Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Роль фотосинтеза в продукционном процессе растений 8
1.2. Образование первичных продуктов фотосинтеза 12
1.3. Транспорт ассимилятов в растении 18
1.3.1 .Транспорт ассимилятов внутри ассимилирующей клетки 20
1.3.2. Роль внеклеточного пространства в регуляции физиологических процессов 28
1.3.2.1. рН внеклеточного пространства 28
1.3.2.2. Ферментативная активность апопластной жидкости 33
1.3.2.3. Участие апопластного пространства в регуляции транспорта ассимилятов из листьев 43
1.3.2.4. Участие апопласта в торможение транспорта ассимилятов при усиленном азотном питании растений 51
1.4. Миграция азота в системе почва - растение - почва 54
1.4.1. Роль почвенного азота в продукционном процессе растений 54
1.4.2. Влияние азотного питания на соотношение надземная масса/корни растений 60
1.4.3. Оптимальный порог эффективности применения минеральных удобрений 60
Глава 2. Объекты и методы исследования 63
2.1. Объекты исследования 63
2.1.1. Проведение опытов с меченым углеродом на льне-долгунце 70
2.1.2. Введение раствора аммиакатов в апопласт побега льна-долгунца на фотосинтетическую ассимиляцию 14СОг 72
2.1.3. Опрыскивание растений раствором аммиакатов при введении меченой глюкозы в побег льна-долгунца 74
2.2. Методы исследования 74
2.2.1. Хроматографическое изучение распределения 14С среди низкомолекулярных продуктов фотосинтеза 74
2.2.2. Изучение распределения 14С среди фракций меченых веществ разделяемых по растворимости 75
Глава 3. Результаты и их обсуждение 77
3.1. Влияние введения раствора аммиакатов в апопласт побега льна-долгунца на фотосинтетическую ассимиляцию ,4СОг листьями 77
3.2. Влияние опрыскивания аммиакатами растений льна-долгунца на метаболизацию 14С экзогенной глюкозы, вводимый в побег через транспирационцый ток воды 83
3.3. Влияние удаления части поіребителей ассимилятов (точек роста и бутонов) на активность функционирования корневой системы 88
3.4. Влияние аммиакатов на продуктивность сельскохозяйственных растений 93
3.4.1. Влияние аммиакатов на продуктивность сахарной свеклы 93
3.4.2. Влияние опрыскивания СтО на урожайность картофеля 104
3.4.3. Влияние стимулятора оттока на урожайность и качество ячменя 107
3.4.4. Влияние стимулятора оттока на урожайность томатов закрытого грунта 111
3.5. Влияние обработки аммиакатами на взаимодействие растения с почвой 114
Заключение 118
Выводы 120
Предложения производству 121
Список литературы
- Образование первичных продуктов фотосинтеза
- Ферментативная активность апопластной жидкости
- Введение раствора аммиакатов в апопласт побега льна-долгунца на фотосинтетическую ассимиляцию 14СОг
- Влияние опрыскивания аммиакатами растений льна-долгунца на метаболизацию 14С экзогенной глюкозы, вводимый в побег через транспирационцый ток воды
Введение к работе
Актуальность темы. Многочисленными исследованиями физиологических процессов растений, выращенных при внесении азотных удобрений, показано, что повышение уровня азотного питания усиливает неуглеводную направленность фотосинтеза (Карпилов, Недопекина, 1965; Андреева, Авдеева, 1982; Чиков, 1987) и тормозит транспорт ассимилятов из листьев (Тарчевский и др., 1973) При изучении влияния различных форм азотных удобрений на фотосинтез и фотосинтетический метаболизм установлено, что негативные изменения в основном связаны с действием нитратного азота (Чиков и др, 1998; Chikov, Bakirova, 1999). При рассмотрении механизмов дальнею ірансноріа ассимиляюв Л Л Курсановым (1984) предложена гипотеза, в которой предусматривается наличие внеклеточного этапа транспорта сахарозы от мезофилльных клеток до флоэмных окончаний листа.
Позднее прямыми кинетическими опытами с 14С было подтверждено (Чиков, 1987; Chikov et al., 2001) движение меченых ассимилятов через апопласт листа, как через промежуточное пространство. Исследование распределения 14С среди продуктов фотосинтеза в мезофилльных клетках и апопласте выявило, что в условиях повышенного нитратного питания усиливается гидролиз сахарозы в межклетниках листа (Chikov et al., 2001). На основании этого было дано новое толкование причины торможения оттока ассимилятов из листа в условиях усиленного азотного питания. Согласно этой концепции уменьшение экспортной функции листа связано с гидролизом уже синтезированной сахарозы в апопласіе, так как продукіьі гидролиза (глюкоза и фруктоза) уже не могут "загружаться" во флоэмные окончания и вынуждены возвращаться в клетки мезофилла, где активируют ростовые процессы листа.
Поскольку апопластная инвертаза (фермент, гидролизующий сахарозу)
активна в кислой среде (Курсанов, 1976), то на процесс транспорта ассимилятов через апопласт и фотосинтез можно повлиять, изменив рН апопласта путем вытеснения ионов водорода из внеклеточной жидкости с помощью адсорбирования других положительно заряженных ионов на клеточных стенках мезофилла. Роль таких ионов могут играть тяжелые металлы, которые, адсорбируясь на фибриллах целлюлозы клеточных стенок (Blinda et al., 1997), своим положительным зарядом "выталкивают" из жидкости апопласта ионы водорода, тем самым подщелачивая водную среду. "Агентами", несущими ионы металла, могут быть аммиакаты - комплексные соединения некоторых металлов с аммиаком (Чиков, 2002), общая формула которых [Металл»(Шз)л]+т*(Анион)'т).
Целью насюящеи рабоїьі являемся выяснение иошожпоеіи управления фотосинтезом и продукционным процессом растения путем воздействия на апопласт листа каталитическими количествами аммиакатов.
Задачи исследования:
Изучить изменение интенсивности фотосинтеза и распределение |4С среди меченых продуктов фотосинтеза листьев льна-долгунца, в побег которого вводится раствор аммиакатов цинка и меди;
Оценить влияние обработки растений аммиакатами на метаболизацию экзогенной 14С-глюкозы в листьях льна-долгунца;
Выяснить продолжительность влияния изменения фонда ассимилятов в растении на активность корневой системы и содержание меченых продуктов фотосинтеза в пасоке растений фасоли;
4. Изучить влияние опрыскивания посевов аммиакатами на
продуктивность различных сельскохозяйственных растений (сахарной
свеклы, ячменя, картофеля и томатов).
Научная новизна. Впервые установлено, что с помощью аммиакатов можно препятствовать чрезмерному гидролизу транспортного продукта фотосинтеза - сахарозы, повышать экспортную функцию листьев и
хозяйственную продуктивность растений.
Выявлено, что "опрыскивание аммиакатами, повышая экспортную функцию листьев, усиливают приток Сахаров в корни. В результате снижается конкуренция за получение ассимилятов между надземными органами и корнями, возникающая в репродуктивный период у злаковых, что повышает снабжение ассимилятами и, как следствие, поглотительную способность корней, а они, в свою очередь, лучше снабжают надземную часть растения дополнительным азотом.
На различных сельскохозяйственных растениях (сахарной свекле, ячмене, картофеле, томатах) показана возможность форсирования продукционного процесса растений путем опрыскивания листьев смесью аммиакатов.
Практическая значимость работы. Установлено, что опрыскивание аммиакатами является неспецифическим воздействием, стимулирующим отток веществ к потребляющим органам и повышающим урожай растений апопластного типа. Препарат на основе аммиакатов прошел испытания в различных хозяйствах Республики Татарстан (АКХ им. Кирова Буинского района, Апастовский и Заинский госсортоучастки, ООО Агрокомбинат "Майский").
Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на Международной конференции "Проблемы физиологии растений Севера" (Петрозаводск, 2004), V Всероссийском съезде ОФР России (Пенза, 2003), Всероссийской научной конференции "Пути мобилизации биологических рессурсов повышения продуктивности пашни, энергоресурсосбережения и производства конкурентоспособной продукции" (Казань, 2005), итоговых научных конференциях КИББ КНЦ РАН (Казань, 2004, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135
страницах, состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы
(140 наименований, в том числе 70 иностранных авторов), содержит 19 таблиц и 9 рисунков.
Положения, выносимые на защиту:
Раствор аммиакатов цинка и меди, попадая в апопласт листьев растений в каталитических количествах, стимулирует фотосинтез, способствует усилению его углеводной направленности, повышению доли низкомолекулярных транспортных веществ и соотношения радиоактивности сахарозы/гексозы среди меченых продуктов ассимиляции 14СОг;
Изменение величины фондов ассимилятов в растении влияет на метаболическую активность корневой системы, но эта регуляция действует не дольше одного фотопериода;
Опрыскивание посевов сельскохозяйственных растений (сахарной свеклы, ячменя, картофеля и томатов) повышает их продуктивность, и это может достигаться при одновременном снижении количества азотных удобрений, вносимых в почву перед посевом;
4. Интенсификация оттока ассимилятов из листьев способствует
повышению активности корневой системы, что приводит к дополнительному
накоплению органического азота в почве.
Личный вклад автора. Непосредственно автором выполнена основная работа по получению экспериментального материала, обобщению результатов, формулированию выводов.
Образование первичных продуктов фотосинтеза
В 50 годы XX века была расшифрована последовательность реакции, в ходе которой СОг превращается в углеводы. Исследования проводились большой группой ученых во главе с М. Кальвином и А. Бенсоном (1962). Поэтому этот процесс часто называют циклом Кальвина или циклом Бенсона-Кальвина. Было установлено, что у всех без исключения высших растений, водорослей, у большинства фототрофных и хемолитотрофных бактерий основу фотосинтетического метаболизма углерода составляет цикл Кальвина и фиксация СОг при участии РДФ-карбоксилазы
Известно, что процесс фотосинтеза связан с хлоропластами, в мембранах которых осуществляются световые процессы. Энергия света, поглощенная фотосинтетическими пигментами, с высокой эффективностью передается реакционным центрам фотосистем, где происходит первичное разделение зарядов. Перенос электронов по электротранспортной цепи (ЭТЦ) фотосинтеза приводит к образованию первичных стабильных восстановленных продуктов фотосинтеза - НАДФ и АТФ, которые используются в дальнейших темновых реакциях фотосинтеза для фиксации СОг и образованию углеводов, белков и других продуктов (Венедиктов и др., 1982). С3-путь (цикл Бенсона - Кальвина) фотосинтеза рассматривают как процесс, состоящий из четырех стадий: карбоксилирования, восстановления, регенерации и стадии синтеза углеводных продуктов фотосинтеза (Бассем, Кальвин, 1962). На стадии карбоксилирования происходит фосфорилирование рибулозо-5-фосфата с участием АТФ и соответствующего фермента, затем присоединение СО? к диенолыюй форме рибулозобисфосфата (РуБФ) с образованием 2 триоз - 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК). Ответственена за это фермент рибулозобисфосфаткарбоксилаза - оксигеназа (РУБИСКО). Во второй стадии 3-фосфоглицериновая кислота восстанавливается до 3-фосфоглицеринового альдегида. Этот процесс идет в два этапа. В начале под действием фермента фосфоглицераткиназы к 3-ФГК присоединяется еще одна фосфатная группа от молекулы АТФ и образуется 1,3-бисфосфоглицериновая кислота (1,3-ФГК). Далее 1,3-ФГК восстанавливается в 3-фосфоглицериновый альдегид за счет NADPH. Этот процесс катализируется ферментом триозофосфатдегидрогеназой.
Стадия регенерации РуБФ происходит с участием фосфатов трех-, четырех-, пяти-, шести-, и семиуглеродных Сахаров. В результате процессов альдольной конденсации катализируемые соответствующими альдолазами, и транскетолазных реакций из 5 молекул 3-углеродных Сахаров образуется 3 молекулы 5-углеродных Сахаров, которые превращаются в РуБФ.
На четвертом этапе фосфотриозы выходят из хлоропластов в цитоплазму, где конденсируются в фруктозо-1,6-бисфосфат, из которого, пройдя цепь превращений, образуется глюкоза и сахароза Остальная часть фосфотриоз используется в хлоропластах на синтез крахмала.
Различают первичный крахмал, который синтезируется в хлоропластах, и вторичный, синтезируемый из сахарозы в лейкопластах запасающих вегетативных органов и плодов. Крахмал, накапливающийся в хлоропластах, не транспортируется. Основной транспортной формой углевода у большинства растений является сахароза, которая синтезируется из фруктозы и глюкозы в цитоплазме. Распределение триозофосфатов между процессами синтеза крахмала в хлоропластах и сахарозы в цитоплазме зависит от обеспеченности этих клеточных компартментов неорганическим фосфатом (Рн). Когда концентрация Рн в цитоплазме велика, триозофосфаты из хлоропласіов идуі в циюплашу и обмен мл Ри и сипіешруїоіоі сахара Ьели содержание Рн в цитоплазме падает, триозофосфаты остаются в хлоропласте и синтезируется крахмал (Полевой, 1989; Медведев, 2004).
Путь ассимиляции СОг с образованием Сахаров не является единственным. Образующиеся первичные продукты фотосинтеза и интермедианты цикла Кальвина могут метаболизировать в дальнейшем с образованием не только Сахаров, но и органических кислот, аминокислот.
Фотосинтетическое усвоение углерода осуществляется в сложной системе реакций, включающих альтернативные по отношению к углеводу пути. Важнейшим из таких путей является гликолатный путь. Это происходит при конкурировании С02 и 02 друг с другом в каталитическом центре РУБИСКО. Этот фермент может функционировать как оксигеназа и катализировать окислительное расщепление РуБФ до ФГК и фосфогликолевой кислоты. При насыщающей конценірации СОг оксигеназная реакция подавляется, а фотосинтез за счет снижения сопротивления диффузии С02 в лист и активации реакции карбоксилирования стимулируется. Имеются данные, что повышение концентрации С02 не только не приводит к снижению, но даже вызывает абсолютное возрастание интенсивности образования гликолата и продуктов его метаболизма (Чиков и др., 1998а).
Другим источником образования гликолевой кислоты может быть транскетолазная реакция цикла Кальвина (Гиббс, 1972), для осуществления которой необходим супероксид радикал, образующийся в реакции Миллера (восстановление кислорода в электротранспортной цепи хлоропластов) (Takabe et al., 1980). Необходимо отметить, что в транскетолазной реакции окисляется не РБФ, а его более ранние предшественники, а именно шести-семиуглеродные фосфаты Сахаров.
Гликолат легко выходит из хлоропластов и метится среди самых ранних продуктов фотосинтеза. Образование и метаболизм гликолата связан с таким важным процессом как фоюдыхание Фоюдыхание осущесівляеіся и результате взаимодействия трех органелл - хлоропластов, пероксисом и митохондрий. Из хлоропласта гликолат поступает в пероксисому и там окисляется гликолатоксидазой до глиоксилата. В дальнейшем метаболизме глиоксилат имеет различную судьбу. Он может окисляться перекисью водорода до формиата с выделением С02 (Grodzinski, Butt, 1977). Кроме того, глиоксилат может быть окислен до оксалата с помощью гликолатоксидазы (Richardson, Tollbert, 1961). Однако в большинстве случаев глиоксилат аминируется, превращаясь в глицин, причем в качестве донора аминогруппы функционирует глутамат. Глицин транспортируется в митохондрию. Здесь из двух молекул глицина образуется серии, освобождается С02 и восстанавливается НАД+. Теперь цикл замыкается: серии снова может поступать в пероксисому и там передать свою аминогруппу на пируват. При этом из пирувата возникает аланин, из серина - гидрооксипируват, который сразу после этого восстанавливается в глицерат. Затем глицерат может снова попасть в хлоропласта и благодаря фосфорилированию включиться в цикл Кальвина.
Ферментативная активность апопластной жидкости
Функциональная специализация органов и тканей растений неразрывно связана со спецификой белков, а особенно ферментов. Содержание ферментов на поверхности клеток не остается постоянным, и изменяется в зависимости от условий и, прежде всего от наличия в окружающей среде или на поверхности клеток соответствующих субстратов, причем активность ферментов в апопласте регулируется со стороны цитоплазмы (Smith et al., 1997).
Таким образом, апопласт не является в биохимическом отношении инертной зоной. Напротив, поступающие туда ассимиляты могут взаимодействовать с рядом ферментов, в результате чего некоторая их часть используется во внеклеточном пространстве, другая же подготавливается для транспорта через мембраны, ограничивающие это пространство. Использование сахарозы в качестве источника углерода и энергии зависит от ее расщепления на гексозы, и в растениях эту реакцию катализирует либо СС, либо инвертаза. СС - это гликозилтрансфераза, превращающая сахарозу в присутствии УДФ в УДФ-глюкозу и фру к юзу.
Инвертаза - это гидролаза, расщепляющая сахарозу на два моносхарида. Сахарозосинтаза - это цитоплазматический фермент, и у большинства растений были идентифицированы две близкородственные изоформы. Инвертаза существует в нескольких изоформах с различными биохимическими свойствами и внутриклеточной локализацией (Tymowska-Lalanne, Kreis, 1998).
Специфические функции различных изоформ инвертаз не ясны, но, по-видимому, они регулируют вступление сахарозы в различные пути использования. Поскольку сахара в растениях это не только питательные вещества, но также и важные регуляторы экспрессии генов (Koch, 1996), инвертазы могут быть косвенно вовлечены в контроль клеточной дифференцировки и развития растения. Главной функцией инвертазы является катализ гидролиза сахарозы. Известны другие минорные каталитические активности, например, опосредованный инвертазой гидролиз раффинозы, гидролиз и синтез фруктана (Pollock et al., 1999), или синтез сахарозы из раффинозы и глюкозы. Инвертаза присутствует в различных компартментах листа: в цитоплазме, вакуоли и в апопласте. Усиление активности любой из них приводит к использованию углерода сахарозы внутри самих ассимилирующих клеток, а также к накоплению крахмала и растворимых Сахаров.
Таким образом, эти, так называемые, кислые инвертазы являются (3-фруктофуранозидазами и также гидролизуют другие фруктозосодержащие олигосахариды. Кроме того, растения имеют по меньшей мере, две изоформы цитоплазматической инвертазы с оптимумами рН для расщепления сахарозы, лежащими в нейтральной или слабощелочной области. Нейтральные и щелочные инвертазы охарактеризованы в меньшей степени, но в отличие от кислых инвертаз, эти ферменты, по-видимому, являются специфичными к сахарозе.
Гексозы, а не сахароза накапливаются в вакуолях большинства растений (Heineke et al., 1996). Благодаря тому, что вакуоль является запасающей органеллои, возможно, что гидролиз сахарозы в вакуоли увеличивает интенсивность Сахаров в этом компартменте. У различных видов растений была показана загрузка сахарозы в вакуоль антипортером-транспортером сахарозы, и не требуется гидролиз сахарозы, чтобы позволить вакуолярную загрузку и разгрузку. Если вакуоль считается запасающим органом, тогда следует ожидать, что вакуолярная инвертаза осуществляет запасающую функцию. Например, растения томата, обладающие низкой инвертазной активностью в результате либо антисенсной трансформации, либо классической, имели сходные интенсивности роста плодов с контрольными растениями. В этом случае плод имел измененный состав Сахаров. Трансформированные томаты с низкой инвертазной активностью накапливают больше сахарозы, чем гексоз, и плоды слегка меньше, чем плоды контрольных растений. По-видимому, сахароза только накапливается в плоде томата в отсутствие высокой активности растворимой кислой инвертазы. Плоды L. pimpinellifolium имеют более высокую инвертазную активность, большее содержание гексоз и меньшее накопление са\арол і, чем плоды Л c.sculcnfum. Инвертазная активность присутствует даже в молодых зеленых плодах L. Pimpinellifolium. Характерные черты высокой инвертазной активности и высоких гексоз терялись у плода потомка, содержащего ген инвертазы L. pimpinellifolium, наводя на мысль, что посттранскрипционные контроли важны для определения общей инвертазной активности плода.
Первоначально предполагалось, что посредством распада сахарозы в апопласте под действием инвертазы снималась необходимость ее транспорта через мембрану флоэмных клеток против градиента концентрации (Курсанов, 1984). Непосредственно на мембранах были обнаружены переносчики гексоз, которые возвращаются в клетки мезофилла для повторного образования из них сахарозы. Это считается одним из механизмов поддержания оптимальной концентрации сахарозы в апопласте. Гидролиз сахарозы в вакуоли и межклеточном пространстве позволяет более эффективно запасать сахар в этих компартментах.
Введение раствора аммиакатов в апопласт побега льна-долгунца на фотосинтетическую ассимиляцию 14СОг
Транспортный продукт фотосинтеза (сахароза) в процессе транспортировки может частично гидролизоваться в апопласте до глюкозы и фруктозы (Чиков и др., 19986), а затем гексозы - используются потребляющими ассимиляты органами, вследствие чего было интересно выяснить особенности их утилизации. Как известно, взаимообратные превращения моносахаров и дисахаров происходят в апопласте. К нему, прежде всего, относят неодревесневшие целлюлозно-пектиновые стенки, построенные из более или менее сложенных фибрилл, между которыми остаются многочисленные, вытянутые параллельно волокнам, пустоты и ходы. По этим пространствам и может распространяться вода и растворенные в ней вещества, омывая внешний периметр клеток. Экспериментально это было подтверждено С. Штруггером (Strugger, 1938), который, используя технику люминесцентной микроскопии и флюоресцирующих красок, обнаружил, что транспирационный ток воды в листовой пластинке происходит в толще клеточных стенок. Именно поэтому, с целью выяснения дальнейшей метаболитной судьбы, меченая глюкоза вводилась с транспирационным током воды в растение с помощью специальной установки (рис. 6).
Исследование метаболизации 14С-глюкозы в различных тканях льна-долгунца проводили в период бутонизации. Аммиакаты (в концентрации 10"6 М) вводили в срезанный под водой побег льна-долгунца (высота растений 50-60 см) и закрепляли в специальном приспособлении, с помощью которого раствор можно было подавать под давлением 0,1 атм., равным обычному корневому давлению пасоки. Необходимый эквивалент корневого давления создавали воздушным компрессором. При этом избыток давления сбрасывался через моностат, погруженный в воду на глубину 100 см. Таким образом, создавалось постоянное давление подаваемого в растение раствора. В качестве контроля в побег вводили дистиллированную воду. После 40 мин поступления раствора в побег на верхнюю часть растения надевали фотосинтетическую камеру, в которую с помощью компрессора подавали из газгольдера 14СОг.
Нативные растения льна-долгунца опрыскивали раствором аммиакатов (10"6 М), а затем в срезанный побег вводили раствор 14С-меченой глюкозы. Через 2 часа растения фиксировали паром кипящей воды, с последующей досушкой при температуре 60С. Зафиксированные пробы анализировали на предмет включения 14С в различные соединения, разделяемые по растворимости.
Хроматографические исследования применяли для оценки распределения 14С среди низкомолекулярных продуктов фотосинтеза и веществ метаболизации меченой глюкозы. Для этого использовали фиксированные в 80% и растертые в 60% этаноле пробы. На стартовое пятно хроматограмм наносили объем вытяжки, соответствующий 50-150 тыс. имп/мин, для чего использовали хроматографическую бумагу FN-15 (Германия) размером 20x20 см. Для разделения водоспирторастворимой вытяжки на составляющие были, использовали две системы растворителей (Плешков, 1968). В первом направлении - бутанол : вода : муравьиная кислота в соотношении 75 : 12 : 13, а во втором направлении - насыщенный водой фенол. После разделения меченых соединений хроматограммы высушивали и экспонировали на рентгеновских пленках РМ-1, чувствительностью 300 единиц в обратных рентгенах.
Радиоактивность проб, так же как и пятен на хроматограммах, соответствующих меченым соединениям, определяли на сцинтиляционном счетчике "Дельта-300" (США). Сумму радиоактивности всех пятен на хроматограмме принимали за 100%, и определяли процентное содержание каждого соединения от суммарной радиоактивности всех пятен на хроматограмме.
Размолотый материал анализировали на содержание 14С в различных по растворимости фракциях веществ. Растертый порошок обрабатывали ацетоном (липиды, пигменты), затем водой (низкомолекулярные соединения), с последующим диализом через мембраны фирмы "Baxter" (США и Канада), пропускающими вещества с молекулярной массой менее 6000 кД. Оставшиеся в диализных мешочках водосолерастворимые белки экстрагировали 0.2 М раствором NaCl; спирторастворимые белки - 80%» этанолом; пектины растворяли в горячей (100%) воде; белки извлекали щелочью (0.1 М КОН) и тритоном Х-100. Оставшийся осадок обрабатывали амилазой для определения содержания метки в крахмале. Осадок, оставшийся после всех экстракций, оценивали как нерастворимые полисахариды, в основном целлюлоза (схема).
Влияние опрыскивания аммиакатами растений льна-долгунца на метаболизацию 14С экзогенной глюкозы, вводимый в побег через транспирационцый ток воды
Представленные выше данные опыта по введению раствора аммиакатов в апопласт побега льна-долгунца показали их существенное влияние на формирование первичных продуктов фотосинтеза. Поскольку сахароза в апопласте листа частично гидролизуется до глюкозы и фруктозы, которые затем транспортируются с водным током воды вверх (Чиков, Бакирова, 2004), то можно было ожидать, что их дальнейшая метаболизация также будет изменяться под воздействием обработок растений аммиакатами.
Обработка растений аммиакатами существенно повысила долю метки в низкомолекулярных веществах (табл. 3). Это позволяет предполагать, что экзогенная глюкоза в большей степени метаболизировала до сахарозы, чем использовалась в клетках мезофилла на синтез высокополимеров. К сожалению, недостаточно высокая радиоактивность не позволяла сделать хроматографический анализ низкомолекулярной фракции с целью установления содержания метки в сахарозе.
Среди высокомолекулярных веществ у опытных растений больше меченого углерода содержалось в белках и полисахаридах, которые локализованы (или синтезированны) внутри клетки. Под действием аммиакатов сильно подавлялся синтез полисахаридов растворимых в горячей воде (в основном пектины клеточной стенки), но больше 14С попадало из экзогенной глюкозы в крахмал. Эти два фактора очень влияли на распределение метки по другим соединениям (табл. 4).
Поэтому в таблице представлены данные в скобках о распределения С по отдельным соединениям без полисахаридов, растворимых в горячей воде. Хорошо видно, что по белкам различие между вариантами сохранилось только в группе растворимых белков. Однако, если учесть, что включение в саму группу полимерных соединений (табл. 3) под действием аммиакатов уменьшалось, то синтез этих соединений, по-видимому, не изменился в абсолютном значении, а наблюдаемые в таблице 3 различия, скорее всего, результат относительного изменения за счет снижения образования пектинов.
Возможно, на синтез полисахаридов влияет не сама глюкоза, а другие моносахара, образование которых менее связано со "скелетом" глюкозы. Сама же экзогенная глюкоза в обработанных аммиакатами растениях больше используется на синтез крахмала. Это значит, что она успешно попадает в фотосинтетическое русло углерода и в хлоропласте включается в сахарозу и крахмал.
Как было показано в работе В.И. Чикова с соавторами (20056), вводимая таким способом меченая экзогенная глюкоза в листе присоединяется в обычное фотосинтетическое русло метаболизма углерода с образованием основного транспортного соединения фотосинтеза - сахарозы. Действие обработки аммиакатами в общих чертах напоминает влияние света на метаболизацию глюкозы. Для метаболизации глюкозы до сахарозы необходимы ферменты и наличие АТФ.
В соответствии с гипотезой о неспецифических изменениях фотосинтетического метаболизма углерода (Тарчевский, 1964, 1965), возникающий в хлоропластах под действием неблагоприятных факторов дефицит АТФ должен затруднить протекание реакций, требующих затрат АТФ, таких как: регенерация акцептора СОг (при этом снижается интенсивность фотосинтеза), восстановление ФГК в фосфоглицериновый альдегид (повышает вероятность использования 14С-ФКГ в конкурентной реакции образования ФЕП, последний при переаминировании может образовывать аланин), образование сахарозы из фосфогексоз (неиспользованные в данной реакции фосфаты Сахаров могут метаболизироваться в крахмал и свободные гексозы), образование белков из свободных аминокислот. В результате дальнейших исследований внутренних причин изменений фотосинтетического метаболизма СОг при действии неблагоприятных факторов был сделан вывод об усилении в этих условиях взаимосвязи фотосинтеза и дыхания (Тарчевский, 1975, 1982).
Известно, что загрузка сахарозы во флоэму листа - энергозависимый процесс и проходит в контранспорте с протоном. Протонные помпы уравновешивают этот процесс, закачивая ЇҐ обратно в апопласт. Другими словами, рН среды характеризует энергетику листа. По данным П. Хилла с сотрудниками (Hill et al., 2002), рН апопласта у молодых листьев с пониженной экспортной функцией более кислая, чем у зрелых. На основании этих данных можно заключить, что для того, чтобы ассимиляты не экспортировались, а расходовались на собственные синтетические нужды, в апопластной среде листа рН должна быть пониженной. Такое заключение согласуется с данными, что апопластная инвертаза имеет оптимум активности в кислой области рН (Бровченко, 1967, 1970).
В монографии В.И. Чикова (1987) отмечено, что изменение рН в кислую или щелочную область вызывает явно противоположное действие на накопление ассимилятов в свободном пространстве. Из вышесказанного можно сделать вывод, что рН апопласта листьев и энергетика листа тесно взаимосвязаны с накоплением ассимилятов в апопласте и, следовательно, влияют на распределение ассимилятов в растении.
По мнению У. Хебера с соавторами (2002), просто манипулируя концентрациями соединений (следовательно, и рН) в апопласте, можно превратить взрослый лист, который принято рассматривать как донор, в акцепторный орган. Очевидно, что связь между концентрациями соединения в апопласте и симпласте определяется не только транспортными белками, активность которых можно регулировать, но и протонодвижущей силой (ПДС). Это ясно из деполяризации плазматической мембраны и подщелачивания апопласта. Эти изменения уменьшают значение ПДС. Восстановление ПДС происходит за счет гидролиза АТФ АТФ-азой плазматической мембраны, которая транслоцирует протоны в апопласт. Потребление цитозольной АТФ активирует дыхательный процесс производства АТФ.
В настоящее время накапливается все больше данных о том, что гексокиназы могут функционировать как ключевой сенсор и сигнальный переносчик (Graham et al., 1994; Jang, Sheen, 1994; Pego et al., 1999). Показано также (Dal et al., 1999), что усиленная экспрессия гексокиназного гена уменьшает содержание хлорофилла в листьях, скорость фотосинтеза, фотохимическую квантовую эффективность реакционного центра фотосистемы 2 по сравнению с растениями с нормальным содержанием названного гена. Гексокиназы в высших растениях могут быть локализованы в разных тканях (цитозоле, пластидах и митохондриях). Предполагают, что они функционируют как бифункциональные ферменты с каталитической и сенсорной активностью (Miernyk, Dennis, 1983; Schnarrenberger, 1990; Renz et al., 1993; Galina et al., 1999). Однако, точный механизм, в котором гексокиназы осуществляют сенсорную роль, остается до сих пор неизвестным.
Одним из главных пунктов, позволяющих со вниманием отнестись к предположительной регуляторной роли гексокиназ, является то, что, фосфорилируясь, сахара становятся более доступными для вовлечения в разного рода метаболические процессы. Широкое распространение названных ферментов по органеллам клетки оправдывает повсеместный контроль над активностью гексоз в клетках, в том числе и фотосинтезирующих (Курсанов, 1984).
