Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 9
1.1. Биосенсоры 9
1.2. Иммуносенсоры 21
1.2.1. Типы иммуноанализа 21
1.2.2. Типы детектирования, используемого в иммуноанализе. Прямое и непрямое детектирование 22
1.2.2.1. Пьезоэлектрические иммуносенсоры 23
1.2.2.2. Оптические иммуносенсоры 26
1.2.2.3. Электрохимические иммуносенсоры 30
1.3. Постановка задачи 41
Глава 2. Аппаратура и техника эксперимента 42
2.1. Оборудование и средства измерений 42
2.2. Реактивы, приготовление растворов 43
2.3. Методика эксперимента 45
Глава 3. Предварительные исследования 48
3.1. Выбор трансдьюсера 48
3.2. Выбор методики иммобилизации биорецептора на поверхности графитсодержащих трансдьюсера 55
3.3. Нанокомпозиционные материалы 59
3.4. Трансдьюсеры, модифицированные формазанами 65
Глава 4. Исследование возможности применения белка А в электрохимических иммуносенсорах 77
4.1. Белок А, меченый пероксидазой хрена. 77
4.2. Использование и разработка методов детектирования с использованием металлической метки 82
4.2.1. Белок А, меченый коллоидным золотом 82
4.2.2. Белок А, меченый коллоидным серебром 94
4.2.3. Использование а-фетопротеинов (АФП) в качестве модельной системы 112
Выводы 114
Список использованной литературы 116
- Иммуносенсоры
- Оптические иммуносенсоры
- Выбор методики иммобилизации биорецептора на поверхности графитсодержащих трансдьюсера
- Использование и разработка методов детектирования с использованием металлической метки
Введение к работе
Актуальность темы. Здоровье населения, диагностика опасных заболеваний на ранних стадиях, определение факторов, способствующих развитию в организме человека заболеваний, в том числе инфекционных, - все эти проблемы особенно остро стоят в настоящее время.
Огромной по своей важности проблемой является распространение в последние годы на достаточно обширных территориях опасных инфекций, таких как коклюш, дифтерия, гепатиты А, В и С, корь и многих других. Ситуацию с опасными инфекциями, как одну из наиболее актуальных, продемонстрируем на примере клещевого энцефалита. Энцефалит воспалительное заболевание головного мозга инфекционной или аллергической природы. Иксодовые клещи - переносчики вируса - обитают на огромной территории от берегов Тихого до Атлантического океана, от зоны вечной мерзлоты до степей и субтропиков. Естественно, что природные очаги заболевания разбросаны по всей этой территории. В 60-70-е годы вирус клещевого энцефалита поразил Дальний Восток. В начале 90-х годов отмечен резкий рост этого заболевания на Урале. В конце 90-х началось "продвижение" клещевого энцефалита в центр России. Зарегистрировано несколько случаев заболевания в США. Вирус выявлен в Германии, Австрии, скандинавских странах, Северной Италии, республиках бывшей Югославии. В России от клещевого энцефалита ежегодно страдают от 10 до 15 тысяч человек.
Первичный энцефалит - самостоятельное заболевание, которое обычно вызывается нейротропными вирусами, чаще всего передается человеку при укусе зараженными кровососущими членистоногими (клещами).
По тяжести клещевой энцефалит подразделяется на лихорадочную форму, менингиальную и самую тяжелую - паралитическую. На фоне заболевания развиваются общемозговые (нарушение сознания, психические расстройства) и очаговые неврологические симптомы. Может развиться отек мозга, который является наиболее частой непосредственной причиной смерти больного энцефалитом. Клещевой энцефалит - одно из немногих инфекционных заболеваний, способных переходить в хроническую стадию, которая зачастую приводит к летальным исходам или тяжелой инвалидности.
Существующие методы диагностики вируса клещевого энцефалита, во-первых, длительны во времени, во-вторых, требуют дорогостоящего оборудования (метод "иммунно-ферментного анализа" (ИФА)).
Именно в случае опасных вирусных инфекций особенно важной является диагностика, в идеальном случае, - на месте, в небольших клиниках, поскольку это является залогом успешного лечения и полного выздоровления больного.
Для решения этой проблемы требуется создание дешевых, простых, чувствительных и экспрессных методов диагностики и приборного обеспечения указанных методов. Привлечение электрохимических методов анализа, основывающихся на использовании биосенсоров для диагностики опасных инфекций, представляется весьма перспективным. Доказательством этому служит высокая чувствительность таких методов, хорошая воспроизводимость и селективность, простота аппаратурного оформления и возможность создания портативных приборов, пригодных для использования, как в лабораторных условиях, так и в небольших клиниках, низкая стоимость анализа по сравнению с другими методами. В последние годы наблюдается "взрыв" в количестве публикаций, посвященных развитию электрохимических биосенсоров для различных целей.
Настоящая диссертационная работа посвящена развитию новых подходов к созданию электрохимического иммуносенсора.
Ее актуальность определяется как изложенными выше соображениями, так и ожидаемым эффектом: упрощением и ускорением получения необходимой медицинской информации. Работа является частью исследований, проводимых на кафедре химии Уральского государственного экономического университета в рамках заданий Министерства образования РФ по следующим направлениям: «Развитие теоретических и практических основ электрохимического анализа
7 объектов окружающей среды и биологических материалов» (1996-2000гг.),
INCO - Copernicus "Biosensors for direct monitoring of environmental pollutants in field" (1998-2001 гг.), «Разработка лабораторного практикума по электрохимическим методам анализа. Аппаратурное и методическое обеспечение», (2003-2004 гг.). По теме: «Исследование и разработка новых методов иммобилизации биоматериала на поверхности электрода» (2003-2004 гг.) получен индивидуальный грант Минобразования России.
Цель работы. Создание нового электрохимического иммуносенсора, использование которого позволило бы исключить применение в анализе антивидовых антител, ферментов, специально вводимых реагентов, снизить предел обнаружения. Достижение этой цели потребовало проведения исследований и выбора: материалов, способных служить трансдьюсером - сигналопередающим элементом иммуносенсора; биораспознающего материала и способов его иммобилизации на поверхности трансдьюсера; «метки», генерирующей адекватный, чувствительный, легко измеряемый отклик.
Научная новизна. в качестве носителей металлической метки в электрохимическом иммуноанализе использованы коньюгаты белка А с коллоидным металлом (золотом, серебром). Исследовано распределение серебра в коньюгатах с разной концентрацией белка А и взаимосвязь электрохимического отклика с концентрацией и распределением металла в коньюгате; исключена стадия извлечения металла из сандвич - структуры перед его детектированием, что позволило осуществить прямое электрохимическое определение количества металла - «метки», входящего в состав сэндвич -структуры; - показана взаимосвязь электрохимического отклика с количеством металла - «метки», содержащегося в сэндвич - структуре и концентрацией искомых антител в растворе.
Практическая ценность работы. Создан новый электрохимический иммуносенсор для диагностики клещевого энцефалита. Использование этого сенсора позволяет исключить применение дорогих антивидовых антител, ферментов и введения специальных субстратов в анализируемый раствор.
Предложенный сенсор обеспечивает снижение предела обнаружения до 0,2 нг/мл в сыворотках крови инфицированных людей по сравнению со стандартным ИФА методом.
Простота и экономическая эффективность сенсора позволяет организовать иммуноанализ на месте в небольших клиниках.
Автор выносит на защиту следующие положения: результаты исследований различных способов иммобилизации биорецептора на поверхности различных графитсодержащих и нанокомпозиционных трансдьюсеров а также на поверхности трансдьюсеров, модифицированных формазанами: (адсорбции, сшивки, введение в мембраны. Выбор оптимального способа иммобилизации биораспознающего материала на поверхности трансдьюсера; обоснование использования в электрохимическом иммуноанализе в качестве носителя металлической метки белка А вместо антивидовых антител; обоснование использования коньюгата белка А - металл в качестве сигналообразующего компонента электрохимического иммуносенсора; сенсор для диагностики клещевого энцефалита, состоящего из трансдьюсера с иммобилизованным антигеном, на котором в процессе анализа возникает сэндвич - структура: антиген - антитело - белок А, меченый металлом; - результаты анализа сывороток крови инфицированных людей, подтвержденные данными независимого стандартного ИФА метода; - возможность расширения развитого подхода для создания иммуносенсоров.
Апробация работы.
Результаты исследований представлены на 5 Семинаре INCO - Copernicus "Производство лабораторных прототипов" (Отроковицы, Чехия, 1999 г.); на 5 Всероссийской конференции «Электрохимические методы анализа (ЭМА-99)» (Москва, 1999 г.); на 6 Семинаре INCO - Copernicus "Повышение производства и коммерциализации" (Лунд, Швеция, 2000 г.); на 4 Международном семинаре "Российские технологии для индустрии. Физические, химические и биологические сенсоры" (С-Петербург, Россия, 2000 г.); на научно -технической конференции с участием зарубежных специалистов "Датчик-2002" (Судак, Украина, 2002).
Выражаю искреннюю благодарность: научному руководителю д.х.н., профессору Брайниной Х.З.; главному врачу «Центра лабораторной диагностики здоровья матери и ребенка» г. Екатеринбурга, д.м.н. Бейкину Я.Б. за предоставление консультаций, биологических образцов, данных ИФА анализа; доценту кафедры энзимологии МГУ, к.х.н. Рубцовой М.Ю. за предоставление образцов коньюгата А, меченого серебром и электронно-микроскопические фотографии последних; зам. директору по научной работе НИЦ «ПМТ» ЦНИИ материалов (С-Петербург), д.т.н. Гордееву С.К. за предоставление нанокомпозиционных материалов; профессору кафедры органического синтеза УГТУ - УПИ (г. Екатеринбург), д.х.н. Липуновой Г.Н. за предоставление образцов формазанов.
Иммуносенсоры
К иммуноанализу относят методы, основанные на специфичном образовании комплексов антител с антигенами или гаптенами. Биосенсоры, у которых биорецептором служат антитела (антигены) или нуклеиновые кислоты, с последующим образованием специфических иммунокомплексов, называют иммуносенсорами. Выявление присутствия антител к определенным вирусам или микроорганизмам и их количество - важный критерий наличия или отсутствия у организма иммунитета к соответствующим заболеваниям. Выделяют гомогенный и гетерогенный иммуноанализ. В случае гомогенного анализа стадии разделения и промывания стадий анализа отсутствуют. Так же как и в классическом твердофазном иммуноанализе отличают конкурентный и неконкурентный (сэндвич-метод) методы анализа. В случае конкурентного иммуноанализа меченый антиген, который вводят в зону реакции в известной концентрации, конкурирует с антигеном, который содержится в исследуемом образце в реакции образования иммунокомплекса с антителами. В случае неконкурентного, так называемого сэндвич-метода, антиген иммобилизируют на носитель, затем добавляют анализируемый образец, содержащий антитела, инкубируют для образования иммунокомплекса с иммобилизированным антигеном.
После чего ячейку промывают и добавляют избыток меченых вторичных антител. Происходит связывание вторичных антител с первичными. Затем ячейку вновь промывают для удаления избытка меченых антител. После чего- либо добавляют субстрат (если в качестве метки применяют фермент) и определяют количество продукта ферментативной реакции, либо определяют концентрацию электроактивной метки. Таким же образом можно определять антигены, тогда в этом случае на носитель иммобилизируют соответствующие антитела. Современное состояние исследований в области иммуноанализа и Независимо от метода детектирования иммуноанализ можно разделить на прямой и непрямой. В первом случае используется измерение непосредственно взаимодействия антигена с антителом. Во втором же случае взаимодействие антигена с антителом определяют с использованием меченых компонентов. Работы, посвященные исследованию прямого (или безметочного иммуноанализа) весьма перспективны, особенно для определения in vivo в режиме реального времени, поскольку преодолеваются проблемы, связанные с применением дополнительных реагентов. Результаты исследований прямого детектирования антиген-антитело представлены в обзорах [33], [39]. Описаны иммуносенсоры для определения гемапротеинов (цитохрома с, миоглобина, гемоглобина) [40], а-фетопротеинов [41], гормона гонадотропина [42], аллостатина [43], трансферина [44]. Наиболее распространенными остаются электрохимические прямые иммуносенсоры. Это обусловлено высокой чувствительностью электрохимических сенсоров, возможностью получения необходимого предела обнаружения, экономичностью, чем, например, для оптических иммуносенсоров. Хотя и существует много больше публикаций, описывающих подобный эффект, чем те, что приведены, однако не вполне ясен механизм получения отклика: либо это транспорт ионов, либо изменение заряда на поверхности белка в результате образования иммунокомплекса.
В непрямом иммуноанализе реакцию образование иммунокомплекса детектируют, используя меченые компоненты - «метки». В качестве «метки» могут быть применены ферменты, ионы металлов или другие электроактивные соединения. В табл. 1.2, 1.3, 1.4 примеры различных иммуносенсоров. К сожалению, невозможно в одном обзоре отразить все многообразие созданных иммуносенсоров, однако некоторые представления о них мы попытались дать. В последнее время появляется все больше пьезоэлектрических иммуносенсоров, основанных на детектировании иммунологических реакций с использованием устройств на основе кварцевого резонатора. Резонансная частота колебания кварцевого кристалла зависит от его массы, поэтому можно определить образование иммунокомплекса по изменению массы кристалла. Связь изменения частоты колебаний с изменением массы описывается уравнением (1.6). Где AF - изменение частоты кристалла (Hz), F - резонансная частота кристалла (MHz), А - площадь кристалла (см ), AM - изменение массы кристалла. Одним из основных преимуществ пьезокристаллических иммуносенсоров является возможность прямого детектирования образования иммунокомплекса, без использования «метки» или дополнительных реагентов. Однако одним из недостатков таких иммуносенсоров можно считать неспецифическое связывание компонентов анализируемых объектов с поверхностью кристалла. Таким образом, снижается правильность и воспроизводимость анализа. К другому недостатку этих сенсоров можно отнести невозможность определения гаптенов из-за незначительного изменения массы при образовании иммунокомплекса, поэтому пьезоэлектрические иммуносеноры привлекательны для определения высокомолекулярных соединений. Опубликован ряд обзоров, посвященных разработке пьезоэлектрических иммуносенсоров [36], [45], [46].
Оптические иммуносенсоры
В оптическом иммуноанализе используют либо неферментные (флуоресцентные или люминесцентные) «метки», либо ферментные «метки», инициирующие реакции, в результате которых возникают окрашенные продукты. Количество публикаций посвященных разработке оптических иммуносенсоров довольно мало [38]. Многостадийность, продолжительность процедуры делает классический твердофазный иммуноанализ с использованием ферментов более привлекательным, чем применение иммуносенсоров. Существующие на сегодняшний день публикации указывают на то, что этот вид иммуносеноров остается пока менее разработанным, несмотря на ряд преимуществ по сравнению, например с электрохимическими иммуносенсорами. Значительная часть публикаций посвящена разработке электрохимических иммуносенсоров, основанных на электрохимическом детектировании «метки». Электрохимический иммуноанализ соединяет высокую чувствительность и относительную простоту электроаналитической техники с высокой специфичностью иммунореакций. Еще одним преимуществом электрохимического иммуноанализа является исключение влияния окраски матрицы. В табл. 1.4. представлены лишь немногие литературные данные по разработке электрохимических иммуносенсоров. Электрохимические иммуносенсоры можно разделить на потециометрические, амперометрические и вольтамперометрические. Потенциометрический метод основан на измерении потенциалов электродов. В 1975 году публикуется работа Джанаты [91].
Он предположил, что, так как антитело это белок, а белки в водных растворах это полиэлектролиты, то электрический заряд должен изменяться при взаимодействии антитела с антигеном. В последующие годы интерес к потенциометрическим иммуносенсорам значительно возрос. Объединение иммунных реакций и принципов вольтамперометрии (амперометрии) обеспечивает возможность разработки высокочувствительных, селективных, удобных для использования, дешевых иммуносенсоров. Амперометрические методы относятся к методам электрохимического анализа, в которых приложенное напряжение поддерживается постоянным, а протекающий через ячейку ток является функцией концентрации, времени и др. В этом методе измеренный ток пропорционален концентрации определяемого вещества [92]. В случае амперометрических иммуносенсоров определяют изменение концентрации электроактивного продукта ферментативной реакции, либо изменение концентрации электроактивной метки. Многообразие существующих и разрабатываемых иммуносенсоров определяется существованием различных биорецепторов, меток, гомо- и гетерогенных схем анализа, разнообразием физических трансдьюсеров, методов иммобилизации. Опубликован ряд обзоров, посвященных результатам исследований и разработки, амперометрических иммуносенсоров [33-35, 38]. Привлекательным для работы в полевых условиях является так называемый separation-free (без разделения) иммуноанализ [75, 90]. Канальный иммуноанализ, комбинированный с электрохимическими методами, определяется двумя подходами: Keay and McNeil [93] использовали трансдьюсер с коиммобилизированными с антителами пероксидазой хрена против атразина. Если коньюгат атразина с глюкозоксидазой взаимодействует с иммобилизированными антителами, то при добавлении глюкозы образуется Н202, которая по «каналу» диффундирует к иммобилизированной пероксидазе, активность которой может быть измерена при +50мВ.
Продукт Н2О2, образующийся в объеме деструктируют добавлением катал азы. Другой подход основан на том принципе, что и первый, за исключением: глюкозоксидаза иммобилизирована, пероксидаза является меткой [94]. В этом случае Н202 образуется у границы раздела трансдьюсера с раствором, а не в гомогенном растворе, поэтому деструкция с использованием каталазы не нужна. Для того, чтобы доказать преимущества разработанного иммуносенсора зачастую используют иммунные пары IgG кролика и мыши и анти-IgG в качестве модельных систем (табл. 1.2-1.4). Это связано не только с доступностью реактивов, но и возможностью легкого перехода к реальным системам. Амперометрические иммуносенсоры, основанные на измерении изменения концентрации продукта ферментативной реакции, являются наиболее распространенными. Наиболее широко используемыми в качестве метки ферментами являются щелочная фосфатаза и пероксидаза хрена. Примеры ферментных меток приведены в табл. 1.4. Щелочная фосфатаза катализирует реакцию дефосфорилирования различных фосфатов, например, фосфата п-аминофенола, продукт которой определяется амперометрически. Этот фермент высоко стабилен, однако одним из недостатков является его высокая стоимость. Пероксидаза хрена более доступна, чем, например, щелочная фосфатаза. Субстратом может служить йодид в присутствии Н2О2, а определяемым продуктом реакции иод [81]. В качестве субстрата могут быть использованы о-аминофенол, гидрохинон, о-фенилдиамин и др. также с Н2С 2, с последующим детектированием продукта реакции [73,78]. Интересный и перспективный подход к разработке новых иммуносенсоров заключается в использовании в качестве метки ионов металлов, коллоидных частиц металлов и др. В последнее время наблюдается повышенный интерес к применению таких меток независимо от метода детектирования.
Предложен иммуносенсор для определения карциноэмбрионического антигена (КЭА) в сыворотке крови [95] методом фототермальной спектроскопии. Используются анти- КЭА и коньюгат анти- КЭА с частицами коллоидного золота. Метод определения основан на сэндвич-схеме иммуноанализа. Предел определения КЭА составляет 0,078 нг/мл. Опубликована методика определения человеческого секреторного иммуноглобулина (s-IgG ) -антигена [96] методом термальной микроскопии. Иммобилизировали s-IgG на поверхности полистереновых шариков, затем добавляли анти- s-IgG-антитела, меченые коллоидным золотом, а свободный антиген вымывали. Коллоидные частицы золота использовали для определения человеческих иммуноглобулинов методом плазменного резонанса [97]. Предел обнаружения составил 6,7 рМ. Предложена методика селективного колориметрического определения полинуклеатидов, основанного на встраивании наночастиц золота (диаметром 13 нм) с олигонуклеатидами с последующей гибридизацией цепи и образованием агрегата Аи наночастицы/полинуклеатиды [98]. Опубликована методика определения тироидного стимулирующего гормона (ТСГ) с использованием в качестве метода детектирования сканирующий микроскопии [99]. Авторы применили как конкурентный иммуноанализ, так и сэндвич-анализ. В первом случае были иммобилизированы анти-ТСГ-антитела, после чего в реакционную зону добавляли как меченый колоидным золотом ТСГ, так и свободный (определяемый). Во втором случае были иммобилизированы антитела к ТСГ, затем в реакционную зону добавляли ТСГ и анти-ТСГ-антитела, меченые коллоидным золотом. Авторами показано, что сэндвич-анализ более чувствителен, чем конкурентный и предел обнаружения в первом случае составил 0,35 нг/мл, во втором - 40 нг/мл. Предложена методика сэндвич-иммуноанализа с использованием коллоидных частиц золота и инфракрасной спектроскопии [100]. В качестве модельной системы использовали гусиные IgG, кроличьи IgG и анти- IgG. В качестве детектируемого агента применяли
Выбор методики иммобилизации биорецептора на поверхности графитсодержащих трансдьюсера
В этом случае сигналом электронного переноса служит ток восстановления йода. Для получения электрохимического отклика ТГЭ помещали в ячейку, содержащую фосфатный буферный раствор, KJ и Н2О2. С целью выяснения оптимальных концентраций KJ и Н202 провели серию опытов Для этого сенсор помещали в электрохимическую ячейку, содержащую KJ и Н202 разных концентраций от 10"5М до 10"3М. Соотношение реагентов всегда составляло 1:1. В случае использования концентраций 10 4М KJ и 10"4М Н202 и 10"5М KJ и 10" 5М Н202 реакция протекала медленно, и максимальная величина тока устанавливалась в течение 5-10 минут. При концентрациях 10"3М KJ и 10"3М Н202, стационарная величина тока устанавливается через три минуты после смешивания реагентов. В дальнейшем использовали реагенты в последней концентрации. В качестве фона использовали фосфатный буферный раствор рН=7,2. Регистрировали циклическую вольтамперограмму. Пик восстановления иода наблюдали при потенциале 0,33В (рис.3.3). С целью использования для дальнейших исследований хроноамперометрического метода было необходимо выбрать потенциал восстановления иода.
Исследовали процесс восстановления иода при разных потенциалах: 0,13В, 0,2В, 0,25В. Как видно из рис.3.4, максимальный отклик наблюдается при потенциале 0,13В. В дальнейших исследованиях регистрировали хроноамперограмму при потенциале 0,13В. Полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с литературными [81].Для дальнейших исследований использовали ТГЭ, на рабочую зону, которого наносили 0,5 мл буферного раствора (рН=7,2), содержащего антиген вируса клещевого энцефалита (2,3 мг/мл), нормальную лошадиную сыворотку, Твинн-20 (на 100 мл ФСБ 0,1 мл НЛС и 2,0 мл Тв-20). Сенсор высушивали при температуре (37±0,1)С в течение 4 часов или при температуре 4 С в течение 12 часов. Затем определение антител проводили, как описано в гл.2 с использованием способа 1 (рис.3.5). Иммобилизацию биорецептора проводили, используя глутаровый альдегид, нафион, нитроцеллюлозу, метилтриметоксисилан (MTEOS), кроличьи очищенные иммуноглобулины. Использовали трансдьюсеры типов: (ТГЭ), и (ТУЭ). Применяли следующие методы иммобилизации антигена вируса клещевого энцефалита на поверхности трансдьюсера. Последовательно наносили 5% раствор глутарового альдегида и буферный раствор, содержащий нормальную лошадиную сыворотку, Твинн-20 (на 100 мл ФСБ 0,1 мл НЛС и 2,0 мл Тв-20) и антигена вируса клещевого энцефалита (2,3 мг/мл), затем высушивали в течение 4 часов при температуре (37±0,1)С. Вводили антиген вируса клещевого энцефалита в мембрану нафиона, для этого 0,2% или 0,02% спиртовый раствор нафиона смешивали с буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку, Твинн-20 (на 100 мл ФСБ 0,1 мл НЛС и 2,0 мл Тв-20) и антигена вируса клещевого энцефалита (2,3-5,0 мг/мл), затем смесь наносили на рабочую зону трансдюсера, после чего высушивали сенсор в течение 4 часов при температуре (37±0,1)С. Наносили 0,2 или 0,02% спиртовый раствор нафиона на слой уже адсорбированного (2,3 мг/мл) на поверхности трансдьюсера антигена. Вводили антиген вируса клещевого энцефалита (2,3-5,0 мг/мл) в пленку нитроцеллюлозы. Для этого 0,01 г нитроцеллюлозы растворяли в смеси, содержащей 0,5 мл толуола и 0,8 мл бутилацетата, затем перемешивали в течение 30 минут.
В смесь добавляли 0,2 мл антигена вируса клещевого энцефалита, затем перемешивали 3 минуты, добавляли 0,03 мл 25% глутарового альдегида и 2-3 капли гексана, вновь перемешивали и быстро наносили на поверхность трансдьюсеров [22]. Вводили антиген вируса клещевого энцефалита (2,3-5,0 мг/мл) в мембрану метилтриметоксисилана. Для этого 0,45 мл MTEOS смешивали с 1,0 мл этилового спирта (96%), 2,7 мл Е О дистиллированной и 0,1 мл НС1 (0,05М). Затем вмешивали 0,2 мл буферного раствора, содержащего нормальную лошадиную сыворотку, Твинн-20 (на 100 мл ФСБ 0,1 мл НЛС и 2,0 мл Тв-20). В смесь вносили 0,2 г угольного порошка. Смесь быстро наносили на рабочую зону трансдюсера через специальную маску [7]. Наносили на рабочую зону трансдюсера буферный раствор, содержащий очищенные кроличьи иммуноглобулины (2,3 мг/мл), высушивали в течение 4 часов при температуре (37±0,1)С, затем наносили раствор, содержащий антиген вируса клещевого энцефалита (2,3 мг/мл) и снова высушивали в течение 4 часов при температуре (37±0,1)С или при температуре 4 С в течение 12 часов. Исследованы также трансдьюсеры, включающие нанокомпозиционные материалы (гл. 3.3). Способы иммобилизации антигена с использованием формазанов рассмотрены в гл. 3.4. С целью выбора оптимального трансдьюсера и метода иммобилизации биоматериала на его поверхности использовали уже опробованный подход, заключающийся в образовании иммунокомплекса антиген-антитело, с последующим присоединением антител против человеческих антител, меченых пероксидазой хрена.
Определение антител проводили, как описано в гл.2 с использованием способа 1. Полезным сигналом является разность токов, наблюдаемая в присутствии и отсутствии антител в системе. Из таблицы 3.2 видно, что максимальная величина разности токов (полезный сигнал) наблюдается при использовании ТГЭ, на рабочую зону которого последовательно нанесены очищенные иммуноглобулины и антиген вируса клещевого энцефалита. Несколько меньший по величине, но более воспроизводимый сигнал получен при введении антигена вируса клещевого энцефалита в мембрану MTEOS, осажденную на рабочей поверхности ТУЭ-Е. Невысокие значения величин среднеквадратичного отклонения также наблюдается при последовательном нанесении глутарового альдегида и антигена на поверхность ТГЭ, а также нанесение 0,2% спиртового раствора нафиона на уже адсорбированный на рабочей поверхности ТГЭ антиген. Казалось бы, что оптимальными являются первые два метода. Однако второй из них нетехнологичен, так как требует быстрого (в течение нескольких секунд) нанесения реакционной смеси на электропроводную дорожку с помощью трафаретной маски, в ином случае происходит полимеризация смеси еще до нанесения ее на трансдьюсер. Предоставленные нашей лаборатории С-Петербургим НИИ «Материалов» нанокомпозиты, характеризовались наличием в них углеродных материалов двух типов: частиц наноалмаза, связанных в единый композит наноразмерной графитоподобной матрицей (рис.3.6) [109]. Поскольку нанокомпозиционные материалы имеют очень развитую поверхность, ожидали сильно выраженную адсорбцию биоматериала на поверхности биосенсора. В первых экспериментах использовали нанокомпозиционные материалы в виде таблеток. Метод иммобилизации антигена вируса клещевого энцефалита на их поверхности не отличался от выбранного в гл.3.2. и процедура иммуноанализа проводилась, как описано в гл.2 с использованием способа 1.
Оценить адсорбционную способность нанокомпозитов, произведенного в форме таблетки, оказалось невозможным. Циклические вольтамперограммы, приведенные на рис.3.7, имеют форму, характерную для электродов, имеющих очень высокую емкость двойного электрического слоя, что очевидно обусловлено весьма развитой поверхностью нанокомпозиционного материала, на который адсорбирован кислород, способный обеспечить протекание фарадеевского тока в широкой области потенциалов. Естественно, что на этом фоне полезный сигнал оказывается замаскированным. Чтобы уменьшить используемую поверхность трансдьюсеров и соответственно фоновые токи, изготовили трансдьюсеры в виде тонкой пленки композита на керамической подложке (рис.3.8). Вольтамперограммы, полученные с использованием вновь изготовленных трансдьюсеров в качестве иммуносенссоров, приведены на рис.3.9. Видно, что инкубирование сенсора в растворе, содержащем антитела против вируса клещевого энцефалита, сопровождается увеличением анодного тока, в то время как естественным было бы ожидать рост катодного тока, как следствие появления в растворе йода.
Использование и разработка методов детектирования с использованием металлической метки
Из результатов, приведенных в предыдущей главе, следует, что белок А образует сэндвич-структуру с иммунокомплексом, состоящим из антигена клещевого энцефалита и антител. В этой части работы была предпринята попытка заменить ферментную метку в белке А на металлическую: золото или серебро, с целью регистрации тока окисления металла, который, как ожидалось, будет локализоваться на поверхности сенсора в результате образования сэндвич-структуры. Исходными данными для выбора условий регистрации сигнала явились результаты, полученные в инверсионной вольтамперометрии. Известно [111], что количество металла, осажденного на поверхности электрода из перемешиваемого раствора прямо пропорционально концентрации его ионов в растворе и продолжительности осаждения. На рис.4.4 представлены вольтамперограммы электрохимического окисления золота, осажденного на поверхности ТГЭ из раствора 0,1М НС1, содержащего Аи3+ в разных концентрациях. Из рис.4.4, 4.5 видно, что величина сигнала возрастает при увеличении концентрации Аи3+ в растворе и продолжительности осаждения, откуда следует очевидный вывод о зависимости сигнала от количества золота на поверхности электрода. Этот факт дает основания ожидать, что ток окисления золота, коньюгированного с белком, может служить источником информации о количестве белков, меченных коллоидным золотом, локализованных на поверхности сенсора (рис.4.6.). Принимая во внимание предлагаемый ход анализа: образование иммунокомплекса на поверхности сенсора с последующей локализацией на антителах, связанных в иммунокомплекс, белок А, меченый коллоидным золотом, можно ожидать, что ток окисления золота дает информацию о наличии и количестве антител, локализованных на поверхности сенсора, при их концентрировании из раствора. Следующий эксперимент подтверждает справедливость высказанного положения. Трансдьюсер (ТГЭ) инкубировали в растворе белка А, меченого коллоидным золотом. В качестве фонового раствора использовали фосфатный буферный раствор (ФСБ). Регистрировали анодную вольтамперограмму в интервале потенциалов (0)В - (1,0)В. В случае холостого опыта в интервале потенциалов (0)В - (1,0)В ток окисления металла не появлялся (рис.4.7.).
Для исследования возможности использования белка А, меченого коллоидным золотом, применяли стандартную схему иммуноанализа. Иммобилизировали на поверхности сенсора антиген вируса клещевого энцефалита выбранным методом (гл. 3.3.). Далее определение антител проводили, как описано в гл. 2, с использованием способа 3. На рис.4.8 приведена зависимость полезного отклика (тока) от времени инкубации (формирования иммунокомплекса, с последующей локализацией белка А, меченого коллоидным золотом). Кривая выходит на насыщение при времени инкубации превышающей 30 минут, что связано с максимальным заполнением поверхности сенсора. В связи с этим в дальнейших исследованиях проводили инкубацию сенсора в растворе антител и последующую инкубацию в растворе белка А, меченого коллоидным золотом, в течение 30 минут. На рис. 4.9 представлена градуировочная зависимость логарифма максимального тока окисления золота от логарифма концентрации антител против клещевого энцефалита в интервале (10" - 10" ) мг/мл (коэффициент корреляции 0,99546). Рис. 4.7. Вольтамперограммы окисления золота, зарегистрированные с использованием толстопленочных графитовых электродов: не белок А, меченый коллоидным золотом (1) и содержащих (2) белок А, меченый коллоидным золотом. Фоновый электролит: 0,1 М НС1. полезного сигнала от времени инкубации. Концентрация 0,001 мг/млі. Предел обнаружения, рассчитанный по 3 а-критерию, составляет 5 10" 6мг/мл. В табл. 4.3 приведены аналитические характеристики определения антител против вируса клещевого энцефалита в разные дни с использованием разных сенсоров. Из этих данных видно, что значения среднеквадратичного отклонения не превышает 8,6%. Эти данные соответствуют концентрации антител 10"6 мг/мл. При меньших концентрациях сигнал выражен плохо, что, по-видимому, является следствием малого количества золота в сэндвич-структуре в этом случае, а также неравномерного его распределения в белке. Последнее явно видно на микроскопической фотографии (рис. 4.10). Далее вместо модельного раствора, содержащего антитела в ФСБ использовали реальную сыворотку крови инфицированных людей. 0,2 мл последней перемешивали с 0,1 мл НЛС 2,0 мл Тв-20 на 100 мл ФСБ и инкубировали сенсор в этом растворе. В качестве холостого опыта использовали сыворотки крови неинфицированных людей. Затем после инкубации сенсора в растворе белка А, меченого коллоидным золотом, регистрировали вольтамперограмму золота в описанных выше условиях. О наличии антител к вирусу клещевого энцефалита в растворе свидетельствовало появление пика окисления золота при потенциале 0,75В. Для расчета концентраций антител использовали градуировочную зависимость, приведенную на рис.4.9.
Результаты, полученные при анализе сыворотки крови на наличие антител против вируса клещевого энцефалита удовлетворительно согласуются с результатами, полученными с использованием ИФА метода (рис.4.11, табл. 4.4). Это подтверждает корректность использования белка А, меченого коллоидным золотом, вместо обычно применяемых антивидовых антител или белка А, меченых ферментами в иммуноэлектрохимическом анализе для определения иммуноглобулинов, в нашем случае антител против вируса клещевого энцефалита. Концентрация антител 10 мг/мл. Рис. 4.11. Сравнительные результаты определения концентрации специфических антител против вируса клещевого энцефалита в сыворотке крови инфицированных людей, полученные с использованием ИФА и предложенного метода. Иммунокомплекс: антиген-антитело-белок А, меченый коллоидным золотом. Таблица 4.4. Сравнительные результаты определения концентрации специфических антител против вируса клещевого энцефалита в сыворотке крови инфицированных людей, полученные с использованием ИФА и предложенного метода. Иммунокомплекс: антиген-антитело-белок А, меченый коллоидным золотом. Использование в качестве трансдьюсера ТГЭ, метода иммобилизации (гл. 3.3.), а также белка А, меченого золотом в качестве метки в электрохимическом иммуноанализе, позволяет получить корректные результаты, обусловленные тем, что удается исключить из процедуры анализа ферменты и субстратные медиаторные системы. Однако, доступный препарат белка А, меченый золотом, содержит золото в концентрации недостаточной для того, чтобы обеспечить анализ весьма разбавленных растворов. Предел обнаружения, достигнутый в изученном случае, составляет 5-10"6мг/мл, что не всегда достаточно для анализа в реальных условиях. Была сделана попытка получить коньюгат: белок-металл в более высокой концентрации, чем концентрация золота в коньгате с белком, которым мы располагали. В качестве метки-металла выбрали серебро, принимая во внимание более низкую цену, по сравнению с золотом, и удобные электрохимические характеристики. Стандартный потенциал серебра более отрицателен, чем стандартный потенциал золота и в области потенциалов разряда - ионизации серебра наблюдается меньше помех.