Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные наноматериалы в составе биосенсоров
1.1. Углеродные наноматериалы
1.1.1. Углеродные нанотрубки
1.1.2. Оксид графена и восстановленный оксид графена (графен) .
Наночастицы металлов
Способы получения наночастиц металлов
Варианты современного применения наночастиц металлов Гиперразветвленные полимеры Общая характеристика гиперразветвленных полимеров, их типы и применение Структура и свойства дендримеров
Использование наноматериалов при разработке некоторых биосенсоров .
Антидепрессанты как лекарственные препараты: ингибиторы каталитической активности моноаминоксидазы
Моноаминоксидаза и механизм действия Биогенные амины как субстраты моноаминоксидазы Методы определения некоторых лекарственных препаратов
Хроматографические методы определения антидепрессантов
Спектрофотометрические и другие методы определения антидепрессантов .
Постановка задачи, аппаратура, объекты исследования и условия эксперимента .
Постановка задачи Аппаратура и объекты анализа Реактивы и приготовление растворов Получение гомогенатов из растительного и животного материала Получение гомогената из свиной печени (моноаминоксидаза)
Получение гомогената из проростков пшеницы (L -цистеиндесульфгидраза)
Обработка экспериментальных данных
Глава 4. Влияние углеродных наноматериалов и наночастиц металлов на аналитические характеристики моноаминоксидазных биосенсоров
4.1. Природа формирования аналитического сигнала амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров 65
4.2. Модификация поверхности печатных графитовых электродов наноструктурированными материалами 67
Углеродные наноматериалы
Наночастицы металлов 75 99
Особенности получения биочувствительной части сенсоров
Биосенсоры на основе электродов, модифицированных углеродными наноматериалами и наночастицами металлов
Аналитические характеристики биосенсоров на основе электродов, модифицированных углеродными нанотрубками и наночастицами металлов, для определения антидепрессантов
Аналитические характеристики биосенсоров на основе электродов, модифицированных графеном и наночастицами металлов, для определения антидепрессантов Аналитические характеристики биосенсоров на основе электродов, модифицированных оксидом графена, для определения антидепрессантов
Кинетические параметры реакции ферментативного превращения субстратов моноаминоксидазы в присутствии антидепрессантов
Ингибирование иммобилизованной моноаминоксидазы в составе биосенсоров на основе модифицированных электродов (углеродные нанотрубки/ наночастицы металлов) в присутствии антидепрессантов Ингибирование иммобилизованной моноаминоксидазы в составе биосенсоров на основе модифицированных электродов (графен / наночастицы металлов) в присутствии антидепрессантов
Глава 5. Определение антидепрессантов в лекарственных препаратах и биологических жидкостях
Свойства некоторых антидепрессантов и лекарственных веществ с антидепресссивным действием 115
Определение лекарственных веществ в лекарственных препаратах 118
5.3. Оценка мешающего влияния лекарственных препаратов на аналитический сигнал моноаминоксидазных биосенсоров 119
5.4. Определение антидепрессантов разными методами 121
5.5. Определение антидепрессантов в урине 126
Заключение 130
Выводы 132
Список сокращений 134
Список литературы
- Способы получения наночастиц металлов
- Хроматографические методы определения антидепрессантов
- Получение гомогената из проростков пшеницы (L -цистеиндесульфгидраза)
- Биосенсоры на основе электродов, модифицированных углеродными наноматериалами и наночастицами металлов
Введение к работе
Актуальность темы. Современные тенденции развития биосенсорных технологий тесно связаны с применением наноструктурированных материалов, что приводит к появлению новых возможностей для совершенствования аналитических устройств, используемых при определении широкого круга биологически активных веществ.
Наиболее часто используемыми наноструктурированными материалами в составе сенсоров являются углеродные наноматериалы и наночастицы (НЧ) металлов. К ним относятся углеродные нанотрубки (одностенные и многостенные – МУНТ), оксид графена (ГО), восстановленный оксид графена (ВГО) и наночастицы золота (НЧAu). Несколько реже для модификации поверхности сенсоров применяют наночастицы серебра (НЧAg). Такое разнообразие наноматериалов объясняется особенностями и возможностями их в плане совершенствования и придания особых свойств поверхности электродов.
Помимо углеродных наноматериалов и НЧ металлов в составе сенсоров используются и другие компоненты, в частности гиперразветвленные полиэфирополиолы (ГРПО). Преимущества их заключаются не только в самой структуре, но и в возможности применять их как стабилизаторы углеродных наноматериалов или НЧ металлов. В то же время ГРПО практически для таких целей не использовались.
Области применения наноматериалов с каждым годом только расширяются. И одно из этих направлений – развитие биосенсорных технологий, связанных с использованием модифицированных наноматериалами сенсоров в медицинских и фармацевтических целях.
В настоящее время контроль качества лекарственных препаратов осуществляют чаще всего используя различные варианты хроматографии. Однако биосенсорные технологии как альтернатива этим методам завоевывают все более прочные позиции. Особенно, если применяют биосенсоры, созданные с применением современных наноструктурированных материалов. Поэтому разработка новых ферментных электродов с использованием таких подходов является актуальной задачей.
Среди разных групп лекарственных препаратов особое место занимают антидепрессанты (АД), так как контроль за их использованием является неотъемлемой частью их применения, учитывая, что многие из них относятся к препаратам строгого учета. Определение АД становится возможным благодаря наличию эффекта ингибирования по отношению к ферменту – представителю класса оксидоредуктаз – моноаминоксидазе (МАО). В то же время примеры моноаминоксидазных биосенсоров (МАО-биосенсоров) в настоящее время очень немногочисленны и предназначены для определения биогенных аминов и до последнего времени не применялись для определения АД.
Цель работы – создание амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров на основе печатных графитовых электродов, модифицированных наноструктурированными углеродными материалами и наночастицами металлов, для определения антидепрессантов в биологических жидкостях и в лекарственных препаратах.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить способы модификации поверхности печатных графитовых электродов как основы разрабатываемых МАО-биосенсоров различными углеродными наноматериалами и НЧ металлов;
идентифицировать НЧ на поверхности первичных преобразователей различными методами;
разработать способы использования карбокси – и аминопроизводных на платформе гиперразветвленного полиэфирополиола Вoltorn второго поколения (ГРПО Вoltorn H20-COOH и Вoltorn H20-NH2) в составе биосенсоров;
сопоставить аналитические возможности разработанных амперометрических МАО-биосенсоров, модифицированных различными наноматериалами;
- разработать методики высокочувствительного определения АД, предлагаемыми МАО-
биосенсорами в лекарственных препаратах, в урине, в том числе, в присутствии
лекарственных веществ разного терапевтического действия.
Научная новизна работы заключается в том, что впервые:
- разработаны амперометрические МАО-биосенсоры на основе печатных графитовых
электродов, модифицированных наноструктурированными материалами различной природы
(МУНТ, ВГО, ГО, НЧAu, Ag, Ni, Cu), предназначенные для определения АД в сложных
органических матрицах;
- выявлены модификаторы поверхности печатных графитовых электродов (дисперсии
МУНТ, ВГО и НЧAu и Ag в хитозане, а также НЧ, полученные в режимах циклической
вольтамперометрии (ЦВА) – Au и хроноамперометрии (ХА) – Ni, обеспечивающие
наилучшие аналитические характеристики разрабатываемых МАО-биосенсоров;
ГРПО Boltorn использованы как в составе модификатора поверхности электродов (стабилизатор наноразмерного ряда углеродных материалов и НЧ металлов), так и матричного компонента в составе биочувствительного компонента;
установлены наилучшие сочетания наноструктурированного модификатора (МУНТ в хитозане / НЧAu в хитозане), стабилизатора (ГРПО Вoltorn H20-COOH) и материала матрицы (ГРПО Вoltorn H20-NH2) биочувствительного слоя биосенсоров, обеспечивающие высокочувствительное определение АД и улучшенные аналитические и операционные характеристики;
показано, что лекарственные вещества с антидепрессивным действием (имипрамин, амитриптилин, тианептин, моклобемид, флуоксетин, фабомотизол, налтрексон, феназепам, гвайфенезин) оказывают ингибирующее действие на каталитическую активность иммобилизованной МАО в составе биосенсоров: в случае биосенсоров, модифицированных МУНТ и МУНТ/НЧAu, МУНТ/НЧAg - двухпараметрически согласованное (смешанное), в случае ВГО и ВГО/НЧNi - двухпараметрически рассогласованное (бесконкурентное) ингибирование;
- разработаны способы определения АД в присутствии лекарственных веществ с
различным терапевтическим действием предложенными амперометрическими
биосенсорами.
Найденные подходы, заключающиеся в выборе способа модификации поверхности
печатных графитовых электродов за счет подбора наноструктурированного материала,
стабилизатора размера НЧ и матричного материала биочувствительной части, обеспечивают
разработку амперометрических МАО-биосенсоров с заданными аналитическими
характеристиками.
Практическая значимость. Предложены новые варианты амперометрических МАО-
биосенсоров на основе печатных графитовых электродов, модифицированных
наноматериалами (углеродными и НЧ металлов).
Разработаны и апробированы методики высокочувствительного и селективного определения АД в фармацевтических препаратах и биообъектах (урина) при минимальной пробоподготовке, в том числе, в присутствии других лекарственных препаратов, соответствующие требованиям экспрессности и точности.
Модификация поверхности электродов рассматриваемыми наноматериалами в различных сочетаниях обеспечивает более высокочувствительное определение по сравнению с немодифицированными вариантами биосенсоров.
Предложены практические рекомендации по использованию разработанных МАО -биосенсоров для контроля качества лекарственных препаратов строгого учета, позволяющие проводить лекарственный мониторинг при лечении пациентов и внедрение приемов персонализированной медицины.
На защиту выносятся:
лабораторные модели амперометрических МАО-биосенсоров на основе печатных графитовых электродов, модифицированных углеродными наноматериалами (МУНТ, ГО и ВГО) в растворах хитозана или ГРПО Вoltorn H20-COOH и Вoltorn H20-NH2 и НЧ металлов (Au, Ag, Ni, Cu), влияние модификаторов на их аналитические характеристики;
влияние сочетания НЧAg, полученных в растворе ГРПО Вoltorn H20 и Н30, или электрохимически (НЧNi, Cu) с углеродными наноматериалами (МУНТ, ГО и ВГО) в составе биосенсоров на их аналитические возможности;
условия получения биочувствительной части МАО-биосенсоров с использованием ГРПО Вoltorn Н20-NH2 для обеспечения большей величины каталитической активности иммобилизованного фермента и улучшения операционных характеристик;
кинетические параметры ферментативных реакций с участием иммобилизованной МАО в отсутствие и в присутствии некоторых АД как ингибиторов рассматриваемого фермента;
- методики количественного определения лекарственных веществ с антидепрессивным
действием в лекарственных препаратах и биологических жидкостях (урина).
Степень достоверности и апробация работы. Представленные в работе выводы и заключения получены в результате анализа большого объема экспериментального материала с применением современных физико-химических методов. Морфология рабочей поверхности электродов для биосенсоров после модификации (углеродные наноматериалы, НЧ металлов) установлена микроскопическими методами (атомно – силовой и сканирующей
электронной микроскопией – АСМ и СЭМ). Для изучения свойств модифицирующих покрытий на границах раздела фаз электрод/модификатор и электрод/раствор применяли метод спектроскопии электрохимического импеданса (СЭИ), который позволил выявить наилучшие сочетания углеродный наноматериал / НЧ металла.
Результаты исследований были доложены и обсуждены на Всероссийских и с международным участием конференциях: «Материалы и технологии XXI века» (г. Казань, 2012, 2014), «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (г. Казань, 2012), «Электрохимические методы анализа - 2012» (г. Уфа, 2012), «Химия и медицина» (г. Уфа , 2013, 2015), «Менделеев 2013 - 2015» (г. Санкт-Петербург, 2013 - 2015), «Второй съезд аналитиков России» (г. Москва, 2013), «Новые химико – фармацевтические технологии» (г. Москва, 2012, 2014), «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (г. Краснодар, 2014), «Бутлеровское наследие – 2015» (г. Казань, 2015), «Химический анализ и медицина» (г. Москва, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 статей, входящих в перечень ВАК, и 17 тезисов докладов.
Личный вклад автора заключается в непосредственном участии на каждом этапе работы: от подготовки и выполнения экспериментальных исследований до обсуждения и оформления полученных результатов. Вся экспериментальная часть работы выполнена непосредственно самим соискателем.
Автор являлся исполнителем гранта Российского фонда фундаментальных исследований (грант 13-03-01101-а).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 48 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 239 ссылок и приложения.
Способы получения наночастиц металлов
ВГО и ГО – двумерные углеродные нанолисты. Различия между ВГО и ГО заключаются в том, что эти структуры в своем составе содержат гидроксильные группы (-OH) (для ВГО), карбонильные (-CHO), карбоксильные (-СOOH), гидроксильные (-OH) и эпоксидные (-С-O-C-) функциональные группы (для ГО). При этом у ГО преимущественно в реакциях участвуют функциональные группы, расположенные на ребрах (-CHO и -СOOH), а не в плоскости нанолиста (-OH и -С-O-C-). Это приводит к резкому различию в электропроводности наноматериалов и их способности образовывать дисперсии с различными растворителями. ВГО и ГО различаются не только функциональными группами, но и способностью диспергироваться в растворителях различной природы. ВГО образует наиболее стабильные дисперсии в неполярных и гидрофобных растворителях, ГО наоборот, в гидрофильных растворителях за счет большого количества кислородсодержащих функциональных групп [23]. ГО может образовывать стабильные дисперсии с различными органическими растворителями, например, N, N/ - диметилформамидом (ДМФА), N, N/ - диметилацетамидом и N – метил – 2 – пирролидоном [24]. По мнению авторов, также возможно диспергирование ВГО в водных растворах, например, в цетилтриметиламмоний бромиде, додецилбензилсульфонате натрия [25]. Авторы работы [26] считают, что в процессе получения дисперсий ВГО в органических растворителях для предотвращения его агломерации необходимо проводить предварительное диспегирование в смеси ДМФА – вода (9:1 по объему). При этом ВГО лучше диспергируется в ацетоне, диметилсульфоксиде (ДМСО), ацетонитриле, тетрагидрофуране, N – метил– 2 – пирролидоне и хуже в этаноле, диэтиловом эфире, толуоле.
Другие авторы считают, что N – метил– 2 – пирролидон, ДМСО и ДМФА оказывают практически одинаковый стабилизирующий эффект, лучший по сравнению с - бутиролактоном и водой [27]. Причем для повышения стабилизирующего эффекта с вышеперечисленными органическими веществами используют их сочетания с ацетоном, хлороформом, изопропанолом. В некоторых случаях такие сочетания действительно приводят к повышению стабилизирующего эффекта, однако этот эффект обычно является незначительным (увеличение примерно на 0.03 % по массе) [28].
Так как структура ВГО помимо - связей содержит и – связи, способствующие делокализации электронной плотности, то они легко взаимодействуют с органическими соединениями, что приводит к преимущественным реакциям электрофильного присоединения, чем нуклеофильного. Реакционная способность ВГО объясняется наличием дефектов в его структуре, причем наиболее способными к участию в различных реакциях являются напряженные участки [29, 30]. Для получения дисперсии ВГО в различных растворителях применяют УЗ обработку, что предовращает процессы агрегации [28].
В литературе часто ВГО называют графеновыми нанослоями (из них получаются ОУНТ) или нанопластинами (из них получаются МУНТ). Возможны одно- и многослойная (более 10 слоев) аллотропные модификации ВГО, что объясняется наличием – взаимодействия между его слоями [23].
Восстановление ГО может происходить следующими способами [31]: 1. Термическим, включающим термический отжиг, микроволновое облучение и фотовосстановление. 2. Химическим. 3. Многоступенчатым. 2. А). В качестве восстанавливающих химических реагентов используют: гидразин, NaH, NaBH4, LiAlH4, аскорбиновую кислоту, HI, гидрогуанин, пирогаллол, KOH, NaOH, NH2OH. При использовании гидридов необходимо учитывать их повышенную реакционную способность по отношению к воде. Можно отметить, что по мнению авторов работы [32], процесс восстановления ГО с помощью NaBH4 происходит более эффективно, чем при использовании гидразина. Литературные данные показывают [33], что использование NaBH4 является наиболее эффективным средством восстановления связей C = O в ГО, но не так хорошо восстанавливает эпоксидные и карбоксильные группы. Авторы работы [34] предлагают после восстановления с помощью NaBH4 для более полного восстановления использовать дополнительный процесс дегидратации, применяя концентрированную серную кислоту (98% H2SO4) при 180 С. Одним из лучших восстановителей ГО является HI [35]. При этом данным способом можно восстанавливать ГО как в виде порошка, так и в виде дисперсии [36]. Также можно отметить, что при восстановлении HI пленка ВГО является более гибкой и прочной, чем при использовании гидразина, а также менее толстой (примерно в 10 раз). Восстановление ГО можно проводить и с помощью KOH, NaOH [37], а также с помощью NH2OH [38].
Б). Фотокаталитическое восстановление связано с протеканием фотохимических реакций с помощью фотокатализаторов. Первыми фотокатализаторами можно считать TiO2 [39]. В процессе реакции при УФ - облучении происходит разделение зарядов на поверхности частиц фотокатализатора. В присутствии этанола образуются этокси -радикалы, в результате чего электроны накапливаются внутри частиц фотокатализатора. Накопленные электроны будут взаимодействовать с листами ГО для восстановления кислородсодержащих функциональных групп. Перед восстановлением карбоксильные группы в ГО могут взаимодействовать с гидроксильными группами на поверхности TiO2 с переносом заряда, при этом может образовываться гибридная структура между НЧTiO2 и листами ГО. Полученный при этом ВГО, может быть использован в фотоэлектрических устройствах [40]. Фотокатализаторами могут выступать НЧZnO [41] и BiVO4 [42].
В). Электрохимическое восстановление ГО до пленок ВГО обычно протекает в буферном растворе при комнатной температуре. В качестве подложек могут использоваться как СУ, так и другие инертные электроды, а также электроды из оксидов In или Ti. В качестве примера можно привести получение ВГО методом ЦВА в диапазоне потенциалов от 0 до – 1 В (отн. насыщенного каломельного электрода) в 0.1 моль/л растворе KNO3. При этом авторы работы установили [43], что в процессе восстановления наблюдаются пики от электрохимически необратимого процесса при потенциале - 0.6 или - 0.87 В.
Г). Восстановление с помощью растворителей под действием температуры происходит в закрытом контейнере, так, чтобы с увеличением давления температура растворителя была выше точки его кипения [44]. В гидротермальном процессе перегретая сверхкритическая вода может играть роль восстанавливающего агента и использоваться в зеленой химии.
Следует отметить, что гидротермальным путем из молекул углерода были получены гомогенные углеродные наносферы [45] и нанотрубки [46]. По мнению авторов работы [47], гидротермальный процесс может происходить для молекул воды в растворах ГО. Результаты показывают, что сверхкритическая вода не только частично удаляет функциональные группы ГО, но также восстанавливает ароматические структуры углеродного скелета. Исследование зависимости pH от фактора гидротермальной реакции показывает, что начальное значение pH 11 приводит к стабилизации раствора ВГО, в то время как значение pH 3 приводит к агрегации листов ВГО, которые не могут быть повторно диспергированы в концентрированном растворе аммиака. Этот процесс восстановления, возможно, протекает по аналогии с катализом протонов при дегидратации спирта, где вода выступает в качестве источника протонированных гидроксильных групп.
Авторы работы [48], в процессе сольвотермического восстановления ГО, используют в качестве растворителя ДМФА. Отличие состоит в том, что в процессе восстановления добавляют небольшое количество гидразина, как восстанавливающего агента. Однако, полученный таким образом ВГО, обладает высоким сопротивлением, а, следовательно, и низкой проводимостью, что возможно связано с допированием азотом ВГО.
Хроматографические методы определения антидепрессантов
Анализ литературных данных показывает, что применение углеродных нанотрубок и металлических НЧ может приводить к получению новых полезных свойств биосенсоров и такой вариант все чаще используется для модификации поверхности электродов при разработке современных вольтамперометрических (амперометрических) сенсоров и биосенсоров [138]. Хотя области использования биосенсоров в практических целях в настоящее время постоянно расширяются (химический синтез, контроль качества продукции, экоаналитический контроль, биомедицинские исследования), число используемых ферментов из большого количества известных на сегодняшний день невелико. Несмотря на достаточно большое количество уже существующих разработок биосенсоров на глюкозу, наиболее часто исследователи обращаются к совершенствованию именно этих устройств, применяя к ним соответствующие наноматериалы.
В качестве примера, можно привести определение глюкозы биосенсором с использованием НЧPt, инкапсулированных в ПАМАМ дендримере, полианилина, МУНТ и фермента глюкозооксидазы. Биосенсор имел линейный диапазон концентраций 0.001 – 12 ммоль/л и предел обнаружения (ПрО) 0.5 мкмоль/л [139]. По мнению авторов работы [140], определение глюкозы можно проводить с использованием ПАМАМ дендримера, ферроцена и глюкозооксидазы. В качестве рабочего электрода использовался золотой электрод. Линейный диапазон концентраций 1 - 22 ммоль/л и ПрО 0.48 ммоль/л. Для обнаружения глюкозы использовали метод ЦВА в ФБ растворе с солевым фоном с рН 7.5, со скоростью сканирования потенциала 100 мВ/с.
Примеры некоторых глюкозооксидазных биосенсоров, выполненных на основе электродов, модифицированных наноматериалами, приведены в таблице 9.
В последнее время все чаще исследователи обращаются к аналитическим устройствам, обладающим наряду с высокой чувствительностью еще и определенной избирательностью действия. К таким сенсорам можно отнести иммуносенсоры, которые применяются для определения антибиотиков и других БАВ.
Для определения пенициллина G методами ЦВА и СЭИ авторами работы [147] разработан иммуносенсор на основе СУ электрода, модифицированного двойной липидной мембраной, НЧAu и Ат против пенициллина G. Размер применяемых НЧAu составлял 16 нм. В качестве редокс - медиаторов в СЭИ выступала система 110-3 моль/л K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6]. Измерения методом СЭИ проводили в диапазоне частот от 0.1 до 105 Гц, при начальном потенциале 330 мВ, с шагом 10 мВ. В качестве фонового электролита использовали трис- буферный раствор с pH 8.0 в диапазоне потенциалов от - 0.4 до 0.6 В (отн. насыщенного каломельного электрода), при скорости сканирования 10 мВ/с. Отмечено, что использование НЧAu в составе иммуносенсора, по данным СЭИ, привело к значительному понижению сопротивления переноса электрона (примерно в 10 раз). В качестве референтного метода применяли высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Определение пенициллина G в молоке возможно в линейном диапазоне от 3.34 10-6 до 3.34 10-12 г/л с ПрО 2.7 10-13 г/л.
Примеры глюкозооксидазных биосенсоров на основе модифицированных электродов и их аналитические возможности (метод регистрации аналитического сигнала (АС) – ЦВА) Первичныйпреобразователь(электрод)/ модификатор Условия регистрации АС Диапазон рабочих концентраций, ПрО Ссылки Оксид индия и олова/хитозан – МУНТ –нанопроволока ФБ раствор с pH 7.0, V = 50 мВ/с 1 - 10 ммоль/л [141] СУ/ хитозан - МУНТ / НЧAu ФБ раствор с pH 7.4, V = 50 мВ/с 1 - 1000 10"6 моль/л, ПрО 0.5 10"6 моль/л [142] СУ/ МУНТ/желатин ФБ раствор с pH 7.0, V = 50 мВ/с 6.30 - 20.09 ммоль/л [143] СУ/ НЧAg/хитозан ФБ раствор с pH 7.5, V = 50 мВ/с 110-5 - 0.810-3 моль/л, ПрО 2.8310-5 моль/л [144] СУ/этилендиокситиофен, НЧАи 0.1 моль/л ФБ раствор с pH 7.0, V = 100 мВ/с 0.1 - 1510 3 моль/л [145] СУ/ НЧAu, Pt и наностержни ZnO K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1). V = 50 мВ/с 1.810-6 - 5.1510-3моль/л; ПрО 0.610-6 моль/л [146]
Для определения канамицина методами ЦВА и квадратно-волновой вольтамперометрии авторы работы [148] предлагают использовать СУ электрод, модифицированный ВГО с тионином, НЧAg@Fe3O4 (НЧFe3O4, интеркалированные НЧAg), Ат. Измерения проводили в 0.1 моль/л ФБ растворе с pH 7.4 при скорости наложения потенциала V = 100 мВ/с. Размер НЧFe3O4 составлял около 50 нм, а НЧAg около 10 нм. Для закрытия центров неспецифического взаимодействия применяли БСА. По мнению авторов работы, применение в составе иммуносенсора НЧ, ВГО и тионина приводит к появлению синергетического эффекта, что в свою очередь влияет на аналитические характеристики. Линейный диапазон определяемых концентраций канамицина 0.050 – 16 нг/мл с ПрО 15 пг/мл. Авторы работы [149] предлагают определять хлорамфеникол в молоке и меде методом хемилюминесценции, применяя иммуносенсор на основе микроплаты, модифицированной моноклональными Ат и НЧAg. При этом в роли метки антигена (Аг -антибиотик) выступали НЧAg и люминол. Специфичность взаимодействия Ат – Аг оценена в присутствии других антибиотиков (неомицин, ципрофлоксацин, офлоксацин, тетрациклин, стрептамицин). Применение НЧAg (размер около 38 нм) приводит к значительному увеличению аналитического сигнала. Линейный диапазон определяемых концентраций хлорамфеникола составляет от 1.0 10-6 до 1.0 10-8 г/мл с ПрО 7.6 10-9 г/мл.
Для определения - адреномиметика сальбутамола авторы работы [150] предлагают использовать иммуносенсор на основе золотого электрода, модифицированного МУНТ, ПХР, Ат, НЧFe3O4 @ НЧAu - ПАМАМ дендримером. Измерение в режиме ЦВА осуществляли в ФБ растворе с pH 7.2 в присутствии 0.2 моль/л KCl и 510-3 моль/л K3[Fe(CN)6], при скорости сканирования 50 мВ/с. Диапазон определяемых концентраций сальбутамола составлял от 0.11 до 1061 нг/мл с ПрО 0.06 нг/мл. Специфичность взаимодействия подтверждена в присутствии мешающих компонентов, в частности кленбутерола и рактопамина. Проведено определение сальбутамола в свином корме.
Можно отметить тенденцию, что определение маркеров онкологических заболеваний, чаще всего, проводится с использованием иммуносенсоров. Причем дендримеры практически не используют как модификаторы в чистом виде, чаще всего, совместно с другими наноматериалами, например, НЧ металлов.
Получение гомогената из проростков пшеницы (L -цистеиндесульфгидраза)
Использование углеродных нанотрубок. Анализ литературных данных показал, что дисперсии углеродных нанотрубок можно получить в различных растворителях [11, 12]. На первом этапе наших исследований использовали МУНТ, диспергированные как в водных растворах, так и в органических растворителях, в частности, ДМФА. Однако, как показали результаты проведенных нами экспериментов, такие дисперсии не позволяли получить покрытия электродов, обеспечивающие в дальнейшем надежный и воспроизводимый во времени устойчивый отклик соответствующих биосенсоров: водная дисперсия МУНТ не позволяла получить прочное связывание углеродных нанотрубок с поверхностью электродов, а ДМФА плохо испарялся с поверхности электродов. Поэтому использовали для этих целей на данном этапе исследований раствор хитозана. МУНТ диспергировали в уксуснокислом растворе хитозана в УЗ ванне (в течение 1 ч. при температуре Т = 35 оС).
Хитозан представляет собой полисахарид, биомакромолекулу, состоящую из сополимеров глюкозамина и N – ацетилглюкозамина. Он является полиэлектролитом поликатионного типа, обладает прекрасной биосовместимостью с физиологически активными веществами [202], хорошей способностью к пленкообразованию и адгезии, нетоксичен. Получается хитозан частичным деацетилированием хитина и широко используется в биологических исследованиях.
Предположительно стабилизирующий эффект хитозана связан с нековалентным и ковалентным взаимодействиями, происходящими между углеродным наноматериалом (МУНТ) и хитозаном, вернее с его аминными группами, что способствует образованию наноструктурированного материала хитозан – углеродный наноматериал, состав которого обеспечивает ему хорошую биосовместимость для последующих операций с биологическими препаратами при изготовлении биосенсоров [203].
Если рассматривать предполагаемый стабилизирующий эффект хитозана с позиции нековалентного взаимодействия, то тогда это объясняется адсорбцией молекул хитозана на поверхности углеродного наноматериала (МУНТ). Также хитозан может выступать в качестве катионного ПАВ, который стабилизирует дисперсию углеродного наноматериала в кислых водных растворах [202]. В составе биосенсоров до последнего времени использовали, в основном, дендримеры [126, 133]. Можно предположить, что ГРПО, относящиеся к достаточно доступным реагентам, имеющим относительно низкую коммерческую стоимость, которые могут выступать платформой для получения амино – или других производных, имеющие и другие определенные преимущества, в частности, отличающиеся нетоксичностью [125], также могут быть использованы в разных вариантах модификации поверхности электродов для биосенсоров. Поэтому представляло интерес, использовать растворы ГРПО Вoltorn H20 – COOH и Вoltorn H20 – NH2, позволяющие обеспечить новые свойства модификаторов поверхности электродов, тем более, что ранее такой вариант в литературе не рассматривался.
В этом случае МУНТ диспергировали в растворах ГРПО Вoltorn H20 – COOH или Вoltorn H20 – NH2 в УЗ ванне в течение 1 ч. при температуре Т = 35 оС. Поскольку ГРПО Вoltorn H20 – COOH в отличие от ГРПО Вoltorn H20 – NH2 не растворяются в воде, их растворяли в ДМСО.
ГРПО Boltorn Н20 – NH2 стабилизируют дисперсию МУНТ за счет водородных взаимодействий между аминными группами ГРПО и карбоксильными группами углеродных нанотрубок и предположительно ковалентного взаимодействия аминных групп ГРПО и карбоксильных групп углеродных нанотрубок, что может привести к образованию амидных связей.
В случае ГРПО Boltorn Н20 – COOH помимо водородного взаимодействия возможно и предположительно ковалентное связывание, но уже с образованием сложноэфирных связей между карбоксильными группами ГРПО и гидроксильными группами МУНТ.
Оксид графена, восстановленный оксид графена и его модификации. Для получения модифицированных электродов применяли не только МУНТ, но и другие углеродные наноматериалы, в частности ГО. Для получения однородной дисперсии ГО использовали уксуснокислый раствор хитозана с концентрацией 1.0 мг/мл, который подвергали УЗ обработке при температуре 35 оС. Применение раствора хитозана обеспечивало успешное закрепление ГО на поверхности электрода [204].
При получении дисперсии ГО концентрацию хитозана варьировали от 0.5 до 1.25%. Было установлено, что раствор 0.75 % хитозана позволяет получить более воспроизводимый отклик биосенсора, поэтому в дальнейшем использовали раствор именно с такой концентрацией. Однородность используемого для модификации поверхности электрода раствора ГО поддерживали периодической (не менее раза в месяц) обработкой УЗ. Функционализированный ВГО (см. главу 3, раздел 3.3) диспергировали в уксуснокислом растворе хитозана в УЗ ванне в течение 1 ч. при температуре 35 оС. Это позволило получить однородные дисперсии функционализированного ВГО в хитозане [205].
За счет положительного заряда протонированной аминной группы хитозана и отрицательного заряда функциональной группы углеродного наноматериала, так же как для МУНТ, между ними происходит электростатическое взаимодействие. Хитозан может взаимодействовать не только с углеродными наноматериалами, но и с поверхностью электрода за счет водородных связей, возникающих между аминными группами хитозана и гидроксильными группами, расположенными на поверхности печатного графитового электрода [203].
Углеродные наноматериалы на поверхности электрода. Применение полученных дисперсий углеродных наноматериалов для модификации поверхности печатных графитовых электродов, используемых в качестве первичных преобразователей, является следующей стадией разработки амперометрических биосенсоров.
Обработка углеродных наноматериалов в смеси разбавленных кислот (см. главу 3, раздел 3.3) привела к повышению гидрофильности и появлению новых кислородсодержащих групп (– СOOH и – CHO) у МУНТ и ВГО. В результате этих операций, например, ВГО как модификатор получил возможность более прочного закрепления на поверхности печатного графитового электрода.
Для доказательства наличия у ВГО новых кислородсодержащих функциональных групп были изучены ИК - спектры, на которых наблюдаются полосы при 1628 см-1 и 3500 см-1, соответствующие колебаниям – OH групп и водородным взаимодействиям соответственно. При 1315 см-1 наблюдаются колебания, характерные для карбонильной группы ГО. Полосы при 1408 и 1437 см-1, 1730 см-1 относятся к валентным колебаниям COOH групп, C-O и C=O соответственно. При 1200 и 1250 см-1 идентифицированы эпоксидные группы (С-О-С связи), которые характерны для ГО (рисунок 10). Приведенные на ИК - спектре пики доказывают, что в процессе кислотной обработки у ВГО появляются карбоксильные группы (валентные колебания COOH групп C=O - 1690 см-1 и C-O -1405 см-1), но при этом не присутствуют эпоксидные группы, что указывает на целенаправленный характер функционализации [206].
Биосенсоры на основе электродов, модифицированных углеродными наноматериалами и наночастицами металлов
Полученные значения t- и F- критерия (см. таблицу 36) позволяют сделать вывод о том, что результаты определения амитриптилина разными способами незначимо различаются между собой и вклад систематической погрешности незначим. в) Определение антидепрессантов с помощью L - цистеиндельфгидразного биосенсора. Титриметрия и спектрофотометрия относятся к общепризнанным методам, используемым для определения лекарственных веществ. В то же время мы видим, что существуют концентрационные ограничения по определению АД этими методами. В то же время амперометрические биосенсоры имеют гораздо более широкую рабочую область концентраций – несколько порядков, поэтому сопоставление результатов, полученных разными биосенсорами, может дать дополнительную информацию о правильности полученных результатов МАО-биосенсорами. И этим условиям удовлетворяет L - цистеиндесульфгидразный биосенсор. L - цистеиндесульфгидраза (L-цистеин-сероводород-лиаза, цистотионин-g-лиаза) – фермент класса лиаз (КФ 4.4.1.1), который катализируют негидролитические реакции отщепления сульфгидрильных групп с образованием двойных связей. В состав его активного центра входит пиридоксальфосфат. В основе функционирования ЦДГ лежит процесс ферментативного превращения цистеина до пируват-иона, аммиака и сероводорода [234-237].
Сульфгидрильная группа (-SH) цистеина весьма реакционноспособна; она может окисляться спонтанно и под влиянием специальных ферментов. При определенных условиях цистеин легко отдает водород, и тогда две молекулы цистеина образуют через дисульфидную связь (-S-S-) новую аминокислоту цистин. Цистеин и цистин могут легко превращаться друг в друга при окислительно-восстановительном процессе, который играет важную роль в регуляции процессов обмена.
ЦДГ является доступным ферментом, поскольку его можно выделить из растительных тканей в виде гомогената (см. главу 3, раздел 3.4) [234.]
В ходе исследования проведено сопоставление аналитических возможностей разработанных МАО - биосенсоров 2 типа (модификатор МУНТ - хитозан/ НЧAu - ЦВА); 5 типа (модификатор МУНТ- Н20 - NH2) с L- цистеиндесульфгидразными биосенсорами (ЦДГ - биосенсорами). Следует отметить, что принцип действия ЦДГ-биосенсоров основан на других реакциях и закономерностях, чем у МАО-биосенсоров. В частности, они относятся к, так называемым, ингибиторным биосенсорам как и МАО-биосенсоры, но ингибирующее действие на фермент оценивают по количеству цистеина не вступившего в реакцию с ЦДГ. МАО-биосенсоры позволяют оценить количество ингибиторов по количеству выделившегося в ходе ферментативной реакции продукта. Поскольку было установлено, что амитриптилин и некоторые другие АД обладают ингибирующим действием на ЦДГ [234, 235], то ЦДГ-биосенсоры могут быть использованы для оценки правильности результатов, получаемых с помощью МАО-биосенсоров. Аналитические возможности ЦДГ-биосенсора при определении амитриптилина представлены в таблице 37.
Анализ аналитических возможностей ЦДГ - биосенсора и МАО-биосенсоров 2 и 5 типов (см. таблицу 23) показал, что самый широкий диапазон определяемых концентраций наблюдается для МАО - биосенсора 2 типа (110"4 - 110"9 моль/л). Область рабочих концентраций для ЦДГ - биосенсора на основе модифицированного печатного графитового электрода сопоставима с этой аналитической характеристикой МАО -биосенсора 5 типа (110110"8 моль/л). Коэффициент чувствительности и корреляции сопоставим с МАО - биосенсором 2 типа, а с„ - с МАО - биосенсором 5 типа.
Правильность получаемых результатов определения амитриптилина подтверждена методом «введено – найдено». Погрешность определения не превышает 0.076 (Sr), что представлено в таблице 38.
Так как большинство лекарственных препаратов выводится из организма с мочой, то представляет интерес разработать способы их определения в данной биологической жидкости с помощью разработанных МАО – биосенсоров. Для этой цели на разных этапах исследования были использованы следующие типы МАО – биосенсоров: 3 типа – модификатор МУНТ - хитозан/ НЧAu - хитозан; 4 типа - модификатор МУНТ - хитозан / НЧAg - хитозан; 9 типа - модификатор МУНТ - H20 – COOH/ НЧ Ag - H30 pH 10.0; 10 типа - модификатор МУНТ- H20 – COOH/НЧNi - ХА; 13 типа - МАО биосенсор, модификатор ВГО – хитозан /НЧNi - ХА.
Поскольку в состав урины входят компоненты, которые могут окисляться в рабочей области используемых потенциалов, в частности, мочевая кислота [238], то была предпринята попытка смоделировать влияние матричных компонентов урины. Для этой цели была получена так называемая «искусственная» урина (модельный раствор), содержащая креатинин, мочевую кислоту, мочевину, KCl, NaCl, MgSO4 и CuSO4 в количествах, отвечающих среднему содержанию их в исследуемой биологической жидкости, согласно литературным данным [239]. Предлагаемые биосенсоры были апробированы при определении лекарственного препарата «Мелипрамин» в модельном растворе урины.
Установлено, что линейная зависимость между концентрацией лекарственного вещества и величиной аналитического сигнала на фоне модельного раствора наблюдается в одной и той же области концентраций, что и на фоне буферного раствора при условии разбавления исходного раствора в 50 раз. Этот параметр был определен экспериментальным путем. Полученные результаты приведены в таблице 39 [234, 235].