Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль агротехнических приемов в формировании микробного сообщества агроценоза 10
1.1. Процессы, связанные с корневыми выделениями растений
1.1.1. Ризодепозиты. Регуляция компонентов экссудации
1.1.2. Роль корневых экссудатов в перераспределении питательных элементов в почве 14
1.1.3. Микробные взаимодействия и биоконтроль в ризосфере 16
1.1.4. Микоризные грибы и ризодепозиты 19
1.2. Биоразнообразие почвенных микроорганизмов. Влияние агротехнических приемов на разнообразие микробных сообществ 25
1.3. Влияние агротехнических приемов на эмиссию диоксида углерода и увеличение автохтонного органического вещества почв 31
1.4. Влияние различного сельскохозяйственного использования почв агроценозов на цикл метана 35
1.5. Методы изучения микробных сообществ почв агроценоза 40
Заключение к главе 1 47
Глава 2. Объекты и методы исследования 49
2.1. Полевой опыт 49
2.2. Метеорологические условия в период проведения исследований
2.3. Агрохимические методы 52
2.4. Микробиологические методы 53
2.4.1. Определение состава микробного сообщества методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии по липидным профилям и маркерам суммарной биомассы 53
2.4.2. Методы оценки биологической активности почв 55
Глава 3. Влияние технологий возделывания сельскохозяйственных культур на агрохимические свойства почвы, урожайность и продуктивность севооборота 56
3.1. Агрохимическая характеристика серой лесной почвы
3.2. Урожайность и качество возделывания культур
3.2.1. Урожайность и качество зерна озимой пшеницы
3.2.2. Урожайность и качество зерна озимой ржи 60
3.2.4. Урожайность и качество зерна яровой пшеницы 61
3.2.5. Урожайность и качество зерна овса 63
3.2.6. Урожайность картофеля 64
3.3. Продуктивность сельскохозяйственных культур 64
Глава 4. Влияние технологий возделывания сельскохозяйственных культур на микробиологические свойства серой лесной почвы 67
4.1. Численность, структура и биоразнообразие микробного сообщества 67
4.2. Грибы, AM грибы 83
4.3. Взаимосвязь микробиологических показателей с продуктивностью агроценоза 89
Выводы 92
Литература 95
Приложения 121
- Ризодепозиты. Регуляция компонентов экссудации
- Метеорологические условия в период проведения исследований
- Урожайность и качество возделывания культур
- Грибы, AM грибы
Введение к работе
Актуальность. Почвенная биота - "биологический двигатель планеты" [Bloem et al., 1994] обеспечивает экосистемные функции по поддержанию качества окружающей среды [Kaur et al., 2005], и микроорганизмы играют ключевую роль в осуществлении этих процессов. В полной мере это относится к агроэкосистемам, где микроорганизмы выступают потенциальным индикатором их здоровья.
Одним из приоритетных направлений в области охраны природы является сохранение ее биоразнообразия. Особое место отводится правовому регулированию данной проблемы. В настоящее время разработаны механизмы международного взаимодействия для реализации требований Конвенции о биологическом разнообразии, выполнения Россией обязательств по международным договорам и соглашениям в области сохранения биоразнообразия; принята Национальная стратегия, где наряду с другими объектами названы агроценозы:
в документе «Национальная стратегия сохранения биоразнообразия России» (от 5. 06. 2001 г.) среди десяти экосистем, к охране которых привлечено внимание, находятся Агроэкосистемы;
отдельной задачей исследований в этом направлении выделена «разработка научных основ сохранения биоразнообразия агроценозов».
Сохранение биологического статуса, который обеспечивает гомеостатическую стабильность сельхозугодья — его продуктивность, является важным аспектом концепции интенсивного земледелия. В большой степени, помимо биоразнообразия, это относится к структуре микробного сообщества почв и направленности микробиологических процессов, играющих определяющую роль в функционировании круговоротов биогенных элементов. Известно, что агрохимические средства обычно увеличивают количество органического вещества почв (Сорг)5 что способствует повышению общей численности микроорганизмов [Ни et al.,
5 1999; Pascual et al., 2000; Лебедева, Едемская, 2005]. Однако применение как органических, так и минеральных удобрений и даже совместное их внесение может приводить к быстрой минерализации органического вещества почв [Ajwa, Tabatabai, 1994; Kandeler, 1999; Минеев, 2004] за счет нарушения взаимосвязанности трофических цепей переработки питательных субстратов отдельными организмами агроэкосистемы. Как следствие, может происходить потеря гумуса почвы. О направленности процессов трансформации органических веществ можно косвенно судить по соотношению С : N и С : Р. Показано, что минерализация Сорг является движущим фактором для минерализации Рорг [Tiessen et al., 1992]. Соотношение С : N в зоне корней определяет наиболее важный механизм ризосферного эффекта [Cheng, Kuzyakov, 2005]. Недостаток азота может стимулировать микробное разложение автохтонного почвенного органического вещества, в том числе гумуса [Sparling, 1982]. Следовательно, необходимо иметь данные не только об общей численности микроорганизмов, но и о структуре микробного сообщества почв. Микробоценоз почв представлен разнообразными видами бактерий и грибов. При изучении отдельных групп микроорганизмов, трудно поддающихся культивированию или тех, которые невозможно выращивать in vitro без облигатного симбионта, как в случае с арбускулярными микоризными грибами, представляется актуальным использование молекулярных методов [Graham, 1995], одним из которых является газовая хроматография — масс-спектрометрия (ГХ - МС).
Целью работы являлось определение особенностей изменения микробоценоза в почве в зависимости от интенсивности применяемых агрохимических средств и нахождение взаимосвязи микробного сообщества с продуктивностью агроценоза.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: 1. Оценить взаимосвязь изменения агрохимических характеристик и фаз развития сельскохозяйственных культур в севообороте на серой лесной
почве с микробиологическими показателями (общей численностью, составом, структурой микробного сообщества и биоразнообразием по данным метода ГХ-МС);
Определить влияние органических и минеральных удобрений и климатических факторов на микробное сообщество почвы;
Выделить доминантные ассоциации микроорганизмов и определить возможные микробиологические показатели состояния почв агроценоза;
Исследовать влияние уровня интенсивности применения удобрений на продуктивность культур и качество зерна, а также рассмотреть взаимосвязь данных параметров с микробиологической составляющей агроценоза;
Определить потенциальную скорость выделения диоксида углерода и метана, а также эмиссию этих газов из почвы в разные вегетационные периоды.
Научная новизна. Впервые исследована продуктивность агроценоза в связи со структурой микробного сообщества, изученного методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС). Впервые проведена оценка численности арбускулярных микоризных (AM) грибов методом ГХ-МС в серой лесной почве агроценоза и определено значение этой группы микромицетов в биоразнообразии почв.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для создания оптимальных почвенных условий в отношении сохранения автохтонного органического вещества (гумуса) и микробного разнообразия при применении высоких доз минеральных удобрений.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы были доложены на следующих международных, всероссийских региональных конференциях:
Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002" (Москва, 2002);
Международная конференция 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003);
Региональная научно-практическая конференция «Современные проблемы биологии, экологии, химии», (Ярославль, 2003);
Всероссийская научно-практическая конференция «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003);
1st EGU General Assembly (France, 2004);
13 RAMIRAN international Conference «Potencial for simple technology solutions in organic manure management» (Bulgaria, 2008).
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Рутковская P.M., Кубарев Е.Б. Влияние органоминеральных удобрений на
численность гетеротрофных метанобразующих бактерий и эмиссию ССЬ и
СН4 // Тезисы докладов 12 международной конференции студентов и
аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002", 10 апреля 2002
г.-М.:МГУ, 2002.-С. 93.
Рутковская О.М., Кубарев Е.Б. Кузьмина Н.В. Структура микробного сообщества серой лесной почвы при применении различных систем удобрений // Современные проблемы биологии, экологии, химии: Региональный сборник научных трудов молодых ученых. - Ярославль: Ярославский гос. ун-т., 2003. - С. 77-80.
Рутковская P.M., Кубарев Е.Б. Зависимость между численностью метанокисляющих бактерий и биохимическими показателями дерново-подзолистой супесчаной почвы в агроценозе // Сборник тезисов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2003. - С. 291-292.
4. Рутковская P.M., Верховцева Н.В., Кузьмина Н.В. Влияние злаковых
растений на структуру микробного сообщества серой лесной почвы в
агроценозе // Физиология растений и экология на рубеже веков: Материалы
Всероссийской научно-практической конференции. — Ярославль: Яросл. гос
ун-т., 2003.-С. 171-172.
Селиверстова P.M., Верховцева Н.В., Степанов А.Л, Кузьмина Н.В., Кубарев Е.Б. Влияние различных систем удобрений на серой лесной почве на эмиссию СОг и СНд и структуру микробного сообщества. // Агрохимия в высших учебных заведениях России. Материалы Всероссийской конференции, посвященной 140-летию кафедры агрохимии в МГУ / Под редакцией академика РАСХН Минеева В.Г. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - С. 229-234.
Kubarev Е., Rutkovskaia О., Verkhovtseva N., Stepanov A., Kuzmina N. Metanogenesis and microbial community structure of grey forest soil under manure and nitrogen fertilizers application [Electronic resource]: European Geosciences Union II Geophysical Research Abstracts, ISSN: 1029-7006. - 2004. -Vol. 6, 07437.
7. Seliverstova P., Verkhovtseva N., Stepanov A., Korchagin A. Influence of
plant developmental stages on composition and activities of rhizosphere microbial
community at application of different fertilizer systems on grey forest soil II
WPRKSHPP: Practical Solutions IV, 2007. .
cz/register.php. 2007.
8. Seliverstova P., Verkhovtseva N., Korchagin A., Kirushin E. Comparative
investigation of a microbial biodiversity in agroecosystem on grey forest soil at
application of manure and mineral fertilizers II 13th RAMIRAN international
Conference: Potential for simple technology solutions in organic manure
management- Albena, Bulgaria.: AmbroziaNTLtd., 2008.-P. 285-288.
9. Пашкевич Е.Б., Верховцева H.B, Степанов А.Л, Егорова Е.В.,
Селиверстова P.M., Лукин СМ. Влияние минеральных и органических
удобрений на изменение микробного сообщества дерново-подзолистой
почвы с разным содержанием гумуса // Экологическая агрохимия.
Материалы результатов исследований, выполненных сотрудниками и
докторантами кафедры агрохимии факультета почвоведения МГУ им. М.В.
Ломоносова / Под ред. академика РАСХН Минеева В.Г. - М.: Изд-во МГУ,
2008.-С. 152-163.
10. Селиверстова P.M.. Верховцева Н.В., Степанов А.Л, Корчагин А.А.
Изменение микробного сообщества серой лесной почвы под посевом
злаковых культур при применении органических и минеральных удобрений //
Агрохимия. - 2008. - № 8. - С. 46-54.
11. Селиверстова О.М., Верховцева Н.В., Корчагин А.А. Анализ
микробоценоза почвы при внесении удобрений в севообороте методом
газовой хроматографии // Плодородие. - 2008. - №5. - С. 37-39.
Ризодепозиты. Регуляция компонентов экссудации
Корневые выделения углеродсодержащих соединений растениями в процессе их жизнедеятельности (ризодепозиты) создают особую ризосферную зону, где быстро размножаются микроорганизмы, которые также поставляют в окружающую почву свои продукты метаболизма. Кроме того, в ризосфере происходят процессы поглощения питательных веществ как растениями, так и микроорганизмами. Показано, что корни растений могут непосредственно регулировать ризосферныи поток углерода, как за счёт собственных экссудативных процессов, так и посредством потребления из почвы органических выделений, в том числе поставляемых микроорганизмами.
Выделение углеродсодержащих компонентов корнями растений -феноменальное явление [Curl & Trueglov, 1986]. Известно, что содержание ризодепозитов может широко варьировать как на внутривидовом уровне, так и между видами растений [Ryan et al., 1995; Van der Krift et al., 2001]. Потеря углерода из эпидермальных и кортикальных клеток корня приводит к быстрому размножению микроорганизмов внутри (эндоризосфера), на поверхности (ризоплана) и с наружной стороны корня (экторизосфера) [Lynch & Whipps, 1990]. В результате выделения углеродсодержащих компонентов, ризосфера имеет отличные от основной массы почвы химические, физические и биологические характеристики [Barber, 1995]. Величина изменений свойств почвы, в основном, определяется количеством и типом органического соединения, выделенного корневой системой, и характеристиками самой почвы [Kuzyakov & Domanski, 2000; Tinker & Nye, 2000]. Принято считать, что среди экссудатов доминируют низкомолекулярные вещества, такие как сахара, аминокислоты и органические кислоты, которые присутствуют в цитоплазме растительных клеток в высоких концентрациях [Farrar et al., 2003]. При этом аминокислоты и органические кислоты используются микробным сообществом, главным образом, для роста, тогда как сахара используются преимущественно для дыхания и, следовательно, могут не индуцировать размножение микроорганизмов в ризосфере [Jones et al, 2003].
Выделение углеродных компонентов в ризосфере может привести к нежелательным явлениям. Например, в результате быстрого размножения микроорганизмов, в том числе, возможно, и фитопатогенов, в ответ на доступный источник углерода могут создаться условия для конкуренции за питательные вещества, а также увеличиться вероятность заболевания растений [Liu et al., 1997; Nguyen, 2003]. Исключение составляют случаи, когда выделение экссудатов является ответом на стресс и приносит прямую позитивную пользу растениям [Wu et al., 1999; Pineros et al., 2002]. Есть основания считать, что корни способны применять ряд стратегий, направленных на минимизацию негативных эффектов потери углеродсодержащих соединений. Недавно было выдвинуто предположение, что поверхностные клетки могут действовать как временная ловушка, вытягивающая патогенные микроорганизмы из внутренних структур корня [Gunawardena & Hawes, 2002; Rodger et al., 2003]. Альтернативно, корни способны выделять антимикробные компоненты, хотя мало оснований полагать, что этот механизм является универсальным [Schenk et al., 1991].
В вегетирующих злаковых культурах и травах фиксированный в процессе фотосинтеза углерод очень быстро транспортируется в почву и может быть обнаружен во внешней среде менее чем через час после его фиксации [Minchin et al., 1994; Rattrey et al., 1995; Nguyen et al., 1999, Kuzyakov & Cheng, 2001; Dilkes et al., 2004].
Регуляция компонентов экссудации осуществляется в течение более длительного времени в ответ на физиологические изменения, происходящие в растении. Например, в большинстве случаев требуется несколько дней, чтобы индуцировать повышенную экссудацию как отклик на дефицит минеральных элементов, в частности, выделение фитосидерофоров при дефиците железа [Ma et al., 2003]. Кроме того, ростовые сигналы могут быть вовлечены не только в пусковой механизм экссудации, но и в образование структурных элементов корня, участвующих в экссудации [Gilbert et al., 2000; Li et al., 2000; Shen et al,, 2003]. Растения также могут косвенно регулировать экссудацию через интенсивность поступления сахарозы к корням, так как концентрация свободных Сахаров является компонентом сигнального трансдукционного пути метаболизма, вовлеченного в корневую структуру и в потребление питательных элементов [Bingham et al., 1998; Freixes et al., 2002; Lejay et al., 2003].
Полагают, что микробная трансформация корневых экссудатов в почве происходит очень быстро [Nguyen et al., 1999; Kuzyakov & Cheng, 2001]. В исследованиях с добавлением растворимых углеродсодержащих компонентов показано, что их быстрая минерализация с периодом полураспада между 0,5 и 2 часами имеет место для большинства Сахаров, аминокислот и органических кислот [Ryan et al., 2001]. Некоторая часть углерода ризодепозитов включается в микробную биомассу, оборот которой происходит значительно медленнее (30-90 дней).
В целом, даже незначительные изменения в химическом составе почвы или в физиологии растений будут индуцировать немедленные сдвиги в качестве и количестве потока экссудатов [Jones et al., 2003], что, в свою очередь, найдет отражение в микробном сообществе почв. Необходимо комплексное изучение ризосферы, с привлечением ключевых научных идей, таких как развитие саморегулируемых агроэкосистем в ответ на климатические изменения и приемы интенсивного сельскохозяйственного использования.
Метеорологические условия в период проведения исследований
Агрохимические параметры почвы изучали согласно общепринятым методикам [Практикум по агрохимии, 2001]. В почве определяли валовое содержание азота, фосфора и калия после мокрого озоления серной кислотой; азот - по Кьельдалю с отгоном аммиака в борную кислоту, фосфор - колориметрически с окраской по Дениже; калий — атомно-абсорбционным методом на HITACHI 18080; доступные для растений формы фосфора -методом Кирсанова, содержание аммонийного азота - в вытяжке 0,05 н. NaCI колориметрически с использованием реактива Несслера; содержание органического углерода - на экспресс - анализаторе углерода АН-7529. Продуктивность зерновых культур и картофеля (в кормовых единицах) рассчитывали, исходя из справочных данных [Справочник по зерновым культурам, 1986; Справочник по кормопроизводству, 1973].
Определение численности различных групп бактерий, грибов и арбускулярных микоризных грибов (AM грибов) проводили молекулярным методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии [Осипов, 1997]. Метод ГХ-МС позволяет после кислого метанолиза пробы выделять жирные кислоты, оксикислоты и альдегиды из сложных липидов клеточных мембран, в которых они связаны сложноэфирными и амидными связями. Липиды -обязательные компоненты мембран, окружающих цитоплазму каждой микробной клетки. Липидный состав различных микроорганизмов в значительной степени отличается друг от друга. Каждый микроорганизм имеет свой особенный липидный профиль, и это свойство было положено в основу их химической идентификации [Нетрусов и др., 2004]. По специфическим биомаркерам жирных кислот, оксикислот и альдегидов данный метод позволяет определять биомассу микроорганизмов в почвенной пробе, а после соответствующего пересчета - их численность (табл. П. 1). При использовании базы данных по специфическим маркерам определяют родовой или, при наличии специфического маркера, даже видовой состав сообщества [Осипов и др., 1994; Осипов, 1997].
Методика подготовки проб для ГХ-МС Средние образцы почвы (50-100 г) или органических удобрений (навоза, торфа, вермикомпоста, осадка сточных вод и т.д.), отобранные в соответствии с правилами отбора средних проб для агрохимических анализов [[Практикум по агрохимии, 2001], высушивают до воздушно-сухого состояния и в таком состоянии хранят до проведения анализа. В зависимости от содержания в пробе органического вещества (Сорг) навеска для исследования методом ГХ-МС составляет 0,1-0,8 г. Из навесок экстрагируют липидные компоненты методом кислого метанол иза (КМ) в 0,4 мл ЇМ НС1 в метаноле в течение одного часа при 80С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот (ЖК) и альдегидов из сложных липидов. В результате получают ЖК в виде метиловых эфиров (МЭЖК) и альдегиды в виде диметилацеталей (ДМА). Далее эти компоненты экстрагируют, применяя 400 мкл гексана. Полученный экстракт высушивают при 80 С и сухой остаток обрабатывают 20-ю мкл М,Обис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80С для получения триметилсилильных эфиров гидроксикислот, спиртов и стеринов. Далее полученную реакционную смесь разбавляют гексаном до 100 мкл и вводят для анализа в инжектор хромато-масс-спектрометра. Для количественных измерений в качестве внутреннего стандарта используют тридейтеро-тридеканоат.
По масс-спектрам или времени и индексам удерживания идентифицировали компоненты пробы - жирные кислоты, альдегиды, оксикислоты и пр. Количественное содержание компонентов определяли с помощью интегратора по площадям хроматографических пиков с использованием внутреннего стандарта.
Полученный состав представляли в цифровом виде и вводили в компьютер для расчета. В основе алгоритма расчета положены закономерность и повторяемость химического состава определенного вида микроорганизмов и аддитивность профилей отдельных микроорганизмов в их суммарной биомассе [Осипов, Назина, Иванова, 1994; Кузьмина, 2005]. Статистическую обработку аналитических данных проводили, используя компьютерную статистическую программу Microsoft Excel 2003. Кластерный анализ проводили с использованием пакета программ "Statistica -5".
В почве определяли потенциальную активность дыхания и потенциальную скорость выделения метана. Определение эмиссии диоксида углерода и метана из почвы в атмосферу проводили камерно-эмиссионным методом: С02 - на газовом хроматографе "Модель 3700" с детектором по теплопроводности и СН4 - на газовом хроматографе Chrom - 41 с пламенно-ионизационным детектором, в соответствии с методикой [Степанов, Лысак, 2002].
Величина рН в первый год исследований в варианте с контрольным и поддерживающим уровнем применения удобрений (табл. 4) была ниже данного показателя в исходной почве и составляла 6,8. Однако внесение навоза на обоих вариантах в 2002 г. и полного минерального удобрения в 2003 г. в варианте с поддерживающим уровнем использования удобрений повысило рН до первоначального значения (табл. 4). Применение в севооборотах интенсивного и высокоинтенсивного уровней внесения удобрений не изменило величину рН за ротацию. По содержанию подвижных форм фосфора почва в годы исследований также сравнима с данным показателем при закладке опыта, который равнялся 9,8 мг/100 г почвы.
Урожайность и качество возделывания культур
Озимая пшеница возделывалась шестой культурой первого (зернотравяного) севооборота после черного пара на двух уровнях внесения удобрений — контрольном (органические удобрения в виде навоза в дозе 40т/га использовались в последний год ротации) и поддерживающем. В последнем варианте применяли органические и минеральные удобрения, в год исследования вносили навоз 40 т/га + N40 (табл. 2).
Погодные условия имели существенное влияние на урожайность озимых культур и эффективность азотной подкормки. Как известно, весенняя азотная подкормка - высокоэффективный прием в системе удобрения озимой пшеницы, что объясняется ослабленностью культуры после перезимовки. Кроме того, из-за повышенной влажности и низкой температуры почвы ранней весной и, как следствие, невысокой скорости процессов аммонификации и нитрификации, накопление минеральных форм азота происходит медленно [Лебедева, Едемская, 2005]. В нашем исследовании в условиях второй закладки опыта этот показатель был в 4,5 раза ниже, чем на первой закладке. По-видимому, это объясняется засухой в августе и сентябре 2002 г. и, как следствие, недостаточным накоплением в почве влаги. Так, количество выпавших за август месяц 2002 г. осадков было 10,4 мм, ГТК равнялся 0,85. В этих условиях от весенней азотной подкормки получена лишь незначительная прибавка урожая в 2003 г. Низкая эффективность от внесения азотных удобрений в засушливые и сухие годы отмечается и в литературе [Лебедева, Едемская, 2005].
Вегетационный период 2001 года также был засушливым. Однако в августе и сентябре в 2001 году выпало больше осадков, чем в этот период в 2002 году. В результате от внесения азота на фоне навоза прибавка зерна составила 16,4 ц/га (табл. П. 3). Изучение влияния уровней внесения удобрений на качество зерна озимой пшеницы не выявило зависимости содержания в нем общего фосфора, калия и нитратов от данного фактора (табл. П. 3). Содержание же общего азота в зерне при внесении аммиачной селитры увеличилось, что способствовало накоплению белка - на поддерживающем уровне внесения удобрений этот показатель увеличился на 2,91%, сбор белка - на 3,2 ц/га. По содержанию сырого белка в зерне озимой пшеницы в варианте, где была произведена весенняя азотная подкормка, данная культура может считаться сильной пшеницей [Лебедева, Едемская, 2005].
Таким образом, озимая пшеница, возделываемая по черному пару, отзывчива на азотную подкормку - в целом по опыту на этом варианте был получен самый высокий сбор белка наряду с хорошими показателями белковости и урожайности (рис. 3; табл. П. 3). Однако надо учитывать количество осадков, выпавших в осенний период, чтобы азотная подкормка оказалась эффективной. По-видимому, в сохранении достаточного количества влаги в почве сыграл и хороший предшественник - черный пар. Кроме того, как известно, после черного пара в почве накапливается большое количество минеральных форм азота в результате процессов аммонификации и нитрификации.
Озимая рожь возделывалась после занятого пара шестой культурой второго (зернотравяного) севооборота. Изучалось влияние на урожай и качество зерна двух уровней внесения удобрений - поддерживающий и интенсивный (табл. 2). Последний вариант отличался двукратным увеличением внесения азотной подкормки.
Урожайность озимой ржи определялась, главным образом, погодными условиями: засуха в августе и сентябре 2002 года явилась предпосылкой для ее снижения в следующий вегетационный период. Так, на первой закладке опыта урожайность зерна в среднем была в 2 раза выше, чем на второй закладке, однако эффективность азотной подкормки была низкой в оба года исследований. Известно, что урожай озимых хлебов и эффективность удобрений существенно зависят от количества осадков, выпавших в сентябре, при этом наиболее высокая урожайность наблюдается при количестве осадков свыше 60 мм [Лебедева, Едемская, 2005]. Тем не менее, как было отмечено выше, для озимой пшеницы, возделываемой в тех же климатических условиях, азотная подкормка в первую закладку опыта являлась эффективной. По-видимому, это связано с лучшим проникновением корневой системы данной культуры в почву и наличием хорошо разветвленных боковых корней (рис. П. 2). Известно, что более высокое отношение корень : стебель определяет большую экологическую устойчивость растения [Физиология и биохимия ..., 2000]. На второй закладке опыта азотная подкормка была более эффективной при внесении ее под озимую рожь, чем под озимую пшеницу. Это можно объяснить способностью ржи лучше многих других культур использовать фосфор из фосфоритов, калий из почвы и удобрений [Лебедева, Едемская, 2005]. Кроме того, озимая рожь имеет, подобно озимой пшенице, хорошо развитую корневую систему.
Качественный состав зерна озимой ржи зависел от уровня внесения удобрений. На интенсивном уровне наблюдалась тенденция увеличения в зерне общего азота, фосфора и калия, что согласуется с агрохимическими данными по общему содержанию и количеству подвижных форм этих элементов в почве (табл. 4). Внесение дополнительного азота на интенсивном уровне применения удобрений способствовало увеличению содержания в зерне белка. Сбор белка повысился на 0,2 ц/га.
Яровая пшеница возделывалась шестой культурой в четвертом (зернотравянопропашном) и пятом (плодосменном) севооборотах после картофеля и зернобобовых на двух уровнях внесения удобрений -интенсивном и высокоинтенсивном. Последний вариант (предшественник -картофель) отличается от предыдущего 36%-ным увеличением дозы внесенных азотных удобрений, 25%-ным - фосфорных и 17%-ным -калийных (N:P:K = 1:0,6:1). После зернобобовых высокоинтенсивный вариант отличается повышением припосевного внесения азота на 70% и снижением на 30% применения калийных удобрений. По фосфорным удобрениям варианты не отличались. Соответственно, соотношение N:P:K в высокоинтенсивном варианте составило 2:1:1.
Результаты исследований показали, что урожайность яровой пшеницы определялась, главным образом, температурным и влажностным режимом почвы. В условиях избыточно влажного вегетационного периода 2003 года (ГТК=1,97 при ГТК ср. многолетнем 1,26) был в среднем получен меньший урожай культуры, чем в сухом 2002 году. По-видимому, это связано с потерями нитратного азота, который был лимитирующим фактором для развития культуры (вымывание N03" и усиление процесса денитрификации в условиях повышенного увлажнения). Увеличение дозы азота в варианте с высокоинтенсивным уровнем внесения удобрений скомпенсировало эти потери, что отразилось на повышении урожайности, которая стала сопоставима с урожайностью на первой закладке опыта на аналогичном варианте. Возрастание дозы вносимых удобрений на первой закладке опыта приводило к снижению урожайности (вариант с высокоинтенсивным уровнем применения удобрений, предшественник - картофель). Известно, что использование избыточного количества азотных и калийных удобрений ведет к увеличению концентрации почвенного раствора в зоне молодых проростков, которая, особенно в сухие годы, угнетает их рост за счет уменьшения поступления в растения воды и питательных элементов [Лебедева, Едемская, 2005] в связи со снижением корневого давления.
Белковость (%) и сбор белка (ц/га) яровой пшеницы зависели от предшествующей культуры (табл. П. 3). Так, содержание белка в зерне яровой пшеницы, возделываемой после картофеля, по интенсивному фону было на 2,11% выше, чем после зернобобового предшественника. Разница по сбору белка яровой пшеницы, выращенной после разных предшественников при интенсивном уровне внесения удобрений, была достоверной и составляла 1,44 ц/га (рис. 3). При выращивании культуры на почве с высокоинтенсивным применением удобрений, эти показатели отличались не столь существенно. По содержанию белка в зерне яровая пшеница, возделываемая после картофеля на обоих уровнях внесения удобрений, а также после зернобобовых при высокоинтенсивном уровне применения удобрений, относится к сильной пшенице [Лебедева, Едемская, 2005].
Грибы, AM грибы
Известно, что микоризация корней растений приводит к увеличению продуктивности культур: в них повышается содержание хлорофилла, растворимых Сахаров и протеинов. AM грибные экстрарадиальные гифы, увеличивая адсорбирующую поверхность корня, создают более эффективные условия для потребления питательных элементов. Тем не менее, эти процессы недостаточно изучены и могут зависеть от фазы роста и вида выращиваемой культуры, доступности питательных веществ и др. [Hodge, 2000; Green et al., 1999].
Анализ методом ГХ-МС грибных маркеров AM (16:1ш5) и немикоризных грибных маркеров показал, что их биомасса зависела от температуры и влажности почвы (рис. 8, 9). Так, сухой летний период 2002 года (количество осадков, выпавших за август месяц, было ниже средней многолетней нормы) привел к снижению биомассы грибов к концу вегетации растений. Благоприятный влажностный режим 2003 г. (количество осадков, выпавших за вегетационный период, превышало среднюю многолетнюю норму) способствовал росту AM грибов в почве. Отмечено, что индекс Шеннона положительно коррелировал с содержанием в почве AM грибов, что свидетельствует о стимулирующем влиянии последних на биоразнообразие микроорганизмов серой лесной почвы.
Определение потенциальной скорости выделения С02 показало, что данная составляющая биологической активности почвы зависела как от климатических факторов (изменения по сезонам), так и от уровня интенсивности применения удобрений в разных севооборотах (табл. 10, 11). Максимальная скорость выделения из почвы ССЬ была отмечена в июне месяце в оба года исследований. В условиях 2003 г. рост общего числа микроорганизмов сопровождался увеличением интенсивности выделения СОг в контроле (первый год последействия навоза) и в варианте с высокоинтенсивным уровнем внесения удобрений (N140P50K190).
Данный показатель, как известно, отражает степень подверженности органического вещества почвы микробному разложению. Напомним, что в содержании Сорг. на протяжении двух лет исследований наблюдались колебания (табл. 4, 5). Так, в 2003 г. в варианте с применением минеральных удобрений в дозе N140P50K190 количество органического углерода снизилось, что, по-видимому, можно объяснить интенсивно протекающими в почве процессами минерализации. Как мы отмечали выше, в почве этого образца возросла численность микроорганизмов, способных к разрушению автохтонного органического вещества почв. Таблица 10. Потенциальная скорость выделения СОг и СН4в почве, 2002 г.
Определение потенциальной скорости выделения CKj показало увеличение этого показателя в условиях 2003 г. по сравнению с 2002 г. (табл. 10, 11). Согласно метеорологическим данным, количество осадков, выпавших на протяжении вегетационного периода 2003 г. было выше средней многолетней нормы (табл. 3; рис. 8, 9). Как мы отмечали выше, повышенная влажность почвы способствовала созданию благоприятных условий для развития анаэробиоза: в сообществе микроорганизмов увеличилась численность анаэробных микроорганизмов, способных к метаногенезу, чем, по-видимому, и объяснялось увеличение потенциальной скорости выделения СЩ.
Анализ результатов по эмиссии диоксида углерода и метана из серой лесной почвы показал тенденцию увеличения скорости выделения С02 на протяжении вегетационного периода (рис. 10). Общая биологическая активность микробного сообщества серой лесной почвы к концу вегетации рассматриваемых злаковых культур определялась увеличением численности активных гидролитиков актиномицетов, что связано с накоплением труднодеградируемыхризодепозитов.
Эта группа микроорганизмов обеспечивала поступление исходных субстратов, которые сбраживались анаэробными бактериями, также повышающими "дыхательную" активность почв. Максимальный пик эмиссии метана был зафиксирован в июне, когда температурный и влажностный режимы почвы были наиболее благоприятны для развития метаногенеза как строго анаэробного процесса за счет повышения увлажнения и снижения окислительно-восстановительного потенциала. Корреляция эмиссии С02 и С№ с количеством выпавших осадков составляла г = — 0,7 и г = 0,67, соответственно.
Как было отмечено выше, наиболее продуктивной культурой в 2002 году была озимая пшеница, возделываемая по черному пару (рис. 11). В данном варианте в сообществе микроорганизмов отмечено самое большое содержание актиномицетов - 71% от общей бактериальной численности. Среди этой группы доминировали Nocardia asteroides и Nocardia cornea, численность которых превышала таковую в других вариантах в осенний период (рис. 5). В этом же варианте отмечено самое высокое содержание ферментирующих бактерий. Как известно, актиномицеты и бациллы обладают способностью разрушать широкий спектр растительных полимеров - целлюлозу, крахмал, пектин, хитин, лигнин [McCarthy, 1987; McCarthy, Williams, 1992; Звягинцев, Зенова, 2001; Добровольская, 2002]. По-видимому, внесение навоза, имеющего в своем составе растительный материал, оказало стимулирующее влияние на данные группы микроорганизмов. Следует отметить, что в 2002 году в нулевом варианте удобрения вносили первый раз за всю ротацию. Высокая продуктивность озимой пшеницы способствовала увеличению общей численности микроорганизмов к концу вегетации растений в 3 раза, по-видимому, за счет дополнительного поступления в почву веществ ризодепозитного происхождения и сбалансированных трофических взаимоотношений между растениями и микробоценозом почв.
В первый год новой ротации (2003 г.) наибольшей продуктивностью отличался овес, возделываемый после озимой ржи (интенсивный уровень внесения удобрений). В данном варианте в осенний период наблюдали самую высокую численность коринеформных микроорганизмов - 39% от общего числа бактерий, за счет высокого содержания Arthrobacter globiformis, Butyrivibrio spp., являющихся субдоминантами в сообществе, а также Corynebacterium sp. Эти виды, как известно, являются активными гидролитиками, способными стимулировать рост растений, в том числе за счет продуцирования ростовых веществ {Arthrobacter globiformis).