качестве титрантов-окислителей выбраны электрогенерированные бром, иод и гексацианоферрат(III)-ионы. Изучены их реакции с природными фенольными АО. Установлено, что реакции протекают быстро и количественно лишь с электрогенерированными бромом и гексацианоферрат(III)-ионами. Электрогенерированный иод не вступает в реакции с фенольными АО вследствие низкой реакционной способности. Число электронов, участвующих в реакциях, представлено в Таблице 4.1. Следует отметить, что стехиометрические коэффициенты реакций не зависят от используемого растворителя (метанол или этанол).
Установлено, что электрогенерированный бром быстро и количественно реагирует с исследуемыми соединениями за исключением фурфураля. Окисление бромид-ионов в кислой среде на платиновом электроде приводит к образованию Br3-, Br2, а также короткоживущих радикалов брома (Br#эл), адсорбированных на поверхности платинового электрода [437]. Поэтому электрогенерированный бром вступает в реакции окисления, а также электрофильного присоединения по кратным связям и замещения в ароматическое кольцо. Это объясняет большое число электронов, участвующих в реакциях с исследуемыми АО. В первую очередь протекают реакции окисления гидроксильных групп с образованием соответствующих хинонов. Для флавоноидов (катехина, рутина, лютеолина и кверцетина) сначала окисляются гидроксильные группы кольца В [438].
Сиреневый альдегид OCH3O C f/ \s—с у—OH H \=/OCH3 2 Ванилин OCH3O C //—\ — у—OHH \=/ 2 Кониферальдегид OCH3HС" -ч \ / OH 5 Фурфураль (/ Y\ HO - 5-Гидроксиметил-фурфураль HO. Д_ 3 /H O J)O 1 Галловая кислота окисляется до о-хинона, который участвует в последующих реакциях конденсации и димеризации [439]. Эллаговая кислота окисляется с образованием соответствующего ди-о-хинона согласно схеме 4.1. Ванилин и сиреневый альдегид окисляются до о-хинонов согласно схеме 4.2. В случае кониферальдегида реакция протекает с участием 5 электронов. При этом, вероятно, происходит окисление до о-хинонового фрагмента, а также возможны реакции электрофильного присоединения по кратной связи и замещения в ароматическом кольце. 5-Гидроксиметилфурфураль, вероятно, вступает в реакцию с радикальными частицами бромам с образованием относительно стабильного радикала. Окисление АО под действием гексацианоферрат(III)-ионов протекает с участием гидроксильных групп. Галловая кислота в щелочной среде при рН 11 под действием кислорода воздуха димеризуется с образованием дегидродигалловой кислоты [440], которая затем окисляется гексацианоферрат(III)-ионами до соответствующего ди-о-хинона (схема 4.3).
Хлорогеновая, кофейная и розмариновая кислоты окисляются с участием гидроксильных групп с образованием соответствующих о- и ди-о-хинонов.
Учитывая полученные данные, гексацианоферрат(III)-ионы представляют наибольший интерес, поскольку являются одноэлектронным окислителем и проявляют большую селективность по отношению к фенольным АО. Правильность количественного определения природных фенольных АО оценена по методу “введено” – “найдено” при титровании модельных растворов. Степень открытия составляет 97-102 %, величина относительного стандартного отклонения не превышает 3 %, что свидетельствует об отсутствии случайной погрешности определения.
Подход применен для прямого определения фенольных АО в лекарственных формах [104] (Таблица 4.2). Показано, что вспомогательные компоненты таблеточной массы не оказывают мешающего влияния, поскольку не вступают в реакцию с титрантом.
Как отмечалось выше, фенольные АО взаимодействуют с протеинами, в результате чего, происходит изменение антиоксидантных свойств фенольных соединений. Разработка новых способов оценки взаимодействий фенольных АО с протеинами представляет интерес. Учитывая реакционную способность фенольных АО к электрогенерированным титрантам (брому и гексацианоферрат(III)-ионам), гальваностатическая кулонометрия предложена в качестве метода, позволяющего оценить влияние протеинов на фенольные АО.
Интенсивность взаимодействия фенольных АО с протеинами оценивали как долю свободного фенольного АО. Подход апробирован на примере систем фенольный АО – протеин, в частности, смесей рутина, кверцетина и таксифолина с молочными протеинами (казеином, БСА и -лактоглобулином).
Предварительно было проведено кулонометрическое титрование модельных растворов протеинов электрогенерированными титрантами. Установлено, что гексацианоферрат(III)-ионы не взаимодействуют с протеинами, что обусловлено слабой окислительной силой титранта и структурными особенностями протеинов, в частности, отсутствием в них реакционноспособных групп. Электрогенерирвоанный бром взаимодействует только с БСА с участием 126 электронов, что объясняется формой существования БСА и функциональными группами, присутствующими в его структуре. В кислой среде БСА существует в виде так называемой Е-формы (Рисунок 4.1), образующейся за счет разворачивания молекулы протеина с потерей третичной структуры и частичным (менее 40 %) сохранением вторичной структуры [442, 443]. В этом случае снимаются стерические препятствия для реакции протеина с титрантом. Рисунок 4.1 – Схематическое изображение Е-формы БСА в кислой среде. Рисунок 4.2 – Схематическое строение домена БСА. В структуре БСА присутствуют серосодержащие функциональные группы, которые вступают в реакцию с электрогенерирвоанным бромом, в частности, свободная SH-группа цистеина в положении 34 и 17 дисульфидных мостиков, которые образованы остатками глутатиона, метионина и цистеина (Рисунок 4.2) [444, 445]. Поэтому, в дальнейших исследованиях с БСА предварительно рассчитывали собственный вклад БСА и учитывали его при определении содержания свободного фенольного АО в смесях.
Комплексная электрохимическая оценка антиоксидантных свойств и качества коньяков и бренди
Одним из источников АО в рационе человека являются специи. Поэтому оценка их антиоксидантных свойств представляет интерес. Учитывая состав специй, можно считать, что наибольший вклад среди АО вносят фенольные соединения, которые легко окисляются в реакциях с электрогенерированными окислителями в условиях гальваностатической кулонометрии, а также на поверхности электродов в условиях вольтамперометрии. В качестве параметров, характеризующих антиоксидантные свойства специй, выбраны ЖВС и АОЕ.
Для извлечения АО из специй использовали жидкостную экстракцию этанолом и метанолом. Установлено, что однократная экстракция этанолом в течение 10 мин позволяет провести количественное извлечение компонентов.
Так, для гвоздики, кумина, имбиря, ягод можжевельника, перца красного сладкого и перца черного максимальное извлечение достигается при соотношении компонентов 1:2, для кориандра и корицы – 1:4, а для розмарина, орегано, перца красного, мускатного ореха и базилика и куркумина – 1:6. Полноту извлечения контролировали кулонометрически по реакции с электрогенерированными гексацианоферрат(III)-ионами.
Метанольные экстракты специй получали эстракцией в течение двух суток при соотношении сырье/экстрагент 1:12 для орегано, базилика и лаврового листа и 1:6 для остальных специй [455].
Установлено, что метанольные экстракты характеризуются более высокими значениями ЖВС и различие статистически значимо, что хорошо согласуется с литературными данными для растительного сырья [457]. Это, вероятно, связано с экстракционными свойствами метанола и временем экстракции, а также более высокой растворимостью многих АО в метаноле, чем в этаноле. Кроме того, метанол ингибирует полифенолоксидазы, предотвращая окисление фенольных АО в растительных материалах [458]. Тем не менее, максимальная ЖВС характерна для корицы, гвоздики и розмарина независимо от экстрагента.
Для дальнейших исследований использовали метанольные экстракты. Установлено, что индивидуальные АО специй (галловая и розмариновая кислоты, тимол, эвгенол и капсаицин) окисляются на СУЭ на фоне 0.1 М LiClO4 в этаноле при достаточно положительных потенциалах, близких по своим значениям (Таблица 5.2).
Соединение Структурная формула Галловая кислота OH HOJ\J \ OH HO - гґO Розмариновая кислота HOV OHO / /у Y OHO L ... OHOH Тимол XXH3Cf5 CH3 Эвгенол H3CO HO Капсаицин HO\ CH3H3CO р \/\/5 /\O В рассматриваемом ряду легче всего окисляется галловая кислота, что характерно для тригидроксибензолов. Тенденция Еокгалловой кислоты
Еокэвгенола Еоктимола хорошо согласуется с полученной ранее на СУЭ в среде ацетатно-фосфатного буферного раствора рН 7.0 [459]. Окисление протекает необратимо, о чем свидетельствует отсутствие ступеней на катодных ветвях вольтамперограмм (Рисунок 5.2).
Токи окисления растут по мере увеличения концентрации аналитов в электрохимической ячейке. Поскольку отклики АО на вольтамперограммах имеют форму ступеней, которые достаточно размыты в области малых концентраций, в качестве аналитического сигнала использовали площадь под кривой, то есть количество электричества, затраченное на окисление. Аналитические характеристики определения АО представлены в Таблице 5.3.
На основе полученных результатов по вольтамперометрии индивидуальных АО на СУЭ, предложен вольтамперометрический способ оценки АОЕ специй, основанный на окислении их компонентов в условиях ЦВА [460].
Установлено, что на вольтамперограммах метанольных экстрактов специй наблюдаются четко выраженные ступени и пики окисления, потенциалы и площадь которых зависят от вида специи. Некоторые примеры приведены на Рисунке 5.3.
Для большинства из них наблюдается пропорциональное увеличение площадей соответствующих ступеней окисления. Следует отметить, что в случае корицы, эвгенол не проявляет себя на вольтамперограммах, что подтверждается появлением нового пика при 1.04 В в присутствии стандартного раствора эвгенола. Исходя из величин степени открытия, можно сделать вывод, что аналитические сигналы экстрактов специй носят интегральный характер.
Так как в качестве стандарта для растительных материалов чаще всего используют галловую кислоту, АОЕ специй оценивали по интегральной площади ступеней окисления и выражали в ее эквивалентах в пересчете на 1 г специи. Результаты вольтамперометрического определения АОЕ представлены в Таблице 5.5. Полученные значения АОЕ обусловлены присутствием АО различных классов, входящих в состав специй. При этом на вольтамперограммах проявляют себя лишь те АО, содержание которых достаточно велико.
В целом, полученный ряд АОЕ согласуется с данными по ЖВС. Отличие для корицы, связано, с тем, что один из основных ее компонентов эвгенол не проявляет себя на вольтамперограммах ее экстракта, но вносит вклад в ЖВС.
Высокие значения АОЕ и ЖВС получены для гвоздики, что хорошо согласуется с литературными данными по суммарному содержанию АО в специях [463]. Ее основными АО являются эвгенол и галловая кислота [461].
Ягоды можжевельника показали достаточно высокие значения АОЕ, что обусловлено присутствием фенольных АО и хорошо согласуется с литературными данными по общему содержанию фенолов [464], антирадикальной активности и восстанавливающей способности метанольных экстрактов [465].