Введение к работе
Актуальность проблемы. Увеличение производства растительного белка и повышение его качества является одной из наиболее важных проблем нашего времени, что особенно подчеркивается в решениях XXV съезда КПСС, а также последующих пленумов ЦК КПСС по вопросам сельского хозяйства.
Успешное решение проблемы увеличения производства кормового белка имеет первостепенное значение для дальнейшего развития животноводства. В решениях партии и правительства большая роль в создании прочной кормовой базы для животноводства: отводится кукурузе, которая является одной из основных зернофуражных, культур. Однако по содержанию белка {9—12%) кукуруза значительно уступает зернобобовым и многим зерновым культурам. Кроме того, белки данной культуры имеют низкую биологическую ценность из-за невысокого содержания лизина, метионина, триптофана.
С открытием биохимического действия мутантлых генов опейк-2 и флаурн-2 (Mertz Е. Т. et-al., 1964; Nelson О* Е, et аЦ 1965) в селекционной работе с кукурузой определилось.новое направление, связанное с увеличением содержания и улучшением качественного состава белков этой культуры. Успехи селекции в этой области выдвинули задачу глубокого изучения тех изменений, которые происходят при введении гена опейк-2 в генотипы обычной кукурузы. Закономерности формирования и накопления азотистых соединений в белковом комплексе эндосперма зерна кукурузы под влиянием гена опейк-2 изучены недостаточно и их исследование позволит вести направленный отбор гибридных форм кукурузы на основе данной мутации по биохимическим показателям — аминокислотному составу, содержанию и составу отдельных белковых фракций.
Одним из главных факторов повышения продуктивности сельскохозяйственных растений являются удобрения. Данные о влиянии удобрений на содержание и качество белка кукурузы нового типа практически отсутствуют. Изучение этих вопро-
Повйахл ча. ics=a сек» ,*эдги і*, ц, д. ^;
сов явится весьма важным и актуальным для дальнейшего использования высоколизиновой кукурузы в производстве.
Цель н задачи исследований. Исследования проводились с целью получения более полных теоретических представлений об особенностях" проявления действия гена опейк-2 в различных генотипах кукурузы, .характере изменений в белковом ком^ плексе эндосперма зерна, что необходимо для успешного использования источников гена опейк-2 в селекционной работе. В задачу наших исследований входило изучение следующих вопросов:
.— содержание азотистых соединений в эндосперме зерна обычной кукурузьіін.ее опейк-2 аналога в!процессе, созревания;
компонентный и аминокислотный состав белкового комплекса эндосперма;зерна обычнойкукурузы л ее опенк-2-ана-лога:в процессе'созревания;
влияние:различных условий минерального питания на содержание и качество белков эндосперма зерна обычной,ку-
. курузыи ее опейк-2 аналога.
Научная:новизна:работы. Научная новизна и значимость работы заключается втом, что впервые дана детальная-биохимическая характеристика изменения содержания и качественного состава азотистых соединении в белковом комплексе эн*досперма зерна различных гибридов кукурузы в процессе созревания под влиянием гена опейк-2.
Установлено, что при внесении разлнчныхдоз минеральных
удобрений н повышении содержания белка генотипические
различия во фракционном и аминокислотном составе белков
эндосперма зерна.обычного гибрида и его опейк^2 аналогаста-
бнльно сохраняются. -# .
С помощью гель-хроматографиижасефадексей-100"впервые'показа но, что. в легкорастворимых белках опейк-2 аналога наибольшее количество лизина содержится во фракции с мо-лскулярноймассой около 24 тыс., а у обычного гибрида—во фракции с молекулярной массой около 45 тыс. Кроме того, введение генаопейк-2 в генотип обычной:кукуруэы обуславливает синтез белковых фракций в легкорастворнмых белках; близ-1 кнх по молекулярной массе к белкам обычной кукурузы, но отличающихся от таковых, по электрофорешческнм свойствам: н аминокислотному составу.
Практическая ценность. Результаты исследований могут служить для дальнейшего-перспективного н целенаправленного использования источников гена опейк-2в'селекцинкукуру-' зы при создании сортов, гибридов'и линий кукурузы, сочетающих высокую урожайность и другие хозяйственные признаки с повышенным содержанием белков в зерне и лизина1 в-белках. Апробация работы. Материалы диссертации . доложены на >
научных конференциях ТСХА в 1974 и 1978 годах, а также на Всесоюзном симпозиуме по азотному и белковому обмену растении в г, Тбилиси в 1978 году.
Объем работы. Диссертация изложенана 156 страницах машинописного текста, включает 37 таблиц и 17 рисунков. Вспомогательный материал представлен в 19 приложениях. Список использованной литературы состоит из 290 наименований, в том числе 141 иностранное.
Объекты ti методы исследований. При изучении влияния
гена опейк-2 на состав и свойства белков эндосперма зёрна
кукурузы в процессе созревания в качестве объекта было взято
зерно среднеспелого двойного межлинейного гибрида кукурузы
Кубанской опытной станции ВИРа — ВИР 42 +/+, средне-
позднего двойного межлннейного гибрмда кукурузы
КНИИСХ—Краснодарский 309 +/+, а также зерно их.
опейк-2 аналогов — ВИР 42 6j/o2 и Краснодарский 309 o«/oj,
выращенных в селекционном питомнике КНИИСХ в одинако
вых почвенно-кл им этических условиях в 1971—1972 гг. Пробы
зёрна брали через 15; 20, 25, 30; 35 и 40 дней после опыления,
а также в фазу полной спелости, фиксировали жидким азотом,
отделяли зерно от початка и лиофнльно высушивали. Зерно;
после лиофнлизацнн запаивали в стеклянные ампулы без воз-'
духа и хранили в холодильнике, - .
Для изучения влияния различного уровня минерального питания на содержание и качество запасных белков зерна кукурузы использовали зерно двойного межлннейного гибрида Краснодарский 303 +/+ и его опейк-2 аналога — Краснодарский 303 о^ог с полевого опыта КНИИСХ, заложенного по схеме: без внесения удобрений — контроль; а использованием ограниченных доз удобрений NeoPeoKeo и при применении минеральных удобрений в оптимальных количествах (согласно данным КНИИСХ)—N150P530K110. Азот в форме аммиачной селитры вносился под предпосевную культивацию, фосфор И' калий в форме гранулированного суперфосфата и хлористого калия — осенью под вспашку. Почвы опыта — западно-пред-кавказский выщелоченный чернозем. Содержание подвижного фосфора—12—14 мг, обменного калия — 25—27 мг на 100 г почвы. Сумма поглощенных оснований 48 мгэкв на 100 г сухой почвы. Содержание гумуса в пахотном горизонте 3,7—4,3%, валовое содержание азота 0,22—0,33%. Пахотный и подпахотный слон этих почв имеют нейтральную реакцию (рН 6,8), Площадь опытной делянки 60 ма, учетной — 40 м5. Повторность опыта 4-кратная. Сроки посева и уборка кукурузы,, а также агротехника возделывания общепринятая для хозяйства КНИИСХ.
В* связи с тем; чтоизучали влияние* гена оиейк-2 на бел ко-
вый комплекс эндосперма зерна кукурузы, зародыш отделяли ог эндосперма. Эндосперм измельчали на мельнице, муку просеивали через сито с ячейками 0,2 мм и обезжиривали петролейним эфиром.
Обший азот определяли мнкрометодом Кьелъдаля, белковый и небелковый азот — по Барнштейну. Для пересчета.азота на белок использовали коэффициент 6,25. Фракционирование, белкоп проводили по Осборну (Osborn Т., 1892). Суммарные белки извлекали по методике, описанной Б. П. Пдешковым (1968). При изучении компонентного состава водорастворимых и солераетворимых белков использовали метод дискового вертикального электрофореза в поли акрила ми дном геле (Raymond S: et al„. 1959; Davis В. J„ І962) с некоторыми изменениями (Сафонов В. И„ Сафонова .М. П., 1969)-. Разделе^ ние проводили как в щелочных, так ив кислых буферных системах (ReisfeW R. Л. et al., 1962). Электрофорез зеина проводили и 7,5%-ном полнакриламидном геле в кислой буферной системе (Catstmpoolas N, et al.. 1968; Коиарев В: Г. и др., 1969; Гаврнлюк И. П. и др., 1973). Препараты суммарных белков, альбуминов и глобулинов получали по методике, описанной Б, П. Пдешковым (1968); препараты зеина— по методике, предложенной Конарепым В. Г, и др. (1969) и Раврилюк И. П. и др. (1973), Гидролиз белков проводили 6н НО'при ЮБ'С п течение 24 часов в запаянных ампулах. Параллельно в препаратах белков определяли общий азот по микрометоду- Кьель-даля. Содержание аминокислот в гидролизатах белков определяли на анализаторе МД-І200Е: Триптофан в суммарных белках определяли отдельно (Плешков Б. П., 1968); Гель-хро-. матографню легкорастворимых белков в 0,005 М фосфатном буфере (рН7,4) проводили на сверхтонком сефадексе G-100, используя колонку размером 2,5Х 120 см при t 2—4С. При набивке колонки, а также се градуировке использовали методы Флоднна (Flodin Р., 1962). Болотиной Т. Т. (1968), Кочетова Г. Л. (1971). Элюирующнм раствором служил .0,5 М NaCI; п 0,005 М фосфатном буфере (рН 7,4), скорость элюции составляла 10 мл/час. В отдельных хроматографических фракциях определяли компонентный и аминокислотный состав бел-. ков по методикам, описанным выше.
Цифровой материал по массе зерна и аминокислотному составу суммарных белкоп эндосперма зерна кукурузы разных генотипов был обработан статистически с использованием ме*. тода. дисперсионного анализа по программе на ЭВМ: «Мннск-22». Биологическую ценность суммарных белков определяли расчетным методом но аминокислотному составу в сравнении с белками куриного яйца (Korpaszy J. et al„ I960), -4