Ионохроматографическое определение анионного состава мочевых камней Юсенко Елена Валерьевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Литературный обзор 11

1.1 Важность определения анионного состава мочевых камней 11

1.1.1 Роль оксалат-анионов в организме человека 11

1.1.2 Присутствие оксалат-ионов в объектах исследования

1.1.2.1 Мочевые камни 14

1.1.2.2 Биологические жидкости 17

1.1.2.3 Пищевые продукты

1.2 Методы определения оксалат-ионов 22

1.3 Другие анионы, оказывающие влияние на образование мочевых камней в организме человека 24

1.4 Метод ионной хроматографии

1.4.1 Основы метода 29

1.4.2 Современное состояние метода 39

1.4.3 Применение метода ионной хроматографии для анализа

мочевых камней и биологических жидкостей 42

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 45

2.1 Растворы и реагенты 45

2.2 Колонки и сорбенты 46

2.2.1 Регенерация подавительной колонки 47

2.3 Приборы и оборудование 47

2.4 Объекты исследования

2.4.1 Мочевые камни 47

2.4.2 Биологические жидкости 48

2.5 Использованные методики 48

2.5.1 Определение среднеудерживаемых анионов сильных кислот 49

2.5.2 Определение слабоудерживаемых анионов слабых кислот 50

ГЛАВА 3. Пробоподготовка мочевых камней и биологических жидкостей для ионохроматографического анализа 51

3.1 Разработка методики пробоподготовки мочевых камней 51

3.2 Разработка методики пробоподготовки биологических жидкостей 53

ГЛАВА 4. Ионохроматографическое определение средне и слабоудерживаемых анионов в объектах 54

4.1 Оптимизация условий разделения среднеудерживаемых анионов 54

4.1.1 Определение оксалт-ионов 54

4.2 Оптимизация ионохроматографических условий разделения слабоудерживаемых анионов 63

4.3 Определение урат-ионов 67

4.4 Определение нитрит-, бромид- и нитрат-ионов 69

4.5 Схема организации ионохроматографического определения анионов, составляющих мочевые камни и потенциально участвующих в их формировании, в мочевых камнях и биологических жидкостях 74

4.6 Выводы к главе 4 76

ГЛАВА 5. Применение разработанных методик определения анионов для анализа мочевых камней и биологических жидкостей 78

5.1 Анализ мочевых камней. Применение результатов анализа для медицинской диагностики и профилактики заболеваний 78

5.2 Анализ биологических жидкостей. Применение результатов анализа для медицинской диагностики и профилактики заболеваний 87

ГЛАВА 6. Статистическая обработка данных анализа мочевых камней и биологических жидкостей. перспективы их использования для медицинской практики 101

6.1 Кластерный анализ 101

6.2 Корреляционный анализ 107

6.3 Сравнение результатов анализа мочевых камней, полученных методами ИХ, АЭС, РФА и ИКС 108

Выводы 112

Список литературы

• Присутствие оксалат-ионов в объектах исследования
• Регенерация подавительной колонки
• Разработка методики пробоподготовки биологических жидкостей
• Оптимизация ионохроматографических условий разделения слабоудерживаемых анионов

Введение к работе

Актуальность работы. Постоянный рост заболеваний, связанных с

камнеобразованием в организме человека, приводит к тому, что заболеваемость мочекаменной болезнью (МКБ) в различных странах мира составляет от 30 до 40% среди урологических больных, в России этой болезнью страдает 34,2%. Исследование химического состава мочевых камней (МК) является неотъемлемой частью обследования пациентов, страдающих МКБ, и обеспечивает необходимую информацию о типе нарушения обмена веществ и причинах камнеобразования, что служит основанием для назначения лечебной диеты с целью профилактики рецидивов заболевания. В настоящее время выявлено 45 видов МК, среди которых выделяют четыре основных класса: оксалатные (65% от общего числа камней), фосфатные (15%), уратные (10%) и смешанные (10%).

Причины и процессы образования МК в организме человека до конца не ясны, поэтому важной задачей современной урологии становится профилактика и ранняя диагностика МКБ, основанная на проверке различных гипотез и факторов, влияющих на образование камней. В связи с этим большое внимание уделяется изучению анионного состава МК и некоторых биологических жидкостей, таких как моча и плазма крови.

Современные методы анализа МК условно разделяют на три группы. К первой
относят методы, характеризующие фазовый состав МК, такие как рентгенографический
анализ (Ю.Г. Аляев; Г.М. Кузьмичева; М.Г. Чебнобровкин; М.О. Антонова; А.И. Анчаров),
ИК-спектроскопия (Ю.Г. Аляев; Г.М. Кузьмичева), поляризационная микроскопия,
термогравиметрия (М.О. Антонова; В.И. Руденко). Вторая группа включает методы изучения
морфологии и микроструктуры МК (О.А. Голованова). Третья объединяет различные методы
определения химического состава МК, включая спектральные (атомно-эмиссионный
(О.А. Голованова) и атомно-абсорбционный) анализы, электрохимические

(потенциометрический) методы, различные варианты хроматографии (М.О. Антонова) и
капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) (Z. Jarolimova). Большинство

вышеперечисленных методов малоселективны, трудоемки, позволяют проводить лишь качественный анализ МК, поэтому их применение в клинических лабораториях весьма ограниченно.

Ионная хроматография (ИХ) давно стала общепринятым методом анализа таких объектов, как природная и питьевая воды. Однако применение ИХ для определения анионного состава МК ограничивается двумя исследованиями. В ранней работе (W.G. Robertson, D.S. Scurr, A. Smith, R.L. Orwell) использовали ИХ c кондуктометрическим детектированием для определения оксалатов в МК. В другой работе (D. Yan, G. Schwedt)

приведен лишь пример ионохроматографического разделения четырех анионов (оксалат-, урат-, сульфат-, хлорид-) из экстракта МК без данных количественного определения. Трудности использования ИХ для определения анионов в МК связаны в первую очередь с трудоемкой пробоподготовкой образцов (переведением их в раствор). Несомненно, большую роль играет сложный состав раствора МК, содержащий разнообразные органические и неорганические компоненты, которые не всегда удается разделить.

В то же время задачи диагностики, лечения и профилактики требуют создания
экспрессных и простых методик исследования анионного состава МК. С учетом
вышесказанного разработка пробоподготовки МК для последующего

ионохроматографического определения анионов (оксалат-, фторид-, урат-, ацетат-, формиат-, нитрат-, нитрит-, бромид- сульфат-, фосфат-), составляющих МК и потенциально участвующих в их формировании, представляется актуальной. Решение данной аналитической задачи может расширить область применения метода ИХ в клинических лабораториях, позволит получить новые знания как об МК, так и о теории камнеобразования в целом, предотвратить рецидивы, понять процессы камнеобразования и улучшить способы ранней диагностики МКБ.

Цель работы. Разработка схемы и методик ионохроматографического определения анионов, входящих в состав мочевых камней и потенциально участвующих в их формировании.

Задачи исследования:

1. Разработка методики пробоподготовки МК для последующего определения анионов методом ионной хроматографии.

2. Оптимизация условий разделения и определения анионов, входящих в состав МК и потенциально участвующих в их формировании.

3. Разработка схемы ионохроматографического определения анионов, входящих в состав МК и потенциально участвующих в их формировании, в биологических объектах.

4. Применение разработанных методик для определения анионов в МК и других образцах сложного состава, таких как биологические жидкости.

5. Установление корреляции между содержаниями анионов в МК, а также содержаниями анионов в МК и биологических жидкостях.

Научная новизна. Разработаны условия пробоподготовки МК, включающие растворение МК с использованием минимально возможного количества кислоты, добавки катионообменной смолы для удаления избыточных содержаний катионов кальция и магния с целью предотвращения образования осадков в хроматографической колонке. Такой подход позволил количественно переводить все компоненты МК в раствор, пригодный для

ионохроматографического анализа. При этом впервые стало возможным проводить
химический анализ МК массой менее 10 мг, для разработанной методики необходимая масса
образца составляет 5 мг. Впервые предложена схема селективного определения анионов,
входящих в состав МК и потенциально участвующих в их формировании, в МК и
биологических жидкостях в двухколоночной (определение оксалат-, урат-, нитрат-, нитрит-,
бромид- сульфат-, фосфат-анионов) с одновременным кондуктометрическим и

спектрофотометрическим детектированием и в одноколоночной (определение фторид-, ацетат-, формиат-ионов) с кондуктометрическим детектированием ионохроматографических системах. Впервые проведено количественное определение 10 анионов в МК методом ИХ. Предложен новый вариант профилактики и диагностики МКБ, основанный на определении анионов, входящих в состав МК и потенциально участвующих в их формировании, в комплексе биологических объектов (МК, моча и плазма крови) методом ИХ.

Практическая значимость.

Разработанные условия пробоподготовки МК расширяют возможности области применения метода ИХ в клинических лабораториях. На практических примерах показана эффективность разработанного алгоритма определения анионов, входящих в состав МК и потенциально участвующих в их формировании, в биологических объектах. Разработанный подход определения анионов применим как для анализа МК, так и для анализа биологических жидкостей. Количественно определены оксалат-, фторид-, урат-, ацетат-, формиат-, нитрат-, нитрит-, бромид- сульфат-, фосфат-анионы при совместном присутствии в МК и биологических жидкостях.

Полученные результаты были использованы сотрудниками кафедры урологии, андрологии и сексологии ИПО Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.П. Войно-Ясенецкого (КрасГМУ) для изучения процессов формирования камней и развития МКБ, составления схемы лечебно-профилактических мероприятий; внедрены в раздел лекционного материала по МКБ в КрасГМУ. Результаты проведенного исследования позволили установить особую роль фторид-ионов, встречающихся практически во всех МК, в образовании МК. Новый подход в изучении химического состава МК впервые позволил выявить зависимости между содержаниями анионов, входящих в состав МК и потенциально участвующих в их формировании, в МК, а также содержаниями анионов в МК и биологических жидкостях.

На защиту автор выносит:

1. Методику пробоподготовки МК, позволяющую перевести все анализируемые

компоненты МК в раствор для последующего ионохроматографического определения.

2. Ионохроматографические методики определения анионов, входящих в состав МК и потенциально участвующих в их формировании, позволяющие селективно определять 10 анионов в МК с пределом обнаружения 1,0-10 мкг/л.

3. Схему определения анионов в МК и биологических жидкостях методом ИХ.

4. Результаты анализа 20 образцов МК и 40 образцов биологических жидкостей, проведенного с применением разработанной схемы ионохроматографического определения анионов, входящих в состав МК и потенциально участвующих в их формировании.

5. Результаты корреляционных зависимостей между содержаниями анионов в МК, содержаниями анионов в МК и биологических жидкостях.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены в виде устных и стендовых докладов на: 17^th European conference on analytical chemistry EUROanalysis 2013 «Challenges in modern analytical chemistry» (Польша, Варшава, 2013); International conference «Nutritional and Health» (Латвия, Рига, 2012); IX научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Россия, Красноярск, 2012); Молодежь и наука: VIII Всероссийской научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 155-летию со дня рождения К.Э. Циолковского (Россия, Красноярск, 2012); 16^th European conference on analytical chemistry Euroanalysis 2011 «Challenges in modern analytical chemistry» (Сербия, Белград, 2011); конференции Euro Food Chem XVI (Польша, Гданьск, 2011); «XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии» (Россия, Волгоград, 2011); Молодежь и наука: VI Всероссийской научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Россия, Красноярск, 2011); Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Россия, Краснодар, 2010). Часть работы была представлена на конкурсе У.М.Н.И.К.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 9 статей, в том числе 6 – статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 166 источников. Материал диссертации изложен на 132 страницах, включая 51 рисунок и 21 таблицу.

Присутствие оксалат-ионов в объектах исследования

Твердые минерально-органические образцы (мочевые камни) – это плотные нерастворимые образования, встречающиеся в мочевыводящих путях. Около 60-80% МК образованы неорганическими соединениями кальция (кальций-оксалатные и кальций-фосфатные или гидроксиапатитные) и только 7-10% – соединениями магния (ньюберит, струвит) [28]. В 7-15% случаях встречаются уратные и цистиновые камни, образованные солями мочевой кислоты и цистина. В большинстве случаев камни имеют смешанный состав, что связано с нарушением метаболизма и возможным наличием инфекции [29]. Они могут формироваться в любом отделе мочевой системы и значительно варьировать в размерах (от 1 мм до нескольких сантиметров).

Мочевые камни по своей природе неоднородны, их структура напрямую зависит от состава. Их макрокомпонентами являются, как правило, оксалат кальция и мочевая кислота; в качестве микрокомпонентов можно назвать фторид, ацетат, формиат, а иногда также тяжелые металлы [30], которые сложно определять большинством физико-химическими методов из-за низких содержаний. Форма вещества, входящего в состав мочевых камней, может быть различна. Часто соединения, присутствующие в камне, находятся в аморфном состоянии, что затрудняет их определение . Нередко и изоморфное замещение ионов, особенно это характерно для солей кальция и магния.

Знание структуры, химического состава мочевых камней крайне необходимо для получения информации о типе нарушения обмена веществ, причине камнеобразования, для выбора правильного лечения и диеты пациента [31], а также предупреждения повторного образования камней.

Для анализа МК используют как физические, так и химические методы, но в литературе практически нет примеров исследований, строящихся на систематическом сравнении данных разрушающих и не разрушающих методов анализа на больших выборках камней. Наиболее популярны в клинических лабораториях нашей страны: химические методы [32], рентгеновская дифракция, инфракрасная и оптическая микроскопия [7, 33, 34].

Химические методы основаны на специфических свойствах, которыми обладают определенные ионы или радикалы, присутствующие в образце. Наиболее распространен метод титрования. Его применяют для определения в мочевых камнях (после переведения их в раствор) ионов кальция, магния, фосфатов, оксалатов [35] и фторидов [36]. Для определения в мочевых камнях фторидов используют потенциометрическое титрование или колориметрический метод анализа [37]. Достоинством химических методов служит их доступность и простота. Они подходят для рутинных анализов в лабораториях, однако часто являются качественными или полуколичественными [38], длительны, требуют больших количеств анализируемых образцов, имеют существенные ограничения в чувствительности и специфичности, не дают никакой информации о кристаллической структуре камня и его морфологических характеристиках.

При необходимости исследовать морфологию, а также неоднородность камня используют микроскопию. Метод позволяет изучить внутреннюю структуру, определить ядро и различить, есть ли последовательность в промежуточных слоях или нет. Стоимость такого анализа достаточно низкая, но недостаток метода в том, что для его проведения и интерпретирования необходим высококвалифицированный персонал и специальная подготовка камня, заключающаяся в полировании его среза.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) является неразрушающим методом анализа мочевых камней, дает информацию о кристаллической структуре, в паре с анализом энергодисперсионных рентгеновских спектров одновременно может быть получена и информация об элементном составе образцов. Но этот метод, наряду с рентгеновской дифракцией, используется в лабораторном анализе мочевых ка мней реже из -за очень высокой стоимости необходимого оборудования и специальных условий для проведения анализов, часто отсутствующих в клинических лабораториях [39]. Для установления кристаллической структуры фаз, присутствующих в образце мочевого камня, используют метод рентгенофазового анализа (РФА), достоинством которого служит малый расход анализируемого образца, не б олее 5 мг. При этом возможность получения количественного соотношения фаз ограничена низкой чувствительностью метода (как правило , не превышающей 5 массовых процентов), не идентифицируются некристаллические и аморфные состояния, что значительно ограничивает возможности метода. Тем не менее, аппаратные возможности метода рентгенофазового анализа развиваются, и на современном оборудовании удается определить количественное соотношение фаз при использовании камней очень малого размера (0,5-1,0 мм в диаметре). Из микроскопических методов, применяемых в анализе мочевых камней, можно выделить инфракрасную спектроскопию (ИКС). Достоинства ИКС – малый объем анализируемых образцов, возможность определения органических соединений, некристаллических, аморфных и белковых примесей. Сложность анализа данным методом состоит в том, что наблюдается сильное мешающее влияние присутствующих веществ, проявляющееся в наложении полос на спектре, что значительно усложняет расшифровку и интерпретацию спектров. Часто невозможно идентифицировать вещества, присутствующие в микро-количествах [7, 33].

В некоторых работах [7, 40] описано применение термогравиметрии для анализа мочевых камней, однако термогравиметрия не отличается высокой воспроизводимостью, требует большого количества исследуемого образца, не позволяет определять многие соединения, например пурины. Для рутинного анализа мочевых камней в клинической практике те рмогравиметрия не может быть рекомендована.

Следовые количества оксалатов в мочевых камнях могут быть определены методом газовой храматографии-масс-спектрометрия [10, 41] с предварительной дериватизацией образцов. Сложная, длительная пробоподготовка образц ов с использованием вредных органических растворителей и дорогостоящего массспектрометрического оборудования не позволяют рекомендовать данную методику для рутинных клинических анализов. Данный метод селективен по отношению к оксалатам, но не дает никакой информации о других веществах, присутствующих в образцах, что значительно ограничивает возможности анализа и также делает его применение нецелесообразным в медицинских лабораториях.

Хотя существует множество методов анализа мочевых камней, установления их состава и структуры, ни один из них не является универсальным. Таким образом, чтобы получить необходимую максимально полную информацию об исследуемом образце, необходимо использовать комплексный анализ, состоящий как из неразрушающих, так и из разрушающих физико-химических методов анализа. Вместе с тем анализ единичного камня не представляет интереса, и достоверная информация, пригодная для построения закономерностей формирования камней, может быть получена только при условии комплексного изучения больших выборок однотипных по своему происхождению камней.

Регенерация подавительной колонки

Применение ИХ для определения анионного состава МК ограничивается двумя исследованиями. В работе W.G. Robertson, D.S. Scurr, A. Smith, R.L. Orwell [14] использовали ИХ c кондуктометрическим детектированием для определения оксалатов в МК. В другой работе D. Yan, G. Schwedt [15] приведен лишь пример ионохроматографического разделения четырех анионов (оксалат-, урат-, сульфат-, хлорид-) из экстракта МК без данных количественного определения. Трудности использования ИХ для определения анионов в МК связаны в первую очередь с трудоемкой пробоподготовкой образцов (переведением их в раствор ). Несомненно, большую роль играет сложный состав раствора МК, содержащий разнообразные органические и неорганические компоненты, которые не всегда удается разделить.

Для понимания процессов камнеобразования также необходимо исследовать ионный состав биологических жидкостей. Наиболее важная в данном случае – моча человека. В работе [149] описан простой, быстрый способ определения неорганического сульфата в плазме крови и моче человека методом одноколоночной ИХ с кондуктометрическим детектированием, который был использован для изучения влияния ацетаминофена в плазме крови и экскреции с мочой. Фосфат, сульфат и оксалат в сыворотке крови человека одновременно определены методом ИХ в работе [150], полученные результаты исследования позволили установить средние содержания этих анионов у здоровых людей. Проблема селективного определения ко мпонентов, близких по хроматографическому поведению, например, нитрат- и нитрит-ионов, в биологических жидкостях успешно решается путем использования спектрофотометрического детектирования [151-155]. Так, в работе [155] показана возможность определения семи анионов в моче человека при одновременном кондуктометрическом и спектрофотометрическом детектировании. Полученные результаты позволяют рекомендовать разработанную методику для применения в клинических лабораториях.

В работе J.M. Monaghan, K. Cook, D. Gara, D. Crowther [153] использовали градиентное элюирование с низкой концентрацией хлоридов в качестве элюента и прямого спектрофотометрического детектирования при длине волны 214 нм для определения нитритов и нитратов в сыворотке крови человека. Такие условия позволяют достичь хорошего разрешения пиков. Время проведения анализа сокращается за счет простой пробоподготовки образцов, которая состоит в центрифугировании. Этот метод эффективно используется при исследовании роли оксида азота в преэклампсии, гипертонического расстройства во время беременности.

В обзоре R.P. Singh, S.A. Smesko, N.M. Abbas [156] описано применение ионной хроматографии для определения анионов в моче и плазме крови человека. Наиболее часто для их анализа используют хроматографические с истемы, оснащенные кондуктометрическим или спектрофотометрическим детектором, но также существуют методики с амперометрическим детектированием для определения бромид-ионов в плазме крови человека.

В работах Г.М. Кузьмичевой [2, 3] был использован метод безреагентной ИХ для одновременного определения содержаний катионов (кальция, магния, калия, натрия) и анионов (хлорид-, сульфат-, фосфат-), а также цитрат-, изоцитрат- и урат-ионов. Предложенная методика позволяет не только одновременно определять тринадцать ионов в моче человека, в отличие от клинических анализов, которые позволяют определять десять ионов по отдельности, но и контролировать цитрат-ионы, которые оказывают влияние на камнеобразование.

Разделение мочевой кислоты и креатинина в моче человека с использованием гидрофильных хроматографических взаимодействий показано в работе Y. Zuo, Y. Yang, Z. Zhu, W. He, Z. Aydin [157]. Пробоподготовка образцов состояла в предварительном разбавлении, осаждении белка, центрифугировании и фильтрации. Мочевая кислота и креатинин были отделены от других компонентов в образцах мочи и количественно оценивали с помощью HILIC хроматографии. Пределы обнаружения составили 0,04 мг/мл для креатинина и 0,06 мг/мл для мочевой кислоты. Описанный метод позволяет быстро, точно и надежно проводить определение мочевой кислоты и креатинина в моче человека, так как они являются биомаркерами при нарушении функций почек в организме человека.

В другой работе [158] описано определение мочевой кислоты в моче человека без использования орга нических растворителей в подвижной фазе. А представленная методика простой пробоподготовки образцов мочи человека, включает центрифугирование и фильтрацию, что значительно сокращает время анализа и позволяет рекомендовать ее для рутинных анализов в клинических лабораториях.

Применение ИХ для одновременного определения в моче человека восьми ионов, влияющих на камнеобразование, позволило выявить изменение их содержания в зависимости от вида и сроков лечения [1]. Исследование проводили с использованием хроматографической колонки “IonPac AS11” (250х4 мм) с кондуктометрическим детектированием.

Задачи диагностики и профилактики МКБ требуют создания экспрессных и простых методик исследования анионного состава МК. Таким образом разработка пробоподготовки МК для определения анионов методом ИХ представляется актуальной. Решение этой аналитической задачи может расширить область применения метода ИХ в клинических лабораториях, позволит получить новые знания о МК и улучшить способы ранней диагностики МКБ.

Разработка методики пробоподготовки биологических жидкостей

Для изучения возможности определения оксалата с использованием данной системы установили время его удерживания в описанных ваше условиях для неорганических анионов, оно составило tR=13,7±0,l мин. Из литературных [70] и экспериментальных данных выявили, что определению оксалатов мешает присутствие сульфат-ионов (tR=12,2±0,l мин). На рис. 10 представлена хроматограмма модельной смеси, содержащей эквимолярные соотношения сульфат- и оксалат-ионов. Разрешение пиков составило Rs=l,16, что недостаточно для их количественного определения, RS 1,5 [70, 51]. Таким образом, определение оксалат-ионов в данных условиях нецелесообразно.

Для установления возможности селективного определения оксалатов в данной хроматографической системе было изучено влияние на степень разрешения пиков наиболее значимых факторов, таких как состав и объемная скорость элюента с помощью метода полного факторного эксперимента по классическим формулам [160], часть расчетов приведена ниже. Экспериментальные данные представлены в табл. 4. Таблица 4. Матрица планирования полного факторного эксперимента № опыта Xl X2 Уі y2 Уз У I II b= II /4 1 — — 1,16 1,15 1,17 1,16 2,4 5 1,25 bo

Значения Gтабл. Gэксп (0,7679 0,3) означают однородность дисперсии. Затем проверили значимость полученных коэффициентов. Для проверки значимости полученных коэффициентов необходимо рассчитать значение bi, которое было получено следующим образом:

Таким образом, из экспериментальных и расчетных данных получили, что модель неадекватна, оптимум близок, необходимо завершить эксперимент. Дополнительные проверки модели на адекватность по дополнительному опыту в центре плана о значимости нелинейных коэффициентов не показали адекватности данной модели. В результате выяснили, что колонка с сорбентом КанК-АСт, используемая в системе III, в оптимальных для работы условиях не обеспечивает возможности определения сульфат- и оксалат-анионов.

Сорбент КанК-АСт представляет собой ЦПИ, в котором акт сорбции-десорбции проходит внутри зерна. Диффузия внутрь зерна сильно удерживаемых анионов и особенно многозарядных с большим размером гидратированных ионов сильно затруднена, что увеличивает размывание пиков. Сульфат- и оксалат-ионы имеют близкие константы ионного обмена и времена удерживания. Вероятно, именно эти факторы не позволяют добиться удовлетворительного разделения этих анионов в данной системе.

Чтобы достичь селективного определения оксалат- и сульфат-анионов, исследовали хроматографическую систему Iк (с колонкой IC SI-90 4E), в которой применяли сорбент другого типа - поверхностно-привитой. В ходе изучения некоторых работ [161] и паспортных данных колонки IC SI-90 4Е, применяемой для разделения неорганических анионов, определили условия их наилучшего разделения, получив состав элюента 1,8 мМ NaCO и 1,7 мМ NaНCO, при объемной скорости элюента 1,0 мл/мин и кондуктометрическом детектировании (рис. 11). Рисунок 11. Хроматограмма модельной смеси неорганических анионов: F- (0,3 мг/л), Cl- (1,0 мг/л), NO3- (0,5 мг/л), PO43- (7,5 мг/л), SO42- (5,0 мг/л). Хроматографическая система Iк

Для изучения возможности определения оксалат-анионов с использованием данной системы установили его время удерживания в описанных выше условиях, оно составило tR=15,23±0,01 мин. Так же как и в предыдущей системе сульфат- и оксалат-ионы имели близкие времена удерживания, но степень разрешения пр и их эквимолярных соотношениях составляла уже Rs=1,64, что позволило проводить количественное определение оксалатов в МК (рис. 12).

Изучение мешающего влияния сульфат-ионов на определение оксалатов показало, что хроматографическая система Iк, с колонкой IC SI-90 4E, позволяет количественно определять оксалат -ионы при 20-ти кратном избытке сульфат-ионов (табл. 5). Хроматограмма модельного раствора двух анионов в соотношении С 2- /C 2- = 20 /1 приведена на рис. 13. Согласно литературным SO4 C2O4 данным [64] в большинстве биологических объектов и продуктах питания большего избытка сульфатов не наблюдается.

Оптимизация ионохроматографических условий разделения слабоудерживаемых анионов

При применении хроматографической системы Iф при =284 нм наблюдали пик со временем удерживания tR=20,87 ± 0,02 мин (рис. 19), который был идентифицирован как пик урат-ионов (C5H3O3N4-). На рис. 20 приведен спектр поглощения урат-ионов. Значение предела обнаружения у рат-ионов, рассчитанного по 3s-критерию, составило 0,03 мг/л. Диапазон линейности – 0,1-50 мг/л. Уравнение градуировочного графика S = 2,96104C + 9,47102, r = 0,9987, n = 5, Р = 0,95.

Хроматограмма модельной смеси урат-ионов (15 мг/л). Хроматографическая система Iф. Детектирование спектрофотометрическое при =284 нм В исследуемых образцах МК определены следующие анионы: нитрат-, сульфат-, оксалат-, ацетат-, формиат-, фосфат-, урат- и фторид-. Проводили пять параллельных определений, относительное стандартное отклонение (Sr), определения анионов во всех образцах не превышало 5%, а правильность определения в растворах образцов МК была проверена с применением метода «введено-найдено» (табл. 8), добавку анионов вносили в раствор после разложения МК. Значения показателей точности, правильности и прецизионности рассчитаны согласно МИ 2336-2002. Показатель повторяемости составил ог = 0,05; показатель воспроизводимости - aR = 0,07; показатель правильности -Ас = 0,31; показатель точности - А = 0,37. По полученным данным сделан вывод о том, что разработанная методика может быть рекомендована ля е лабораторного использования.

Чтобы показать, что разработанные методики применимы не только при анализе МК, но и для определения содержаний анионов в биологических жидкостях, провели анализ образцов мочи и плазмы крови с одновременным применением систем Iк и Iф [154, 155].

При анализе образцов плазмы крови человека (в условиях системы Iк) обнаружен большой, несимметричный пик хлоридов (рис. 21), затрудняющий определение фторид-, ацетат- и формиат-ионов, поэтому для их количественного определения применяли систему II. В то же время при анализе образцов плазмы крови и мочи, с использованием системы Iк наблюдали слабое разрешение хроматографических пиков нитрат-, бромид- и нитрид-ионов из -за влияния матрицы образца. На рис. 22 приведены хроматограммы пробы мочи человека и модельной смеси раствора с использованием хроматографической системы Iк.

Рисунок 21. Хроматограммы пробы плазмы крови человека (1) и модельной смеси анионов: F- (0,1 мг/л), Cl-(4,0 мг/л), NO3- (3,0 мг/л), PO43- (1,5 мг/л), SO42- (5,0 мг/л), С2О42- (1,0 мг/л) (2). Хроматографическая система Iк Рисунок 22. Хроматограммы пробы мочи человека (1) и модельной смеси анионов: F- (0,1 мг/л), Cl- (4,0 мг/л), NO3- (3,0 мг/л), PO43- (1,5 мг/л), SO42-(5,0 мг/л), С2О42- (1,0 мг/л) (2). Хроматографическая система Iк

Применение спектрофотометрического детектора с линейкой фотодиодов позволило количественно определить в биологических объектах не только нитрат-, но и нитрит- и бромид-ионы (рис. 23, 24). Для нитрит-, бромид- и нитрат-ионов установили оптимальные длины волн детектирования, по максимумам их спектров поглощения, они составили NO2-=208 нм, Br-=193 нм, NO3-=199 нм. Рисунок 23. Хроматограмма пробы мочи человека при =199 нм. Хроматографическая система Iф

Хроматограмма пробы плазмы крови человека при =199 нм (А) и соответствующие спектры поглощения (Б-Д). Хроматографичекая система Iф В анализируемых образцах удалось количественно определить нитрат-, бромид- и нитрит-анионы, воспользовавшись системой Iф. Метрологические характеристики разработанной ионохроматографической методики определения нитрат-, бромид- и нитрит-анионов при использовании системы Iф представлены в табл. 9.

В образцах плазмы крови и мочи человека количественно определяли фториды, бромиды, нитриты, нитраты, сульфаты, оксалаты, фосфаты, ураты, ацетаты и формиаты. Все анализы проводили в пяти параллельных измерениях, при этом относительное стандартное отклонение определения анионов в образцах мочи и плазмы крови не превышало 6 %. Правильность определения в образцах плазмы крови и мочи человека была проверена с применением метода «введено-найдено» (табл. 10, 11). Таблица 10. Результаты ионохроматографического определения анионов методом добавок в пробах мочи человека (n=5; Р=0,95)

С хема организации ионохроматографического определения анионов, составляющих МК и потенциально участвующих в их формировании, в мочевых камнях и биологических жидкостях Проблемы анализа компонентов в биологических объектах: - в образцах одновременно присутствуют как микро-, так и макрокомпоненты; - в образцах содержатся вещества, которые являются губительными для хроматографической колонки; - в образцах прис утствуют компоненты, времена удерживания которых, при данных условиях разделения совпадают, и наблюдается неудовлетворительное разделение пиков; - анализируемые образцы содержат компоненты, определение которых возможно лишь с применением разных детекторов. Поэтому создание универсальных методик анализа различных биологических объектов – актуально. Р азработанные ионохроматографические методики применимы как при исследовании МК, что расширяет область применения метода ИХ, так и для анализа образцов плазмы крови и мочи человека, а результаты такого комплексного подхода взаимно дополняют друг друга и позволяют получить новые знания о теории камнеобразования.

Результаты проведенных исследований позволили предложить схему ионохроматографического анализа МК и биологических жидкостей (рис. 25).

Рисунок 25. Схема организации ионохроматографического определения анионов, составляющих МК и потенциально участвующих в их формировании, в МК и биологических жидкостях Предлагаемая схема состоит из шести-восьми стадий, а анализ объекта включает два этапа. На первом этапе анализ проводят с одновременным применением хроматографических систем Iк и Iф. На втором этапе используют хроматографическую систему II для определения слабоудерживаемых анионов. Первичная информация может включать в себя предположительный состав и природу пробы, а также цель анализа и необходимую его точность. Исходя из предварительных сведений об объекте выбирают способ анализа, определяемые компоненты и устанавливают аналитическую задачу , затем проводят соответствующую пробоподготовку. Учитывая первичную информацию о пробе, подбирают оптимальные условия и проводят одновременный анализ в хроматографических системах Iк и Iф. В условиях системе Iк с кондуктометрическим детектированием определяют фторид-, хлорид-, фосфат-, сульфат- и оксалат-ионы. Используя систему Iф со спектрофотометрическим детектированием, количественно определяют нитрат-, нитрит-, бромид- и урат-ионы и качественно идентифицируют ацетат- и формиат-ионы. Если в области элюирования слабоудерживаемых анионов не обнаружены неразрешенные пики, то переходят непосредственно к представлению результатов анализа. Когда в области элюирования слабоудерживаемых анионов проявляются неразрешенные пики (Rs 1,5) проводят второй этап анализа, состоящий из прим енения одноколоночной хроматографической системы II для количественного определения фторид-, ацетат-, формиат-ионов. Затем обрабатывают и представляют полученные результаты анализа.